橡胶树毛色二孢叶斑病病原菌的鉴定及其生物学特性研究

橡胶树毛色二孢叶斑病病原菌的鉴定及其生物学特性研究作者：吴如慧李增平张宇施泽坤来源：《热带作物学报》2019年第01期摘 ;要;;近期在海南省三亚市的橡胶树种植区发现一种新的橡胶树叶斑病，利用组织分离法和单孢分离法获得纯化菌株HNSY003。

通过形态学特征观察、rDNA-ITS和EF1-α序列分析及柯赫氏法则验证，确定该病原菌为假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）。

这是假可可毛二孢所致橡胶树叶斑病的首次发现。

生物学特性测定结果表明，病菌最适生长条件为：温度32;℃，pH;5，碳源为D-果糖，氮源为酵母浸膏。

不同光照条件对菌丝生长影响不显著。

关键词 ;橡胶树;毛色二孢叶斑病;假可可毛色二孢;生物学特性中图分类号;;S794.1;;;;;;文献标识码;;AIdentification and Biological Characteristics of the Pathogen CausingLasiodiplodia;Leaf;Spot of Robber TreeWU Ruhui， LI Zengping*， ZHANG Yu，;SHI ZekunInstitute of Tropical Agriculture and Forestry，;Hainan University， Haikou， Hainan 570228， ChinaAbstract ;A new leaf;spot;disease of rubber tree was found in Sanya， Hainan. The pathogen strain HNSY003 was isolated and purified by methods of tissue isolation and single spore isolation.;The pathogen was identified;as Lasiodiplodia pseudotheobromae;by morphological observation， sequence analyses of rDNA-ITS and EF1-α， and its pathogenicity was confirmed by Koch’s postulate. The fungal species is reported;the first;time;as the pathogen of robber tree;leaf;spot. The results of biological characteristics test showed that the optimum conditions for the pathogen growth were as follows： temperature 32;℃， pH;5， D-fructose as the carbon source， yeast extract as the nitrogen source. Different light conditions had little effect on the growth rate of the pathogen hypha.Keywords ;rubber tree;;Lasiodiplodia;leaf;spot;;Lasiodiplodia pseudotheobromae;;biological characteristicDOI;;10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.016橡胶树[Hevea brasiliensis（Willd.ex A.Juss.）Muell. Arg]为大戟科（Euphobiaceae）三叶橡胶树属（Hevea）的多年生热带产胶乔木，其所产生的天然橡胶与石油、煤炭、钢铁并称世界四大工业原料[1]。

中国的橡胶树种植区主要分布于海南、云南、广东、广西、福建等地区，其中海南和云南为主要植胶区。

随着世界各国越来越重视环境，煤炭等不可再生资源大量消耗，对天然橡胶的需求将不断增加，天然橡胶产业发展前景广阔[2]。

斯里兰卡曾报道了侵染橡胶树的60多种病原菌[3]。

由美国植物病理学会组织编撰的作物病虫害数据库[4]中记录的橡胶树病害有117种。

危害橡胶生产的病害主要有葉部病害（如白粉病[5]和炭疽病[6]）、根病[7]（如红根病和褐根病）、茎干病害（如绯腐病[8]和割面条溃疡[9]）等。

一些橡胶树叶斑病常造成胶树大量落叶，对橡胶树的危害较为严重。

笔者对海南省多个橡胶树种植地进行调查时，在海南省三亚市的吉阳镇胶园中发现一种危害橡胶树叶片的新病害，经初步鉴定后取名为橡胶树毛色二孢叶斑病。

调查中发现，该病原菌主要为害胶树下层老化叶片，在6—10月高温、多雨的季节发生，6月开始发病，7—9月进入台风雨季后发病迅速，9月为发病高峰期，株发病率为32.64%。

本研究对这一橡胶树新病害的病原菌结合形态学、分子生物学方法及柯赫法则进行种类鉴定，并对其病原菌进行了生物学特性初步研究，以期为进一步研究该病害的发生流行规律及防控提供理论支持和技术借鉴。

1.1;;材料1.1.1 ;病样采集及接种苗木;;于2017年9月从海南省三亚市吉阳镇橡胶园中的发病胶树上采集病叶，样品用保鲜袋包装后带回实验室备用。

致病性测定所用橡胶树苗由海南大学热带农林学院提供的二年生7-33-97橡胶芽接幼树。

1.1.2 ;培养基 ;马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和查氏培养基（Czapek），详细配方参阅《植病研究方法》[10]。

1.1.3 ;试剂及仪器;;E.Z.N.A.®Fungal DNA Kit，OMEGA;Extraction Kit，2×Taq-Mixture，DNA Marker。

