开环异落叶松树脂酚对乳腺癌MCF_7细胞增殖的影响

营养学报2008年第30卷第5期 495开环异落叶松树脂酚对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响张文斌，王 璋，杨瑞金1，卢蓉蓉，许时婴1（江南大学食品学院,无锡 214122；1江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122）【摘 要】目的 研究开环异落叶松树脂酚（SECO）及其代谢产物肠内酯（ENL）、肠二醇（END）对人乳腺癌MCF-7细胞株增殖的影响，揭示其可能的作用机制。

方法 采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法测定SECO、END与ENL对MCF-7细胞增殖的影响，并与染料木黄酮（GEN）进行对比。

采用光学显微镜与流式细胞仪（FCM）检测了MCF-7细胞生长过程中受到的影响，分析了SECO抗乳腺癌的作用机制。

结果 低浓度SECO对MCF-7细胞增殖起促进作用，高浓度SECO对MCF-7细胞增殖起明显的抑制作用；呈现G2/M期阻滞。

光学显微镜观察到细胞凋亡的形态。

ENL与END则在不同浓度下均表现出抑制作用。

结论 SECO对MCF-7细胞的增殖具有浓度依赖效应，其抑制MCF-7细胞增殖作用可能与其代谢产物有关。

[营养学报，2008，30（5）：495－498]关键词：亚麻木酚素；开环异落叶松树脂酚；乳腺癌细胞；增殖；凋亡中图分类号：Q74.1 文献标识码：A文章编号：0512-7955（2008）05-0495-04EFFECTS OF SECOISOLARICIRESINOL ON PROLIFERATION OFBREAST CANCER MCF-7 CELLSZHANG Wen-bin, WANG Zhang, YANG Rui-jin1, LU Rong-rong, XU Shi-ying1 (School of Food Science and Technology; 1State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 【Abstract】Objective To observe the effects of secoisolariciresinol (SECO) and its metabolites, enterolactone (ENL) and enterodiol (END), on proliferation of MCF-7 cell line and to the probable mechanism. Method Effect of SECO, END, ENL and genistein (GEN) on MCF-7 proliferation was investigated by MTT assay. Cell cycle arrest was measured by flow cytometry (FCM). Cell morphology was observed by optical microscope. The anticarcinogenic mechanism of SECO was analyzed. Results SECO had promotive effect on the cell growth at lower concentration (≤40 µmol/L) but inhibition effect at higher concentration (100 µmol/L). ENL and END, however, showed significant inhibition effect at all tested concentrations (10~100µmol/L). The cell cycle progression was arrested at G2/M phase and apoptosis was observed by optical microscope. Conclusion Effect of SECO on the MCF-7 cell proliferation depends on its concentration. Inhibition effect of SECO may relate to its metabolites ENL or END. [ACTA NUTRIMENTA SINICA, 2008, 30（5）:485－498]Key words: flax lignan; secoisolariciresinol; MCF-7 cells; proliferation; apoptosis乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，利用植物雌激素来预防和治疗乳腺癌，有助于克服它莫西芬（TAM）等药物产生的抗药性和引发的伴随绝经期症状[1]。

亚麻籽中富含的木酚素——开环异落叶松树脂酚（SECO）天然、无副作用，受到研究者的特别关注[2]。

目前，研究者对SECO的抗乳腺收稿日期2008-01-25作者简介张文斌（1979－），男，博士，讲师，E-mail: wbzhang@；通讯作者：许时婴，E-mail: syxu@ DOI:10.13325/ki.acta.nutr.sin.2008.05.025496Acta Nutrimenta Sinica,Oct.,2008, V ol.30 No.5癌作用开展了很多流行病学调查和动物实验研究，提出一些可能的作用机制，如类雌激素和抗雌激素作用、诱导癌细胞分化、抑制血管新生、抗氧化作用、抑制酪胺酸激活酶和DNA拓扑异构酶的活力等[3-7]。

但SECO是否通过抑制癌细胞生长来发挥抗乳腺癌作用，SECO在人体内的代谢产物肠内酯（ENL）和肠二醇（END）发挥什么作用，目前尚无肯定结论。

1 材 料 与 方 法1.1 材料亚麻木酚素SECO为本实验室自制，经HPLC 检测纯度93%以上[8]。

GEN（染料木黄酮）、ENL、END、胰蛋白酶、MTT和碘化丙啶(PI,Sigma公司)，R/MINI 1640培养基及小牛血清(Gibco公司)。

青霉素、链霉素(美国Amresco公司)。

胰岛素（400 U/10 ml）(江苏万邦生化医药公司)。

其它试剂均为分析纯。

SECO（C20H26O6）、END（C18H22O4）、ENL（C18H18O4）与GEN（C15H10O5）均在使用前以无水乙醇溶解，双蒸水稀释（至乙醇浓度10%，v/v），配制成浓度20 mmol/L的工作液。

