第五章 体内药物分析
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体内药物分析
体内药物分析
体内药物分析:
药物分析的的重要分支，是研究生物体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学。
体内药物分析的特点
◆生物样品基质复杂
◆被测物浓度低
◆分析方法要求高
◆实验室仪器设备要求高
◆测定目标与数据处理复杂
体内药物分析方法的要求
◆高灵敏度检测方法的应用
◆建立高选择性、高专属性的分离方法
◆建立的分析方法满足于分析目的相适应的精密度和准确度要求
成分复杂、干扰众多——要求方法选择性高
采样量小，浓度很低——要求方法灵敏度高
原料药：容量分析为主
制剂：仪器分析为主
体内药物：高灵敏度；高选择性的方法
第二章
生物样品指含待测物质的生物基质
最常见的生物基质为血液，最常用的生物样品是血浆或血清
血样采集的时间、方式：
血样的应用：
血样包括全血、血浆、血清
全血不能作为作用部位药物浓度的可靠指标，通常指测定血浆或血清中的药物的浓度。
当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时，使用血清样品
血样制备的差异：
尿液：
尿液中必须加入防腐剂，非损伤性采样方法
唾液：
组织：
头发：
微量元素的测定
生物样品的贮存：
◆血浆和血清：采血后及时分离（2h），短期4℃，长期-20℃
◆冷冻是最常用的生物保存方法
◆生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测完，不能反复冷冻→解冻→冷冻
分析样品制备的目的：
◆使药物从缀合物或结合物中释放，测定总浓度
◆使样品纯化与药物组分富集
◆满足测定方法对分析样品的要求
◆保护仪器性能及改善分析条件
有机破坏法
主要应用于头发样品中金属元素的测定
去除蛋白质法
去除蛋白质目的：
溶剂解法：
◆常用溶剂——甲醇、丙醇
体内药物分析概述
药物疗效与安全性评价
药物疗效与安全性评价是体内药物分 析的重要应用领域之一。通过体内药 物分析，可以对新药或上市药物的疗 效和安全性进行评价，为药物的上市 审批和临床使用提供科学依据。
VS
药物疗效与安全性评价中的体内药物 分析方法包括药效学实验、药代动力 学研究和毒理学研究等。这些方法能 够提供药物在体内的吸收、分布、代 谢和排泄等方面的数据，有助于评估 药物的疗效和安全性，为临床用药方 案的制定提供依据。
实验动物选择与伦理考虑
实验动物种类与品系
选择适合研究目的的动物种类和品系 ，以确保实验结果具有代表性。
伦理考虑
遵循动物伦理和福利准则，确保实验 动物的权益得到保护，并采取适当的 措施来减轻动物的痛苦和不适。
实验方案的设计与实施
实验方案设计
根据研究目的和要求，制定详细的实验方案，包括给药方式、采样时间点、样本处理与 分析方法等。
03
拓展应用领域
将体内药物分析拓展到临床诊断、 毒理学研究、环境监测等领域， 扩大其应用范围。
05
体内药物分析的实验设 计
实验目的与要求
确定研究目的
明确实验的目标，例如研究药物在体内的代 谢过程、药效学特性或毒理学特性等。
确定实验要求
根据研究目的，确定所需的实验参数和指标， 例如药物浓度、代谢产物的鉴定等。
定提供依据。
药物分析05体内药物分析
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第二节、体内样品的前处理
体内样品的前处理是体内药物分 析中极为重要的环节,也是分析中 最困难、最繁复的工作。
请先看如下处理步骤与方法
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第二节 体内样品分析的前处理
处理步骤与方法
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机体内源性生物活 性物质往往参与机 体重要的生理过程, 其变化规律的异常 改变也与某些疾病 的发病机制密切相 关
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第五章 体内药物分析 分析对象
动物
人 猩 猩
鼠
兔
犬
猴
雄
雌
大鼠
小鼠 须动物管理与使 用委员会同意
等等
Just a joke 都是一些志 愿者 也有一些不 知情的人
①血浆 (plasma) ②血清 (serum) ③全血
(二)唾液:很少采用 (三)尿液:用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用
度，药物代谢物及其代谢途径、类型、速率等的研究； 临床上用于判断患者是否违反医嘱用药。 www.themegallery.com Company Logo
常用样品的种类
其它：头发、肝器组织、乳汁、精液、脑脊液、 泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便。
第05章 体内药物分析1
30
离子交换树脂
