小鼠睾丸支持细胞分离培养

小鼠睾丸支持细胞分离培养

一、材料和器械：

1、材料：小白鼠（18~ 20 日龄）1只

2、配液：

PBS 1L，高压灭菌

细胞洗液：DMEM+双抗

消化液：0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，0 1%( 质量分数) 胶原酶

细胞培养液：DMEM+10%FBS+双抗

3、器械：

镊子、手术剪、手术刀各3-4把，高压灭菌

500mL烧杯2个，高压灭菌

25 mL离心管、5 mL离心管各20个，高压灭菌

酒精棉一瓶

细胞培养皿若干

冰块若干

二、操作步骤：

1、处死小鼠颈椎脱臼法处死；

2、消毒置于含75% ( 体积分数) 乙醇平皿中浸泡2 min, 然后置于超净台上；

3、取睾丸用中剪剪开下腹部皮肤, 眼科剪从下腹部附睾部剪断精索, 取出双侧睾丸, 放入含预冷细胞洗液的培养皿中；

4、取实质修剪睾丸附带的精索。剥除睾丸被膜, 将睾丸实质剪成约1 mm 1 mm 1 mm 碎块, 静置3~ 4 min；

5、消化转入25mL 离心管中。吸出上层细胞洗液, 每只睾丸加入1 5mL 37 预温的0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，37 高速振荡消化15~ 20min, 直到残存的间质消化成粘液状, 可见成片断的曲细精管；

6、终止消化加入入少许血清终止消化,；

7、离心1000 r/ min离心5 min, 倾去上层胰酶。加入DMEM/ F12 培养基重悬, 1000r/min 离心5min。倾去上层培养液；

8、再消化每只睾丸加入1 mL 37 预温的0 1%( 质量分数) 胶原酶, 37 低速

缓慢振荡消化20~ 25min；

9、铜网过滤取滤液800 r/ min 离心5min, 2 次去除胶原酶, 用培养液洗涤；

10、接种往离心管加入细胞培养液5ml左右，吹打均匀，接种到两个30细胞培养皿中，补加培养液到培养皿1/3~1/2,培养皿标记显微观察后放入36CO2培养箱培养。

三、换液纯化，计数结果鉴定