第五章 体内药物分析

（4）固相萃取法的特点
当采用亲脂性键合硅胶SPE时 • 方便、省时 • 通常可以用小体积的甲醇、乙腈等洗脱剂（200~300μl）
完全洗脱药物，净化并浓集样品 • 不需蒸干即可直接进样
（5）自动化固相萃取法
• 对于单个样品处理， SPE操作省时 • 对于大量样品的处理
➢ 半自动SPE： 萃取过程机械化 ➢ 全自动化仪器： 通过柱切换技术实现固相萃取与
• 静脉， 0.2～5ml，≤15%~20%动物总血量
2. 血浆的制备 • 抗凝剂，1000g离心5～10分钟，淡黄色上清液 50%～60％
3. 血清的制备
• 30分钟～1小时，1000g离心，5～10分钟，上层淡
Байду номын сангаас黄色液体
20%～40％
4. 全血的制备
• 抗凝剂， 不离心
尿样
1. 尿样的特点 • 原形或代谢物 • 药物浓度较高 • 收集量大（1~5L） 2. 尿样的采集 • 自然排尿 • 规定时间段（6～8小时）（时间尿） 3. 尿样的储存 • 加入适当防腐剂
• 测定尿药总量、水解缀合物或Ⅱ相代谢产物 • 趋向于直接测定缀合物
• 简便， 快速 • 水解过程中发
生药物分解 • 专一性较差
1. 酸水解法
• 葡萄糖醛酸苷酶或 （和）硫酸酯酶
• 专属性强 • 时间较长 • 可引入黏蛋白
2. 酶水解法
• 溶剂萃取过程 中缀合物（尤 其硫酸酯）直 接分解
3.溶剂解法
（二）去活性
• 采样后立即终止酶的活性 • 常用方法：液氮速冻， 微波照射， 匀浆及沉淀， 加
酶活性阻断剂（氟化钠）或抗氧剂（维生素C），调 节pH及样品煮沸
去活性：酶活性阻断剂
哌唑嗪、敌敌畏 噻吩甲酰三氟丙酮
羧酸 酯酶
• 酯酶是普遍存在于全血、 血浆和血清中的一类水 解酶，能够水解结构中 含有酯键的药物
二乙异丙嗪
丁酰胆 碱酯酶
酯酶抑制剂，可 以有效防止药物在 酯酶的作用下发生
降解
乙酰胆 碱酯酶
敌敌畏
5,5′-二硫代双
（2-硝基苯甲酸）
芳香基 酯酶
磷酸二 酯酶
氟化钠 氟化钾
去活性：调节pH
调节pH有效 避免化合物发 生降解或者分
子内转化
酯类 酰胺类 内酰胺类 内酯类
葡糖苷酸类
• 甲酸、醋酸、磷酸、枸橼酸或者缓冲盐溶液
三、体内样品的储存与处理
（一）冷藏与冷冻
• 短期保存： 冰箱（4℃）冷藏 • 长期保存： 冷柜（-20℃/-70~-80℃）冷冻， 小体积分装 1. 血浆/血清 • 分离（2小时）， 硬质玻璃/聚乙烯管（EP）， 冷冻 2. 尿样 • 冷藏（24~36小时）加防腐剂 3. 唾液 • 冷冻保存时， 解冻后充分搅匀后再用
HPLC联用
柱（切5）换自：动固化相固萃相取萃-L取C法/MS/MS
3. 超滤法
• ultrafiltration是一种膜分离技术 • 按照截留分子量，选择半透膜，可分离30 ~1000kD
的可溶性生物大分子 • 无化学试剂，无相变化
• 简便， 游离药物分析的首选方法； 尤其适合TDM
（三）缀合物水解法
第一节 常用体内样品的制备与储存
1 体内样品的种类 2 体内样品的采集与制备 3 体内样品的储存与处理
一、体内样品的种类
体液
血液、唾液
脑脊液、胃液、 胆汁、乳汁、 精液、泪液
组织
胃、肠、肝、 肾、肺、脑、 肌肉、头发
排泄物
尿液
粪便、 汗液
二、体内样品的采集与制备
常见体内样品
血样
1. 血样的采集
• 样品处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作
1 体内样品处理的目的
2 常用体内样品处理方法
一、体内样品处理的目的
1. 使待测 组分游离
3. 改善分 析环境
仪器污染，劣化（去蛋白） 提高测定灵敏度/选择性 化学改性（衍生化）
样品 处理
血浆蛋白结合物、缀合物 使待测药物/代谢物释放测定药 物/代谢物总浓度
药物分析
第五章 体内药物分析
1 常用体内样品的制备与贮藏 2 体内样品分析的处理 3 体内样品分析方法与方法验证 4 典型体内药物分析应用
掌握： 体内药物分析的特点和应用 体内样品处理 体内样品分析方法验证的内容
熟悉： 体内样品的采集与制备方法 体内样品分析方法验证的技术要求
了解： 体内药物分析的性质与意义