对弱酸性的药物，可在中性或碱性的条件下用 阴离子交换树脂提取，用水及有机溶剂清洗后用酸 性的溶液洗脱；碱性药物则相反。 离子交换法萃取的回收率常可达90%以上， 而且有较好地选择性，但较麻烦，费时。
31
案例：
用固相微萃取一气相色谱联用分离、分 析尿中痕量毒鼠强。方法的线性范围为10一 500ng/ml，最低检出浓度<10ng/ml， RSD< 1 0%。用该法监测了1例毒鼠强中毒 幼儿尿中毒鼠强含量，在中毒后 3 个月内仍 从尿中检出毒鼠强成分，适用于临床和法庭 毒物分析。
41
进行化学衍生化反应要满足如下要 求： ①能迅速、定量地进行，且反应条 件温和； ②选择性高，最好只与待测成 分反应，衍生化试剂和副产物不干扰样 品的分离和测定； ③衍生化试剂方便易 得，通用性好。
42
从衍生时是否与HPLC 联机，化学衍生化 法分为在线(on line) 和离线(off line) 两种。 从衍生化反应发生的场合，可以分为柱前 衍生化法、柱后衍生化法。
15
去除蛋白质有以下几种方法
1. 溶剂沉淀法---加入与水相混溶的有机溶剂 操作简单，快速，精密度好
常用，特别在LC-MS法中
√乙腈∶血浆=1.5∶1，99.4%蛋白沉淀，颗粒大， 易离心除去 甲醇∶血浆=3.0∶1，98.9%蛋白沉淀，颗粒 小，不易离心除去 2. 加入中性盐 常用饱和硫酸铵、硫酸钠
离子交换树脂
对弱酸性的药物，可在中性或碱性的条件下用 阴离子交换树脂提取，用水及有机溶剂清洗后用酸 性的溶液洗脱；碱性药物则相反。 离子交换法萃取的回收率常可达90%以上， 而且有较好地选择性，但较麻烦，费时。
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案例：
用固相微萃取一气相色谱联用分离、分 析尿中痕量毒鼠强。方法的线性范围为10一 500ng/ml，最低检出浓度<10ng/ml， RSD< 1 0%。用该法监测了1例毒鼠强中毒 幼儿尿中毒鼠强含量，在中毒后 3 个月内仍 从尿中检出毒鼠强成分，适用于临床和法庭 毒物分析。
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进行化学衍生化反应要满足如下要 求： ①能迅速、定量地进行，且反应条 件温和； ②选择性高，最好只与待测成 分反应，衍生化试剂和副产物不干扰样 品的分离和测定； ③衍生化试剂方便易 得，通用性好。
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从衍生时是否与HPLC 联机，化学衍生化 法分为在线(on line) 和离线(off line) 两种。 从衍生化反应发生的场合，可以分为柱前 衍生化法、柱后衍生化法。
15
去除蛋白质有以下几种方法
1. 溶剂沉淀法---加入与水相混溶的有机溶剂 操作简单，快速，精密度好
常用，特别在LC-MS法中
√乙腈∶血浆=1.5∶1，99.4%蛋白沉淀，颗粒大， 易离心除去 甲醇∶血浆=3.0∶1，98.9%蛋白沉淀，颗粒 小，不易离心除去 2. 加入中性盐 常用饱和硫酸铵、硫酸钠
体内药物分析教程
体内药物分析教程
第一部分概述
体内药物分析是对体内样本（包括生物体液、器官或组织）中的药物、代谢物或内源性物质的定量分析。体内药物分析是药代动力学研究和治疗药物监测（TDM ）的重要手段。
药物在临床前研究阶段，首先在试验动物体内进行药代动力学和毒代动力学研究；在临床研究阶段，要对药物作用于人体的安全性与有效性作出评价。这些研究中，建立有效的体内药物分析方法是首要任务。
随着现代医学的不断进步，精准医疗和个体化治疗成为新的理念。TDM
就是采用灵敏可靠的方法，检测患者体内的药物浓度，指导个体化用药方案的制定，保证用药的有效性与安全性。另外，监测和研究体内内源性物质的浓度变化，对于某些疾病的诊断及治疗具有重要意义；对于麻
醉药品和精神药品滥用的检测和运动员体内违禁药物的监测，也必须依据体内药物分析手段和技术才能完成。
药物产生药理作用的强度与其在体内作用部位（受体组织）的浓度直接相关，而药物在体内主要依靠血液输送至作用部位，因此血药浓度
可作为药物在作用部位浓度的表观指标，即血液是体内药物分析的主要样品。另外，尿液、唾液、头发和脏器组织等也可作为体内样品。药物
在体内的某些代谢产物常具有一定的生理活性，它们在体内的变化规律对母体药物的药理学与毒理学评价极为重要；机体内源性生物活性物质往往参与机体重要的生理过程，其变化规律的异常改变也与某些疾病的发病机制密切相关。所以，体内特定药物代谢物和机体内源性生物活性物质也是体内药物分析的目标。
在测定体内药物及其特定代谢物或内源性生物活性物质时，除少
数情况将体液作简单处理后可直接测定外，通常在测定之前要对体内样品进行分离净化与浓集等样品前处理，从而为体内样品中药物的测定提供良好的环境与条件。
体内药物分析
分析方法的选择
根据药物的特性和分析目的， 选择合适的分析方法进行分 析。
数据分析和解释
通过统计学和模型建立等方 法，对分析结果进行解释和 评估。
体内药物分析的未来发展趋势
随着技术的不断进步，体内药物分析将更加精准和高效。人工智能和大数据分析将在药物研发和个体化 用药中起到重要作用。
结论和总结