Olympus BX 51显微镜。

1.2 ;方法1.2.1 ;橡胶树毛色二孢叶斑病病原菌分离与纯化;;采用常规组织分离法，将发病葉片先用无菌水冲洗，再从发病初期叶片病健交界处切取3;mm×;3;mm的病斑组织，在75%酒精中浸泡8;s，再用1%的升汞溶液浸泡1;min，然后用无菌水漂洗3次，用灭菌后的镊子将其转移到PDA培养基上，封口，28;℃恒温培养。

待其产孢后采用单孢分离法用已灭菌的接种环从已长满菌丝的PDA平板里挑取少量带分生孢子的菌丝，置于1;mL灭菌水中混匀后梯度稀释成不同浓度的孢子悬浮液，涂布在PDA平板表面，28;℃的恒温培养1;d后挑取单孢菌落进行纯化。

分离菌株纯化后编号为HNSY003，转入斜面试管4;℃冷藏保存备用[11]。

1.2.2 ;菌株的致病性测定;;采取6株种植二年生的热研7-33-97健康橡胶树袋装苗，表面消毒后，采用针刺法接种，3株接HNSY003分离菌，3株接空白PDA培养基作对照。

用灭菌手术刀在消毒的植株茎干表面削出3个间隔5;cm左右长约1;cm的平面伤口，用灭菌束针刺伤接种的叶片，将培养2;d的菌落上的菌丝块面朝下贴在伤口上，对照处接空白培养基，表面覆盖棉花后用灭菌水湿润保湿，每天观察发病情况，定期记录并拍照。

1.2.3 ;菌株鉴定;;形态鉴定：将分离菌株移接在PDA培养基上，28;℃培养2;d后，观察菌落形态和颜色，并挑取菌丝制片在光学显微镜下观察和测量病菌的分生孢子器和分生孢子并拍照。

分子鉴定：使用OMEGA Fungal DNA Kit来提取病原菌DNA。

采用通用引物ITS1（5′-TC C G TAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′）[12]扩增rDNA基因内转录间隔区以及特异性引物EF1-688F（5′-CGGT CAC T TGATCTACAAGTGC-3′）/EF1-1251R（5′-C C T CGAACTCACCAGTACCG-3′）[13]扩增翻译延伸因子的部分序列。

PCR 扩增后对其产物进行电泳检测。

使用OMEGA Extraction Kit试剂盒切胶回收目的片段，纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

将获得的序列在NCBI上进行比对分析，并提交序列，然后对测序后的rDNA-ITS和EF1-α序列进行序列联配比较、编辑。

利用 MEGA 6.0软件用邻接法（neighbor-joining，NJ）以Botryosphaeria dothidea为外群，构建系统发育树[14]。

1.2.4 ;橡胶树毛色二孢叶斑病病原菌的生物学特性测定;;用直径5;mm的打孔器在培养2;d 的菌落边缘打取菌饼，将其移接到不同种类的培养基平板中心进行培养。

逐日定时定点用十字交叉法测量菌落直径。

每组不同处理测定设置3个重复。

除碳、氮源生物学测定外，其他条件所使用的培养基均为PDA培养基。

（1）温度：接菌后置于15、20、25、28、30、32、35、40;℃共8个温度梯度下恒温黑暗培养。

（2）光照：采用15;W照明灯，测定条件设置为连续光照、完全黑暗、12;h光暗交替3种条件，28;℃恒温培养。

（3）pH：在已灭菌的PDA培养基凝固之前，用1;mol/L的HCl和1;mol/L的NaOH将pH分别调至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11共10个梯度，28;℃恒温培养。

（4）碳、氮源：分别称取等碳量的D-果糖、D-山梨醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、肌醇加入基础碳源培养基，称取等氮量的L-天冬酰胺、牛肉膏、酵母浸膏、大豆蛋白胨、硝酸铵、草酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙加入基础氮源培养基中，将不加蔗糖、硝酸钠的Czapek培养基作为缺碳、缺氮空白对照。

1.3;;数据处理利用Excel;2010软件和SAS 9.1软件进行数据统计分析，采用Duncan’s;multiple;range;test 进行多组样本间差异显著性分析。

2.1;;橡胶树毛色二孢叶斑病症状橡胶树毛色二孢叶斑病主要为害橡胶树老化叶片，叶片染病后初期呈现黑褐色圆形小病斑，周围具明显黄色晕圈，后期扩展为圆形、半圓形或不规则形灰白色病斑，其上散生小黑点，病健交界处有一明显的深褐色坏死带，外围有明显黄色晕圈。

病斑扩展不受小叶叶脉限制，但受主脉限制（图1A，图1B）。

2.2;;致病性测定用菌株HNSY003接种橡胶树叶片，针刺接种1;d后发病，3;d后发病部位失水褪绿变成灰白色（图2A），7;d后病斑逐渐扩展成近圆形，边缘灰褐色至褐色，中间灰白色，外围具明显黄色晕圈，症状与田间发病植株症状一致（图2B），对照均未发病。

茎干接种3～14;d后，伤口接种分离菌的橡胶苗茎干被侵染变褐色并扩展，对照则无明显变化。