1）辅助试剂的使用 • 乙醚萃取可混入约1.2%水： 加入固体氯化钠 2）混合溶剂的使用 • 正己烷-异丙醇（95 ︰ 5）
溶剂
紫外截止波长（nm） 沸点（℃）
正己烷
210
69
环己烷
210
81
甲苯
↓ 极
异丙醚*
性 乙醚*
285
111
220
68
220
35
增 乙酸戊酯
285
149
加 三氯甲烷
245
乙酰脯氨酰氯（ST-FPC）
2. 在HPLC中的应用 （1）衍生化的分类
• 柱前/柱后；在线/离线 （2）衍生化方法
1）紫外衍生化 2）荧光衍生化 3）质谱检测衍生化 4）非对映体衍生化
第三节 体内样品分析方法
与方法验证
一、分析方法的建立 二、分析方法的验证
一、分析方法的建立
（一） 分析方法的选择 （二） 分析方法建立的一般程序
2. 满足测 定方法的 要求
样品介质组成复杂： 分离 待测组分浓度低： 浓集
二、常用体内样品处理方法
（一） 蛋白沉淀法 （二） 分离与浓集法 （三） 缀合物水解法 （四） 化学衍生化法
（一）去除蛋白质法
• 加入与水混溶的有机溶 剂， 蛋白析出，药物 释放
• 乙腈、甲醇、丙酮、四 氢呋喃等
• 血浆/血清与有机溶剂 的体积比1∶（2～3）
提取； • 多在碱性下提取， 可减少内源性物质（酸性）的
干扰 • 碱性下不稳定， 在中性用三氯甲烷和异丙醇提取
（4）提取操作
• 一般只提取1次 • 若提取回收率较低（低于50%）， 提取2~3次 • 脂溶性干扰物， 可进行小体积水溶液反提取
2. 固相萃取法 （1） 固相萃取法的原理 （2） 固相萃取法操作步骤 （3） 注意事项 （4） 固相萃取法的特点 （5） 自动化固相萃取
（2）固相萃取法操作步骤
• 第1步： 甲醇润湿小柱， 活
化填料； 净化填料
• 第2步： 水/缓冲液冲洗小柱，
去除甲醇； 甲醇含量过低
（低于5%）致C18链弯曲折
叠， 回收率降低
, 平衡
• 第3步： 加样， 使样品通过
小柱， 并弃去滤过液
• 第4步： 水/缓冲液冲洗 小柱， 去除内源性及其 他干扰物质
体内药物分析 分析方法 样品制备 存在形式
体内样品
概述
生物分析
方法建立 • 色谱、免疫分析、生物 与验证 • 完整、部分和交叉验证
• 蛋白沉淀、萃取、膜分离
净化与浓集
•
水解、化学衍生化
原形、代 • 原形药物或其代谢物
谢物
• 缀合物、蛋白结合物
体液或组织
• •
血液是最常用样品 尿• 液4 、唾液、头发和脏器
61
↓
甲基异丁基酮
230
116
乙酸乙酯
260
77
正丁醇
215
118
*：含过氧化物；：肝脏毒性， 有致癌作用
（2）溶剂的用量 • 有机相与水相（样品）体积比为1︰1~5︰1
（3）水相的pH
• 碱性药物pH高于pKa 1~2pH单位 • 酸性药物pH低于pKa 1~2pH单位 • 碱性药物在碱性pH，酸性药物在酸性pH基质中
1. 溶剂沉淀法
• 饱和硫酸铵、硫酸钠、 硫酸镁、氯化钠等
• 血清与饱和硫酸铵溶液 的体积比为1∶2
2. 中性盐析法
• 10%三氯醋酸或6%高氯 酸溶液
• 血清与强酸的体积比 1∶0.6
• 上清液呈强酸性（pH≤4） • 酸性下分解的药物不宜用
3. 强酸沉淀法
• 热变性蛋白质沉淀 • 通常90℃ • 方法简单 • 只能除去热变性蛋白 • 待测物热稳定性良好
去活性：抗氧化剂
• 含有酚羟基结 构的药物在生 物基质或样品 处理过程易发 生自身氧化
• 使用抗氧化剂 为常用的方法
测定利福平时加入 0.5% w/v的维生素C
测定左旋多巴及其代谢产物时加入焦 亚硫酸钠和乙二胺四乙酸（EDTA）
第二节 体内样品处理
分析方法与样品处理步骤的选择
• 样品处理（分离、浓集、改性）为药物的测定创造良好 条件
（一）选择性
• 选择性 （selectivity），体内样品所含其他物质不得 干扰对样品的测定或者其干扰在分析方法的可接受范 围内。
1.内源性物质
• 比较待测物的对照标准 物质与6个不同个体的空 白生物基质和QC样品
• 软电离质谱（LC-MS或 LC-MS/MS）基质效应
2.未知代谢物
• 比较QC样品和至少6个不 同个体用药后的试验样品
• 第5步： 洗脱溶剂洗脱 待测物， 收集洗脱液
, 平衡
（3）注意事项