体内药物分析是现代药物研发和临床实践中不可或缺的一部分。通过准确评 估药物的代谢和药代动力学，可以实现个体化治疗和提高治疗效果。
常用的体内药物分析方法
液相色谱法
通过分离和测定药物成分，快速和准确地分析 药物浓度。
质谱法
通过分析药物的质谱图谱，检测药物的代谢产物。
免疫分析法
利用抗体和抗原的特异性反应，检测药物的含 量和浓度。
药动ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分析
通过建立数学模型，研究药物在体内的吸收、 分布、代谢和排泄。
体内药物分析的应用领域
1
药物研发
评估药物候选化合物的代谢途径和药
个体化用药
2
代动力学特性。
根据患者的基因型和药物浓度，调整
剂量和给药方案。
3
毒物学研究
研究毒物的吸收、分布和代谢途径，
临床药物监测
4
评估其对机体的毒性。
监测药物浓度，确保患者的治疗效果 和安全性。
体内药物分析的挑战与解决方法
药物分析 (5)
要保持被分析物是以“分子形式” 存在 尽可能使呈弱碱性(PH大些) 内源性物质酸性多 PH2: 峰多 PH7: 峰少 PH10: 峰最少
第三部分 体内样品分析的前处理
液-液提取法LLE：
溶液的PH调节
pKa pH log [C非电离 ] [C电离 ]
则[C非电离]= [C电离]
pKa pH
蛋白质的去除
为什么要处理除去蛋白质
使结合型药物游离，以便测定药物 总浓度； 预防提取过程中蛋白质的干扰；
保护仪器性能，延长使用期限
蛋白质的去除方法
加入可与水相混溶的有机溶剂
第三部分 体内样品分析的前处理
加入中性盐：硫酸铵、硫酸钠、镁盐
、枸橼酸盐及磷酸盐等
加入强酸
热凝固法
酶解法
蛋白质的去除方法
第三部分 体内样品分析的前处理
制备方法的选择
生物样品的种类 药物的理化性质与浓度范围 药物测定的目的 样品制备与分离技术的关系 是否 ① 具有分离能力 ② “耐用” ③ 方法专属性 共存物情况
样品前处理的内容
去除蛋白质法
缀合物的水解
分离、纯化与浓集 化学衍生化 注：溶剂提取以后，有的样品可以直 接测定，但是有的样品还需要进一 步分离，这时一般可以采用固相分 离。
为什么取用全血的情况较少
第二部分 常用 体内样品的制备与贮藏
第三部分 体内样品分析的前处理
液-液提取法LLE：
溶液的PH调节
pKa pH log [C非电离 ] [C电离 ]
则[C非电离]= [C电离]
pKa pH
蛋白质的去除
为什么要处理除去蛋白质
使结合型药物游离，以便测定药物 总浓度； 预防提取过程中蛋白质的干扰；
保护仪器性能，延长使用期限
蛋白质的去除方法
加入可与水相混溶的有机溶剂
第三部分 体内样品分析的前处理
加入中性盐：硫酸铵、硫酸钠、镁盐
、枸橼酸盐及磷酸盐等
加入强酸
热凝固法
酶解法
蛋白质的去除方法
第三部分 体内样品分析的前处理
制备方法的选择
生物样品的种类 药物的理化性质与浓度范围 药物测定的目的 样品制备与分离技术的关系 是否 ① 具有分离能力 ② “耐用” ③ 方法专属性 共存物情况
样品前处理的内容
去除蛋白质法
缀合物的水解
分离、纯化与浓集 化学衍生化 注：溶剂提取以后，有的样品可以直 接测定，但是有的样品还需要进一 步分离，这时一般可以采用固相分 离。
为什么取用全血的情况较少
第二部分 常用 体内样品的制备与贮藏
5-体内药物分析
(三）缀合物的水解 2、酶水解法：适用于遇酸及受热不稳定的 药物。常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶。 一般控制pH4.5-5.5,37℃培育数小时进行 水解。 酶水解专属性强，但时间较长，酶制剂可 能带入黏蛋白导致乳化或色谱柱阻塞。
(三）缀合物的水解 3、溶剂解法： 通过加入溶剂在萃取过程中被分解。
(3) 提高检测灵敏度 ——适应和符合测定方法要求
的灵敏度
(4)防止分析仪器的污染和劣化——提高分析仪器的
耐受程度、改善分析结果
二.常用体内样品预处理的技术
生物样品的预处理大致分为以下五类 （1）去除蛋白质 （2）缀合物的水解 （3）分离、纯化与浓集 （4）化学衍生化
（5）有机破坏法
（一）去除蛋白质法
水相pH值——药物的pKa确定——90%以上的非电离形式 碱性药物最佳pH值：高于pKa值1~2个 pH单位
酸性药物最佳pH值：低于pKa值1~2个pH单位
一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值 介质中提取； 生物样品宜在碱性或近中性提取——生物基质中内源 性物质多为酸性，在碱性下不易萃取
（五）头发
2.头发样品的洗涤：丙酮-水-丙酮 3. 头 发 样 品 的 处 理 ： 直 接 甲 醇 提 取 ； 酸 水 解 （ 0.1mol/L 盐 酸 ） ； 碱 水 解 （ 1mol/L 氢 氧 化 钠）；酶水解（最常用）。
第五章体内药物分析
第五章 体内药物分析
（一）最佳选择题
1．体内药物分析中，最常用的体内样品是
A ．血浆
B ．尿液
C ．唾液
D ．胃
E ．十二指肠
2．血浆占全血量的比例是
A. 20%～30%
B.30%~40%
C.40%~50%
D.50%～60%
E.60%.70%
3．常用的去蛋白质的试剂是
A ．醋酸
B ．冰醋酸