用前用培养基稀释，后加入培养液中，乙醇在培养液中终浓度为0.1%。

细胞培养箱（Thermo Forma公司）；MK3酶标仪（Thermo Labsystems Multiskan 公司）；EPICS XL流式细胞仪（美国Coulter公司）。

1.2 细胞株及其培养乳腺癌细胞MCF-7由江南大学生物工程学院细胞与分子药理学研究室保存并惠赠。

复苏后的细胞在24 h后将几乎全部贴壁，将培养的细胞从一个容器以1:2或其他比率转移到别的容器中进行扩大培养，取对数生长期细胞进行实验，实验前于倒置显微镜下观察MCF-7细胞形态。

1.3 细胞生长抑制实验按参考文献[9,10]，将处于对数生长期的MCF-7细胞，制成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板，103～104个细胞/孔，每孔培养基总量为200 µl，在37℃、5%（v/v，下同）CO2培养箱中培养一段时间，待细胞贴壁生长后加入SECO、END、ENL 和GEN样品至培养液中终浓度分别为10、20、40和100 µmol/L，每个浓度重复4孔。

培养24、48和72 h后检测。

吸出孔内培养液，用PBS液将培养板洗两遍，将MTT染液加入培养板（50 µl/孔），继续培养4 h。

吸出孔内MTT液，加入DMSO （150 µl/孔），在37 °C培养箱中放置10 min，使结晶物溶解。

在酶标仪上检测各孔OD值（λ= 570 nm）。

记录结果，根据存活率（%）=（实验组OD/对照组OD）×100，计算各组存活率。

1.4 细胞形态的观察按常规方法将细胞接种于50 ml细胞培养瓶中，放在37°C、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后分别加入100 µmol/L的SECO、40 µmol/L 的END、ENL和GEN样品，作用72 h，在倒置显微镜下用数码相机拍摄细胞形态，观察经过不同样品作用72 h后MCF-7细胞形态发生的变化。

1.5 流式细胞仪（FCM）检测木酚素对MCF-7细胞周期的影响按参考文献[11,12]，使用0.25%胰酶分别对 40 µmol/L的END、ENL、GEN和100 µmol/L的SECO处理后的细胞进行消化，分别制成单细胞悬液，分别收集1×106个乳腺癌细胞，1000 r/min 离心5 min，弃去培养液。

用3 ml PBS洗1次。

离心去除PBS，加入冰预冷的75%的乙醇固定，置4 ℃下，1h。

离心，弃去固定液，用 3 ml PBS 重悬5 min。

1000 r/min离心5 min，弃去PBS。

用l ml PI染液染色，至4℃避光处理30 min。

用氢离子激发荧光，激发波长为488 nm，发射波长大于630 nm，产生红色荧光，分析PI荧光强度的直方图和前散射光对侧散射光的散点图，根据DNA含量直方图计算增殖指数PI （proliferation index,%）=[(S+G2/M)/ (G0/G1+ G2/M)]×100[12]。

1.6 数据处理用SPSS 15.0进行方差分析和Dunnett t检验组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果2.1 亚麻木酚素对乳腺癌MCF-7存活率的影响用不同浓度的SECO、END、ENL和GEN对MCF-7作用不同时间后，其存活率受到不同的影响（表1）。

在低浓度（10～20 µmol/L）下，SECO对乳腺癌细胞MCF-7的增殖未表现出显著的增殖作用，在40 µmol/L时，SECO不仅没有抑制作用，反而表现出微弱的增殖MCF-7作用（48 h和72 h）。

营养学报2008年第30卷第5期 497当浓度提高至100 µmol/L 后，SECO 对MCF-7增殖表现出显著的抑制作用，并呈时间-效应关系。

GEN 表现出与SECO 类似的效应，但在10～ 40 µmol/L 范围内，GEN 仅在20 µmol/L 时表现出显著的增殖作用；当GEN 浓度从40 µmol/L 提高到100 µmol/L 时，GEN 对MCF-7表现出高度显著的抑制作用，但没有体现出时间-效应关系。