1）体液样品（如血浆等）通过萃取柱的流速在1～ 2ml/min；
2）冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当，否则导致药物损 失/选择性下降，通常选用可与水混溶的洗脱剂；
3）萃取碱性药物时， 洗脱剂中常加酸、有机胺、氨水、 醋酸铵或离子对试剂
（二）分析方法建立的一般程序
• 分析方法的建立和验证过程系同步进行 • 为便于讨论， 以色谱分析法为例分别叙述
1. 色谱条件 的筛选
• 待测物、内标（必要时）的对照 标准物
• 色谱柱（填料）、流动相、流速、 进样量
2. 色谱条件 的优化
• 试剂与溶剂试验 • 生物基质试验 • 质控样品试验
3. 试验样品 的测试
• 代谢产物对待测物、内标物的干扰 • 配伍用药的干扰
二、分析方法的验证
（一） 选择性 （二） 标准曲线与定量范围 （三） 定量下限 （四） 精密度与准确度 （五） 样品稳定性 （六） 提取回收率 （七） 基质效应
（八） 试验样品分析 （九） 试验样品浓度超出定量范围的处理 （十） 作为外源性药物使用的内源性物质的测定 （十一）微生物/免疫学方法的验证 （十二）名词解释
（1）固相萃取法的原理
• 含药物体内样品通过小柱时， 受到 “吸附”、“分 配”、“离子交换”或其他亲和力作用， 药物及内源性 物质同时被保留在固定相（填料）上
• 洗脱方式有两种： ①药物比干扰物质与固定相之间的亲 和力更强：冲洗溶剂洗去干扰物时药物被保留， 然后再 用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物； ②干扰物质较药 物与固定相之间的亲和力更强：药物直接被洗脱， 干扰 物被保留
特点
体内药物分析的特点 主要来自于体内样品的特点
1. 体内样品的特点 （1）采样量少： ml~µl级； 且不易重新获得 （2）待测物浓度低：µg/ml ~ng/ml级， 甚至pg/ml （3）干扰物质多： 尤其是血样和组织中的蛋白质
2. 体内药物分析的特点 （1）样品需经分离与浓集， 或化学衍生化处理 （2）对分析方法的灵敏度及选择性要求较高 （3）分析工作量大， 数据处理和结果阐明繁杂
（一）分析方法的选择
• 常用的检测方法： 色谱分析法、免疫分析法和生物学 方法
• HPLC， GC • LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS • 内源性物质、大多数小分子及部
分生物大分子药物的药代动力学
• RIA、EIA、FIA • TDM及生物大分子的药代动力学
应用较多
• 抗生素生物利用度、生物等效性、TDM • 微生物学方法一般特异性较差 • 应用较少，可用于抗生素类药物的分析
4. 热凝固法
（二）分离与浓集法
1. 液相萃取法 2. 固相萃取法 3. 超滤法
1. 液相萃取法 （1） 溶剂的选择原则 （2） 溶剂的用量 （3） 水相的pH （4） 提取操作
（1）溶剂的选取原则
1）对药物分子未电离形式可溶， 对电离形式不溶； 2）沸点低，易挥发； 3）与水不相混溶； 4）无毒， 不易燃烧； 5）具有化学稳定和惰性； 6）不影响紫外检测
唾液
• TDM（治疗药物监测）测定S（唾液浓度）代替P （血浆游离浓度）进行临床监测
1. 唾液的组成 • 腮腺、舌下腺和颌下腺 2. 唾液的采集 • 漱口15分钟， 安静状态， 自然流出的唾液 • 物理或化学方法刺激 3. 样品的制备 • 3000r/min离心10分钟，上清液
组织
1. 样品的制备 • 制成水性基质匀浆溶液 2. 样品的处理 （1）沉淀蛋白法 （2）酸/碱水解法 （3）酶水解法 • 蛋白水解酶中的枯草菌溶素
（四）化学衍生化法
化学 衍生化
• 药物分子中含有活泼氢者均可被化学 衍生化，如含有R-COOH、R-OH等 官能团的药物 ➢ GC： ①提高药物的挥发性； ② 增加药物的稳定性； ③生成非对 映异构体 ➢ HPLC： ①提高检测灵敏度； ② 改善色谱分离
1. 在GC中的应用 （1）硅烷化：三甲基硅烷（TMCS） （2）酰化：三氟乙酸酐（TFAA） （3）烷基化：碘庚烷（C7H15I） （4）不对称衍生化：（S）-N-三氟