电解质溶液中牛血清白蛋白分子相互作用的动态光散射研

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茜素红S标记分光光度法测定微量人血清白蛋白

茜素红S标记分光光度法测定微量人血清白蛋白赵丹华【摘要】研究有机染料茜素红S（alizarin red S，ARS）与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的结合反应，选择实验的最佳条件：PH=5．10的B—R缓冲溶液3．00mL，4．00mL5．0×10-4mol／L茜素红S溶液．反应20min后，体系的吸光度很稳定，在入λ=420nm处有最大吸收峰，并且随着牛血清白蛋白（BSA），人血清白蛋白（HSA）的加入，茜素红S的吸收峰下降．因此以茜素红S为标记物，根据其在波长420nm处吸收峰下降的程度，可用于定量测定BSA和HSA．测量BSA的线性响应范围为0～32．0μg／mL，相关系数为0．9987，测量BSA的线性响应范围为0～28．0μg／mL，相关系数为0．9968．该方法具有较高的灵敏度和选择性，用于实际试样分析，实验结果令人满意．%The protein is a kind of important biological macromolecules in the human body. It is not merely very important and essential for maintaining the life. A acidic dye has been applied to the assay of proteins in the fields of medicine and life science. The reactions of human serum albumen （HSA） and bovine serum albumen （BSA） with alizarin red have been studied. Both BSA and HSA can form orange complexes, which decrease the absorbance. The optimum conditions of complex reactions of a new chromogenic reagent alizarin red with BSA and HSA was studied. The method was used in the photometric determination of BSA and HSA. In a buffer medium of pH 5.10, alizarin red reacts with BSA and HSA to form a complex having its absorption maxima at 420nm and the reactionssteady with 80 rain. Beefs law is obeyed in the concentration in the range of 0-32.0 μg/mL（r=0. 998 7） for BSA and 0-28.0μg/mL（r= 0. 996 8） for HSA. The BSA and HSA in human serum samples were determined, and the result is satisfactory.【期刊名称】《广东第二师范学院学报》【年(卷),期】2011(031)005【总页数】5页(P51-55)【关键词】茜素红S;牛血清白蛋白;人血清白蛋白;分光光度法【作者】赵丹华【作者单位】广东第二师范学院化学系,广东广州510303【正文语种】中文【中图分类】O657.32人体血液中的白蛋白是形成血浆渗透压的主要成分，它在维持体液的正常分布，保持血容量及血压等方面起着重要作用.同时，血浆白蛋白对人体具有营养作用.现已报道将它作为人体营养健康、疾病诊断和疗效观察的重要指标［1］.测定研究血浆中白蛋白的含量，可对人体健康和生命科学的研究提供重要的科学依据.蛋白质含量的测定方法很多，有荧光光度法［2］以及近年来新兴的共振光散射法［3］、分光光度法［4］等.目前，研究测定核酸较灵敏和较常用的手段是荧光光谱法.由于DNA内源荧光很弱，直接用其天然荧光来测定DNA受到了限制.共振光散射（RLS）法近年来得到了广泛的研究与应用.童沈阳等［5］首次将其作为一种新的高灵敏度方法应用于核酸的测定.肖锡林等［6］建立了纳克级核酸的分析方法.其中染料结合分光光度法具有简便、快速、经济、准确的特点，因而在蛋白质的定量分析中较为常用.近年来，利用某些染料作为标记物，如：乙基紫［7］、维多利亚蓝B［8］等测定DNA，取得了较好的效果.如维多利亚蓝的灵敏度高，反应快速，操作简便，是目前测定DNA较好的方法.茜素红S是由天然产物中提出的有机物质，其作为光谱探针与生物大分子作用的研究和应用中发现在一定的条件下，茜素红S能与生物大分子在一定的部位结合，生成复合物.本文采用分光光度法研究了以茜素红S作为标记物与牛血清白蛋白、人血清白蛋白的结合反应，发现在3.00 m L p H＝5.10的B-R缓冲溶液中，取5.00 m L 2.0×10-4 mol／L茜素红S，以二次蒸馏水作为参比溶液，随着BSA、HSA浓度的增加，在420 nm处有最大吸收峰，据此建立了一种测定BSA、HSA 的新方法.该方法操作简便，灵敏度高，选择性较好，用于实际样品分析，结果令人满意.