C ，甲醇
D ．盐酸
E ．硫酸
4．在体内药物分析方法的建立过程中，实际生物样品试验主要考察的项目是
A ．方法的定量限
B ．方法的检测限
C ．方法的定量范围
D ．代谢产物的干扰
E ．内源性物质的干扰
5．使用唾液作为治疗药物监测样本，应满足的条件是
A ．血浆中药物浓度足够大
B ．唾液中药物浓度够大
C ．P/S 足够大
6．下列研究目的中，体内分析使用毛发样品的是
A ．生物利用度
B ．药物剂量回收
C ．药物清除率
D ．体内微量元素测定
E ．以上均不是
7．用加权最小二乘法计算回归方程时，权重因子（形）一般选用的是
A. 1/Ci 2
B. 1/Ci
C.i C 1 1
D.y/Ci 2
E. x/ Ci 2
8．血浆样品的稳定性考察内容通常不包括的试验是
A ．血浆样品的室温放置
B ．血浆样品冰冻保存
C ．血浆样品冻一融循环
D ．经处理后溶液的冰冻保存
E ．经处理后溶液的室温或特定温度放置
9．在体内药物分析方法的建立过程中，用空白生物基质试验进行验证的指标是
A ．方法的定量范围
B ．方法定量下限( LOQ)
C ．方法的特异性
D ．方法的精密度
E ．方法的准确度
10.当采用液，液萃取法测定血浆中碱性药物（pKa =8）时，血浆最佳pH 是
体内药物分析 体内样品分析 (药物分析课件)
四、样品的制备及测定
（二）样品的制备方法 4.化学衍生化法
在色谱过程中，用特殊的化学试剂借助化学反应给样品化合物接 上某个特殊基团，使其转变为相应衍生物之后进行检测的方法。
分离前将药物进行化学衍生化的主要作用是使药物变成具有能被 分离的性质，提高检测灵敏度，增强药物的稳定性，以及提高对 光学异构体分离的能力等。
反映药物在体内动态变化规律性的一些常数，定量描述了药物在体内 经时过程的动力学特点及作用变化规律，是临床制订合理给药方案的 主要依据之一，同时也是评价药物制剂质量的重要指标。 比如说：血药浓度、生物利用度、药物清除半衰期等。
四、样品的制备及测定
（二）样品的制备方法 2.缀合物水解法 药物经人体代谢后，多与内源性物质结合形成缀合物经尿液排出。所 以在提取之前需要将缀合物中的药物释放，常用酸水解、酶水解及溶 剂水解的方法。
酸水解：通常加入适量的盐酸溶液； 酶水解：常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸苷硫酸酯酶 的混合酶。
三、样品的贮存
（二）稳定性
生物样品中药物的稳定性往往涉及两种情况 ： 待测样品贮存中的稳定性；
添加对照品的标准品的使用期限。
四、样品的制备及测定
样品的制备 样品制备是体内药物分析极其重要的一个环节，往往 也是分析中最难、最烦琐的步骤。
药物在生物样品中常以多种形式存在。
生物样品的介质组成比较复杂，有大量的内源性物质。
5体内药物分析z
体内药物分析
37 2021/8/4
五 进行治疗药物监测应注意的问题
1． 严格把握TDM适应症，避免不必要的血 药浓度测定
患者接受监测品种的药物治疗时，是否需 要监测血药浓度，应根据临床具体情况判断。 药师应协助临床严格把握TDM适应症，避免 不必要的TDM申请
体内药物分析
38 2021/8/4
2．快速提供准确的血药浓度测定结果 3．直接面对临床开展TDM工作
7）免疫抑制剂及抗风湿药等
需要指出的是，滥用TDM 将造成不必要的浪费，应根据
监测的原则和临床指征，确定有无必要进行常规化监测
40
体内药物分析
2021/8/4
分类 强心甙 抗心律失常药 抗癫痫药 β受体阻断剂 平喘药 抗抑郁药 抗躁狂症药 解热镇痛药 抗生素 抗恶性肿瘤药 免疫抑制剂 利体尿内药药物分析
③ 监测方法要求快速、简便、准确，以适应 临床需求
体内药物分析
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三 治疗药物监测的意义
治疗药物监测（TDM ）利用各种分析技术 测定血浆或组织中药物的浓度，并根据药代动 力学的原理和公式来指导个体化给药方案，以 提高疗效，避免或减少毒副作用的发生；为药 物过量中毒的诊断和处理提供实验室依据
需进行TDM的主要药物
药品 地高辛、洋地黄毒苷
利多卡因、普鲁卡因胺、奎尼丁、乙胺碘呋酮、因卡胺、异丙吡胺等
第五章 体内药物分析
优点：采取简便，取样量大，受试者无痛苦。
缺点：药物浓度变化也大，需采集一定时间内的尿样。
采取：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。
药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式从尿中
排出。尿中药物大多呈缀合状态，测定前要将缀合的药物游离。
（三）唾液：
优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。
（二）分析方法建立的一般程序
1、对照品测定：选择测定条件、浓度线性范围等 2、经过纯化处理的空白样品测定：测定空白值， 考虑分离度。 3、空白样品加对照品（质控样品）测定：求得样 品回收率，检验样品中是否有干扰。 4、体内实际样品测定
二 分析方法的验证
(一) 特异性 (二) 标准曲线与线性范围