仪器：721型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；半自动电光分析天平（上海第二分析仪器厂）；p HS-3C型酸度计（上海第二分析仪器厂）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）.试剂：牛血清白蛋白溶液（BSA上海生物化学试剂公司）、人血清白蛋白（HSA上海文化科技有限公司）各100μg／m L的溶液；5.0×10-4 mol／L的茜素红S （分析纯）溶液；Britton-Robinson（B-R）缓冲溶液.所用其他试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子水.于25 m L比色管中依次加入p H＝5.10的3.00 m L B-R缓冲溶液，4.00 m L 5.0×10-4 mol／L茜素红S，一定量的标准BSA溶液，稀释至刻度，静置20 min，于λ＝420 nm处读取吸光度A值；不加入BSA，按上述步骤做空白，测定吸光度A 0值.以二次去离子水作为参比溶液，测定吸光度值.令ΔA＝A 0-A，以ΔA作为测定BSA的信号响应.在选定的B-R缓冲溶液（p H＝5.10）的体系中，茜素红S与BSA相互作用，其UV-Vis光谱见图1.由图1可知，BSA溶液和茜素红S在420 nm处有最大吸收峰，且由于茜素红S与BSA的相互作用，导致体系吸光度发生变化，即随BSA浓度的增加，体系的吸光度显著下降，并且在420 nm处吸收峰的灵敏度最大.所以本文选择420 nm作为测定波长.2.2.1 最佳p H值的选择用不同PH值的B-R缓冲溶液作酸度影响实验，在B-R缓冲介质中不同p H值对体系复合物的影响.按照实验方法取4.00 m L 5.0×10-4 mol／L茜素红S；1.00 m L 100.0μg／m L BSA；3.00 m L B-R缓冲溶液.结果表明，当p H＝5.10时，体系的吸光度ΔA变化最大且最稳定，实验选择p H＝5.10的B-R缓冲溶液作为最佳酸度.2.2.2 茜素红S用量的选择在p H 5.10的B-R介质中，室温条件下研究了茜素红S的用量对实验的影响，实验表明，随着茜素红S用量的增加ΔA先变大后变小.当茜素红S的用量为4.00 m L时，ΔA最大，且体系稳定性好，本实验选择茜素红S用量为4.00 m L.2.2.3 缓冲溶液用量的选择在4.00 m L 5.0×10-4 mol／L茜素红S，p H 5.10的B-R介质中，在室温条件下研究了缓冲溶液的用量对实验的影响，结果表明，当缓冲溶液用量为3.00 m L 时，ΔA最大且比较稳定.本实验选择缓冲溶液用量为3.00 m L.2.2.4 放置时间选择在p H 5.10的B-R介质中，在室温条件下研究了时间对反应的影响，实验结果（如图2）表明该体系的反应速度很快，20 min后ΔA可达到稳定，并在80 min 内ΔA不变，本实验选择20 min后测定体系吸光度.2.2.5 工作曲线的绘制在确定的最佳实验条件下，改变BSA、HSA的加入量，绘制测定BSA、HSA的工作曲线，当BSA、HSA的浓度分别为在0～32.0μg／m L、0～28.0μg／m L时，体系的吸光度与BSA、HSA浓度呈良好的线性关系.其线性回归方程及相关系数分别为A＝0.372-0.006C，r＝0.9987和A＝0.373-0.005C，r＝0.9968.本实验具有较宽的线性范围，用BSA作为标准蛋白质的代用标准进行人血清白蛋白的测定.2.2.6 其他物质的干扰在确定的最佳实验条件下，当体系中含有12.0μg／m L蛋白质时，研究了各种金属离子、蛋白质及氨基酸等干扰因素对测定准确性的影响，结果见表1.试验结果表明，各种常见金属离子、及氨基酸等对BSA的测定基本没有影响.2.2.7 温度的影响由于高温下BSA、HSA会变性，所以本实验只讨论了10～40℃范围内BSA、HSA与茜素红S的反应，结果表明，在室温范围内ΔA很稳定，本实验可在室温下进行.在确定的最佳实验条件下，对人血清样品（淮北市人民医院提供）总蛋白量进行测定，获得较好的结果.结果见表2.基于茜素红S与BSA、HSA结合形成有色化合物而建立一种测定蛋白质含量的新方法，在BSA和HSA浓度分别为0～32.0μg／m L和0～28.0μg／m L内，吸光值与BSA、HSA的浓度呈良好的线性关系，该方法用于实际样品的测定，结果令人满意.【相关文献】［1］杨忠东，郭伟明，沈菲，等.检测人血清白蛋白制品中微量铝荧光分析法的建立［J］.中国生物制药品杂志，2004，17（5）：316-317.［2］宋功武，成耀鹏，何治柯，等.小蘖碱与核酸作用荧光光谱及其分析应用［J］.分析化学，1999，27（1）：44-46.［3］达毛拉·杰力里，黄承志.酚藏花红与DNA作用的共振光散射特征及微量DNA的光散射测定［J］.分析化学，1999，10（27）：1204-1207.［4］胡秋娈，李克安，童沈阳，等.氟磺酸酚与蛋白质作用的分光光度研究［J］.分析化学，1999，27（2）：166-169.［5］迟燕华，李克安，童沈阳.以锌试剂显色法测定蛋白质的研究［J］.高等学校化学学报，1998，19（6）：879-991.［6］肖锡林，王永生，李贵荣，等.甲基胺蓝共振光散射法测定纳克级脱氧核糖核酸［J］.光谱学与光谱分析，2004，2（24）：190-193.［7］李天剑，沈含熙，罗云敬.乙基紫分光光度法测定脱氧核糖核酸［J］.分析化学，1998，11（26）：1372-1375.［8］苏界殊，龙云飞，郑峰.维多利亚蓝B标记分光光度法测定DNA［J］.光谱实验室，2003，20（6）：894-896.。