(三)精密度与准确度
物利用度等研究，以及测定代谢物类型等
脑脊液——怀疑药物损伤血脑屏障
二 体内样品的采集与制备
（一）血样：
自然凝结
上层：血清(serum)
离心
下层：血细胞（凝块）
血 液
加抗凝剂
全血
上层：血浆(plasma)
离心
下层：血细胞
采取：一般是静脉取血、针刺手指、耳垂取血 动物实验可直接从动脉或心脏采取
（二）尿液
一、体内样品前处理的目的
1、使待测药物游离 2、满足测定方法的灵敏度、准确度和专属性 3、改善分析环境：保护测定仪器不受体内样品中类脂和蛋白 质等的污染。
缺点：药物浓度变化也大，需采集一定时间内的尿样。
采取：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。
药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式从尿中
排出。尿中药物大多呈缀合状态，测定前要将缀合的药物游离。
（三）唾液：
优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。
（二）分析方法建立的一般程序
1、对照品测定：选择测定条件、浓度线性范围等 2、经过纯化处理的空白样品测定：测定空白值， 考虑分离度。 3、空白样品加对照品（质控样品）测定：求得样 品回收率，检验样品中是否有干扰。 4、体内实际样品测定
二 分析方法的验证
(一) 特异性 (二) 标准曲线与线性范围
(三)精密度与准确度
物利用度等研究，以及测定代谢物类型等
脑脊液——怀疑药物损伤血脑屏障
二 体内样品的采集与制备
（一）血样：
自然凝结
上层：血清(serum)
离心
下层：血细胞（凝块）
血 液
加抗凝剂
全血
上层：血浆(plasma)
离心
下层：血细胞
采取：一般是静脉取血、针刺手指、耳垂取血 动物实验可直接从动脉或心脏采取
（二）尿液
一、体内样品前处理的目的
1、使待测药物游离 2、满足测定方法的灵敏度、准确度和专属性 3、改善分析环境：保护测定仪器不受体内样品中类脂和蛋白 质等的污染。
第五章 体内药物分析
第五章 体内药物分析
（一）最佳选择题
1．体内药物分析中，最常用的体内样品是
A ．血浆
B ．尿液
C ．唾液
D ．胃
E ．十二指肠
2．血浆占全血量的比例是
A. 20%～30%
B.30%~40%
C.40%~50%
D.50%～60%
E.60%.70%
3．常用的去蛋白质的试剂是
A ．醋酸
B ．冰醋酸
C ，甲醇
D ．盐酸
E ．硫酸
4．在体内药物分析方法的建立过程中，实际生物样品试验主要考察的项目是
A ．方法的定量限
B ．方法的检测限
C ．方法的定量范围
D ．代谢产物的干扰
E ．内源性物质的干扰
5．使用唾液作为治疗药物监测样本，应满足的条件是
A ．血浆中药物浓度足够大
B ．唾液中药物浓度够大
C ．P/S 足够大
6．下列研究目的中，体内分析使用毛发样品的是
A ．生物利用度
B ．药物剂量回收
C ．药物清除率
D ．体内微量元素测定
E ．以上均不是
7．用加权最小二乘法计算回归方程时，权重因子（形）一般选用的是
A. 1/Ci 2
B. 1/Ci
C.i C 1 1
D.y/Ci 2
E. x/ Ci 2
8．血浆样品的稳定性考察内容通常不包括的试验是
A ．血浆样品的室温放置
B ．血浆样品冰冻保存
C ．血浆样品冻一融循环
D ．经处理后溶液的冰冻保存
E ．经处理后溶液的室温或特定温度放置
9．在体内药物分析方法的建立过程中，用空白生物基质试验进行验证的指标是
A ．方法的定量范围
B ．方法定量下限( LOQ)
C ．方法的特异性
D ．方法的精密度
E ．方法的准确度
10.当采用液，液萃取法测定血浆中碱性药物（pKa =8）时，血浆最佳pH 是
药物定量分析与分析方法验证 ppt课件
ppt课件
30
1. 内源性物质的干扰 考查待测药物或其活性代谢产物检测信号 比较对照品（或标准品），空白生物基质，模拟生物样 品（空白生物基中加对照品）信号。 如HPLC色谱峰的tR、n和T是否一致， 及与内源 性物质色谱峰的R 确证：内源性物质对分析方法有无干扰
ppt课件
31
2. 代谢产物的干扰 比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信 号与代谢产物的R值。 确证：其它代谢产物对分析方法有无干扰 结构已知的特定活性代谢物的测定
4.化学衍生 目的：
1）提高检测灵敏度，如HPLC紫外检测
2）增加药物稳定性。 3）提高药物分析能力，如：
a.GC中的-COOH衍生成-COOCH3增大挥发 极性。
性，减少
b.手性分离中：生成非光学异构体（普通柱色谱分 析）
ppt课件
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1）GC: R—COOH Ar-OH
CH2N2 CH3OH ArOCOCH3 Ar-O-CH3 Ar-OSiMe3
3）水相pH值：主要考虑药物的酸碱性
如：选择水相pH为碱性
药物是生物碱 内源性杂质为酸性
游离碱
脂液
成盐
水溶性增加
ppt课件
20
（2) 固相萃取（Solid-phase Extraction,SPE）
小型柱色谱，填料粒度小，分离效能高，无乳化现 象，处理样品速度快，常用提取：
第五章体内药物分析药学ppt课件
二、体内样品的采集和贮藏
(一)血液 (1)血浆 全血中加入抗凝剂(肝素、枸橼酸、草酸 盐、EDTA等），经离心后取上清液。 （2）血清 全血不加抗凝剂，由血液中纤维蛋白原 等影响下,引起血液凝结而析出的澄清黄色液体,离心 后取上清液。 （3）全血 加入抗凝剂混匀，以防凝血。
血清比血浆只是少一种纤维蛋白原 C血浆= C血清
3.缀合物的水解
酸水解法 酶水解法 容剂解法
4.化学衍生法
气相色谱：硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化 液相色谱：紫外、荧光、非对映衍生化
第三节 定量分析方法的验证
（一）特异性（专属性） 内源性物质不得干扰原药、特定的活性代谢物
（二）标准曲线 r≥0.9900，至少5个浓度，不许外延
（三）精密度和准确度 RSD≤15％、20％(LLOQ) 相对回收率85～115％（80～120％）
最常用的酶—枯草菌溶素（一种细菌性碱性蛋白分解酶 ， 可 在 pH7.0~11.0 较 宽 的 范 围 内 使 蛋 白 的 肽 键 降 解 ， 在 50~60℃具有最大活力）
优点—酶解法操作简便 —避免药物在酸及高温下降解 —对与蛋白结合紧密的药物，可显著改善回收率 —可用有机溶剂直接萃取酶解液 而无乳化现象生成
用唾液中的药物浓度来反应血浆浓度。 唾液的采集一般是在漱口后15分钟，收集，
离心后，取上清液。
11
《体内药物分析》课件
方法和技术。
3
局限性的原因
分析体内药物时的局限性，包括生物变 异、样本制备和测定方法等方面的影响。
如何解决局限性问题
1 优化样本制备
2 改进测定方法
3 标准化操作流程
改进样本制备方法，以减 少样本制备过程中的误差。
优化测定方法，提高测定 的准确性和灵敏度。
制定标准化操作流程，减 少人为因素对分析结果的 影响。
通过分离和测定药物在样品中的浓度，可以定量分析药物。
2 质谱法
利用质谱仪对药物和其代谢产物进行分析和鉴定。
3 毒理学方法
通过观察药物在体内的毒副作用，评估药物的毒理学活性和安全性。
药物动力学参数的测定
测定方法介绍
介绍药物动力学参数的测定方 法，包括药物吸收、分布、代 谢和排泄等方面的参数。
药物吸收动力学参数的测 定
通过对药物浓度的测定，可 以监测患者在药物治疗过程 中的药物水平，从而调整药 物剂量和治疗方案。
毒理学评价
研究药物在体内的分布和代 谢，可以评估药物对人体的 毒性和安全性。
药物代谢动力研究
通过研究药物在体内的代谢 过程，可以了解药物的代谢 途径和代谢速率，为合理用 药提供依据。
药物浓度分析方法
1 高效液相色谱法
通过研究药物在体内的吸收速 率和程度，了解药物在体内的 吸收过程。
药物代谢动力学参数的测 定
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（4）固相萃取法的特点
当采用亲脂性键合硅胶SPE时 • 方便、省时 • 通常可以用小体积的甲醇、乙腈等洗脱剂（200~300μl）
完全洗脱药物，净化并浓集样品 • 不需蒸干即可直接进样
（5）自动化固相萃取法
• 对于单个样品处理， SPE操作省时 • 对于大量样品的处理
➢ 半自动SPE： 萃取过程机械化 ➢ 全自动化仪器： 通过柱切换技术实现固相萃取与
• 静脉， 0.2～5ml，≤15%~20%动物总血量
2. 血浆的制备 • 抗凝剂，1000g离心5～10分钟，淡黄色上清液 50%～60％
3. 血清的制备
• 30分钟～1小时，1000g离心，5～10分钟，上层淡
Байду номын сангаас黄色液体
20%～40％
4. 全血的制备
• 抗凝剂， 不离心
尿样
1. 尿样的特点 • 原形或代谢物 • 药物浓度较高 • 收集量大（1~5L） 2. 尿样的采集 • 自然排尿 • 规定时间段（6～8小时）（时间尿） 3. 尿样的储存 • 加入适当防腐剂
• 测定尿药总量、水解缀合物或Ⅱ相代谢产物 • 趋向于直接测定缀合物
• 简便， 快速 • 水解过程中发
生药物分解 • 专一性较差
1. 酸水解法
• 葡萄糖醛酸苷酶或 （和）硫酸酯酶
• 专属性强 • 时间较长 • 可引入黏蛋白
2. 酶水解法
• 溶剂萃取过程 中缀合物（尤 其硫酸酯）直 接分解
3.溶剂解法
（二）去活性
• 采样后立即终止酶的活性 • 常用方法：液氮速冻， 微波照射， 匀浆及沉淀， 加
酶活性阻断剂（氟化钠）或抗氧剂（维生素C），调 节pH及样品煮沸
去活性：酶活性阻断剂
哌唑嗪、敌敌畏 噻吩甲酰三氟丙酮
羧酸 酯酶
• 酯酶是普遍存在于全血、 血浆和血清中的一类水 解酶，能够水解结构中 含有酯键的药物
二乙异丙嗪
丁酰胆 碱酯酶
酯酶抑制剂，可 以有效防止药物在 酯酶的作用下发生
降解
乙酰胆 碱酯酶
敌敌畏
5,5′-二硫代双
（2-硝基苯甲酸）
芳香基 酯酶
磷酸二 酯酶
氟化钠 氟化钾
去活性：调节pH
调节pH有效 避免化合物发 生降解或者分
子内转化
酯类 酰胺类 内酰胺类 内酯类
葡糖苷酸类
• 甲酸、醋酸、磷酸、枸橼酸或者缓冲盐溶液
三、体内样品的储存与处理
（一）冷藏与冷冻
• 短期保存： 冰箱（4℃）冷藏 • 长期保存： 冷柜（-20℃/-70~-80℃）冷冻， 小体积分装 1. 血浆/血清 • 分离（2小时）， 硬质玻璃/聚乙烯管（EP）， 冷冻 2. 尿样 • 冷藏（24~36小时）加防腐剂 3. 唾液 • 冷冻保存时， 解冻后充分搅匀后再用
HPLC联用
柱（切5）换自：动固化相固萃相取萃-L取C法/MS/MS
3. 超滤法
• ultrafiltration是一种膜分离技术 • 按照截留分子量，选择半透膜，可分离30 ~1000kD
的可溶性生物大分子 • 无化学试剂，无相变化
• 简便， 游离药物分析的首选方法； 尤其适合TDM
（三）缀合物水解法
第一节 常用体内样品的制备与储存
1 体内样品的种类 2 体内样品的采集与制备 3 体内样品的储存与处理
一、体内样品的种类
体液
血液、唾液
脑脊液、胃液、 胆汁、乳汁、 精液、泪液
组织
胃、肠、肝、 肾、肺、脑、 肌肉、头发
排泄物
尿液
粪便、 汗液
二、体内样品的采集与制备
常见体内样品
血样
1. 血样的采集
• 样品处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作
1 体内样品处理的目的
2 常用体内样品处理方法
一、体内样品处理的目的
1. 使待测 组分游离
3. 改善分 析环境
仪器污染，劣化（去蛋白） 提高测定灵敏度/选择性 化学改性（衍生化）
样品 处理
血浆蛋白结合物、缀合物 使待测药物/代谢物释放测定药 物/代谢物总浓度
药物分析
第五章 体内药物分析
1 常用体内样品的制备与贮藏 2 体内样品分析的处理 3 体内样品分析方法与方法验证 4 典型体内药物分析应用
掌握： 体内药物分析的特点和应用 体内样品处理 体内样品分析方法验证的内容
熟悉： 体内样品的采集与制备方法 体内样品分析方法验证的技术要求
了解： 体内药物分析的性质与意义
1）辅助试剂的使用 • 乙醚萃取可混入约1.2%水： 加入固体氯化钠 2）混合溶剂的使用 • 正己烷-异丙醇（95 ︰ 5）
溶剂
紫外截止波长（nm） 沸点（℃）
正己烷
210
69
环己烷
210
81
甲苯
↓ 极
异丙醚*
性 乙醚*
285
111
220
68
220
35
增 乙酸戊酯
285
149
加 三氯甲烷
245
乙酰脯氨酰氯（ST-FPC）
2. 在HPLC中的应用 （1）衍生化的分类
• 柱前/柱后；在线/离线 （2）衍生化方法
1）紫外衍生化 2）荧光衍生化 3）质谱检测衍生化 4）非对映体衍生化
第三节 体内样品分析方法
与方法验证
一、分析方法的建立 二、分析方法的验证
一、分析方法的建立
（一） 分析方法的选择 （二） 分析方法建立的一般程序
2. 满足测 定方法的 要求
样品介质组成复杂： 分离 待测组分浓度低： 浓集
二、常用体内样品处理方法
（一） 蛋白沉淀法 （二） 分离与浓集法 （三） 缀合物水解法 （四） 化学衍生化法
（一）去除蛋白质法
• 加入与水混溶的有机溶 剂， 蛋白析出，药物 释放
• 乙腈、甲醇、丙酮、四 氢呋喃等
• 血浆/血清与有机溶剂 的体积比1∶（2～3）
提取； • 多在碱性下提取， 可减少内源性物质（酸性）的
干扰 • 碱性下不稳定， 在中性用三氯甲烷和异丙醇提取
（4）提取操作
• 一般只提取1次 • 若提取回收率较低（低于50%）， 提取2~3次 • 脂溶性干扰物， 可进行小体积水溶液反提取
2. 固相萃取法 （1） 固相萃取法的原理 （2） 固相萃取法操作步骤 （3） 注意事项 （4） 固相萃取法的特点 （5） 自动化固相萃取
（2）固相萃取法操作步骤
• 第1步： 甲醇润湿小柱， 活
化填料； 净化填料
• 第2步： 水/缓冲液冲洗小柱，
去除甲醇； 甲醇含量过低
（低于5%）致C18链弯曲折
叠， 回收率降低
, 平衡
• 第3步： 加样， 使样品通过
小柱， 并弃去滤过液
• 第4步： 水/缓冲液冲洗 小柱， 去除内源性及其 他干扰物质
体内药物分析 分析方法 样品制备 存在形式
体内样品
概述
生物分析
方法建立 • 色谱、免疫分析、生物 与验证 • 完整、部分和交叉验证
• 蛋白沉淀、萃取、膜分离
净化与浓集
•
水解、化学衍生化
原形、代 • 原形药物或其代谢物
谢物
• 缀合物、蛋白结合物
体液或组织
• •
血液是最常用样品 尿• 液4 、唾液、头发和脏器
61
↓
甲基异丁基酮
230
116
乙酸乙酯
260
77
正丁醇
215
118
*：含过氧化物；：肝脏毒性， 有致癌作用
（2）溶剂的用量 • 有机相与水相（样品）体积比为1︰1~5︰1
（3）水相的pH
• 碱性药物pH高于pKa 1~2pH单位 • 酸性药物pH低于pKa 1~2pH单位 • 碱性药物在碱性pH，酸性药物在酸性pH基质中
1. 溶剂沉淀法
• 饱和硫酸铵、硫酸钠、 硫酸镁、氯化钠等
• 血清与饱和硫酸铵溶液 的体积比为1∶2
2. 中性盐析法
• 10%三氯醋酸或6%高氯 酸溶液
• 血清与强酸的体积比 1∶0.6
• 上清液呈强酸性（pH≤4） • 酸性下分解的药物不宜用
3. 强酸沉淀法
• 热变性蛋白质沉淀 • 通常90℃ • 方法简单 • 只能除去热变性蛋白 • 待测物热稳定性良好
去活性：抗氧化剂
• 含有酚羟基结 构的药物在生 物基质或样品 处理过程易发 生自身氧化
• 使用抗氧化剂 为常用的方法
测定利福平时加入 0.5% w/v的维生素C
测定左旋多巴及其代谢产物时加入焦 亚硫酸钠和乙二胺四乙酸（EDTA）
第二节 体内样品处理
分析方法与样品处理步骤的选择
• 样品处理（分离、浓集、改性）为药物的测定创造良好 条件
（一）选择性
• 选择性 （selectivity），体内样品所含其他物质不得 干扰对样品的测定或者其干扰在分析方法的可接受范 围内。
1.内源性物质
• 比较待测物的对照标准 物质与6个不同个体的空 白生物基质和QC样品
• 软电离质谱（LC-MS或 LC-MS/MS）基质效应
2.未知代谢物
• 比较QC样品和至少6个不 同个体用药后的试验样品
• 第5步： 洗脱溶剂洗脱 待测物， 收集洗脱液
, 平衡
（3）注意事项
1）体液样品（如血浆等）通过萃取柱的流速在1～ 2ml/min；
2）冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当，否则导致药物损 失/选择性下降，通常选用可与水混溶的洗脱剂；
3）萃取碱性药物时， 洗脱剂中常加酸、有机胺、氨水、 醋酸铵或离子对试剂
（二）分析方法建立的一般程序
• 分析方法的建立和验证过程系同步进行 • 为便于讨论， 以色谱分析法为例分别叙述
1. 色谱条件 的筛选
• 待测物、内标（必要时）的对照 标准物
• 色谱柱（填料）、流动相、流速、 进样量
2. 色谱条件 的优化
• 试剂与溶剂试验 • 生物基质试验 • 质控样品试验
3. 试验样品 的测试
• 代谢产物对待测物、内标物的干扰 • 配伍用药的干扰
二、分析方法的验证
（一） 选择性 （二） 标准曲线与定量范围 （三） 定量下限 （四） 精密度与准确度 （五） 样品稳定性 （六） 提取回收率 （七） 基质效应
（八） 试验样品分析 （九） 试验样品浓度超出定量范围的处理 （十） 作为外源性药物使用的内源性物质的测定 （十一）微生物/免疫学方法的验证 （十二）名词解释
（1）固相萃取法的原理
• 含药物体内样品通过小柱时， 受到 “吸附”、“分 配”、“离子交换”或其他亲和力作用， 药物及内源性 物质同时被保留在固定相（填料）上
• 洗脱方式有两种： ①药物比干扰物质与固定相之间的亲 和力更强：冲洗溶剂洗去干扰物时药物被保留， 然后再 用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物； ②干扰物质较药 物与固定相之间的亲和力更强：药物直接被洗脱， 干扰 物被保留
特点
体内药物分析的特点 主要来自于体内样品的特点
1. 体内样品的特点 （1）采样量少： ml~µl级； 且不易重新获得 （2）待测物浓度低：µg/ml ~ng/ml级， 甚至pg/ml （3）干扰物质多： 尤其是血样和组织中的蛋白质
2. 体内药物分析的特点 （1）样品需经分离与浓集， 或化学衍生化处理 （2）对分析方法的灵敏度及选择性要求较高 （3）分析工作量大， 数据处理和结果阐明繁杂
（一）分析方法的选择
• 常用的检测方法： 色谱分析法、免疫分析法和生物学 方法
• HPLC， GC • LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS • 内源性物质、大多数小分子及部
分生物大分子药物的药代动力学
• RIA、EIA、FIA • TDM及生物大分子的药代动力学
应用较多
• 抗生素生物利用度、生物等效性、TDM • 微生物学方法一般特异性较差 • 应用较少，可用于抗生素类药物的分析
4. 热凝固法
（二）分离与浓集法
1. 液相萃取法 2. 固相萃取法 3. 超滤法
1. 液相萃取法 （1） 溶剂的选择原则 （2） 溶剂的用量 （3） 水相的pH （4） 提取操作
（1）溶剂的选取原则
1）对药物分子未电离形式可溶， 对电离形式不溶； 2）沸点低，易挥发； 3）与水不相混溶； 4）无毒， 不易燃烧； 5）具有化学稳定和惰性； 6）不影响紫外检测
唾液
• TDM（治疗药物监测）测定S（唾液浓度）代替P （血浆游离浓度）进行临床监测
1. 唾液的组成 • 腮腺、舌下腺和颌下腺 2. 唾液的采集 • 漱口15分钟， 安静状态， 自然流出的唾液 • 物理或化学方法刺激 3. 样品的制备 • 3000r/min离心10分钟，上清液
组织
1. 样品的制备 • 制成水性基质匀浆溶液 2. 样品的处理 （1）沉淀蛋白法 （2）酸/碱水解法 （3）酶水解法 • 蛋白水解酶中的枯草菌溶素
（四）化学衍生化法
化学 衍生化
• 药物分子中含有活泼氢者均可被化学 衍生化，如含有R-COOH、R-OH等 官能团的药物 ➢ GC： ①提高药物的挥发性； ② 增加药物的稳定性； ③生成非对 映异构体 ➢ HPLC： ①提高检测灵敏度； ② 改善色谱分离
1. 在GC中的应用 （1）硅烷化：三甲基硅烷（TMCS） （2）酰化：三氟乙酸酐（TFAA） （3）烷基化：碘庚烷（C7H15I） （4）不对称衍生化：（S）-N-三氟