牛血清白蛋白胶囊释放水凝胶诱导癌细胞死亡的研究

摘要癌症一直是危害人类生命健康的一大杀手。

如何安全有效的治疗癌症一直是科学家们研究的重点。

临床医学上最常用的方法是化疗和放疗，但是都伴随着严重的副作用。

近年来，发现了一些新的治疗癌症的方法，例如基因治疗，光热治疗等。

本论文中，我们将提出一种新的治疗癌症的方法“凝胶治疗方法”，该方法在不利用抗癌药物的前提下，可以选择性地利用肿瘤细胞内部高浓度的谷胱甘肽（GSH），在不需要外界刺激的条件下诱导癌细胞的死亡，避免了对正常组织细胞的副作用。

本文主要是利用牛血清白蛋白胶囊将海藻酸钙凝胶（CaAlg）运输进入癌细胞，在癌细胞内高浓度GSH作用下释放凝胶，引起细胞质的原位凝胶化，从而杀死癌细胞。

具体工作如下：（1）牛血清白蛋白胶囊的构筑：利用聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）和氨基化的牛血清白蛋白（BSA-NH2）反应得到的蛋白质-聚合物耦合体（BSA-NH2/PNIPAAm）作为基元，通过皮克林微乳液法制备蛋白质胶囊。

通过调节基元浓度、超声时间和超声功率等条件制得了结构稳定，尺寸可控的（1.32 μm 左右）蛋白质胶囊。

（2）装载海藻酸钠（NaAlg）的蛋白质胶囊的制备与表征：在蛋白质胶囊中装载海藻酸钠（NaAlg），通过调控钙离子浓度的方法使胶囊内部生成海藻酸钙凝胶，通过SEM、TEM证明了凝胶的生成；然后利用谷胱甘肽诱导胶囊释放凝胶，通过显微镜观察到蛋白质胶囊装载海藻酸钠，生成凝胶和释放凝胶的过程。

（3）利用AFM技术原位检测细胞内部凝胶化过程：利用AFM测试并计算细胞的杨氏模量，通过细胞杨氏模量的变化反应了细胞的生命状态，进一步证明了凝胶形成和凝胶释放的过程。

（4）体外实验：首先研究培养时间和胶囊浓度对细胞内吞作用的影响，然后对人类肝癌细胞（HepG2）和小鼠胚胎成纤维组织细胞（NIT 3T3）分别进行细胞毒性试验（MTT），通过MTT实验检了测细胞活性，对比发现凝胶法使得癌细胞的活性明显下降，而对正常细胞没有太大的影响，说明该方法可以选择性地杀死癌细胞。

牛血清白蛋白的荧光稳定性研究

牛血清白蛋白的荧光稳定性研究陈芳;陈妍;张彦峥;张银堂;徐茂田【摘要】研究了牛血清白蛋白(BSA)在不同条件下荧光发射光谱的稳定性.结果表明,Tris-HCl、PBS和PB等缓冲液种类,常量和微量等石英比色皿类型,对于BSA的荧光稳定性没有明显影响.激发波长260 nm与280nm对于BSA的荧光稳定性有显著性差异.超声和金属离子的干扰,都会导致BSA荧光强度的降低,在5％的误差范围内,各金属离子允许存在的倍数分别为:Cu2+(8),Zn2+ (40),Mg2+(96),Ca2+( 120).本研究对于蛋白质溶液的制备和前处理具有一定的理论和实际意义.%Fluorescence stability of bovine serum albumin (BSA) solutions was investigated under different conditions. The results indicated that buffer solutions,e. G. Tris-HC1,PBS and PB.and quartz cuvettes such as macro- and micro-cuvette did not affect fluorescence stability of BSA. BSA fluorescence showed significant stability diversity when excitation wavelength of 260 nm and 280 nm were used. Fluorescence intensity of BSA may be lowered by ultrasound or metal ions. Within 5% tolerance range of the detection Value,the maximum permissible multiples ofCu2+ ,Zn2+ ,Mg2+ and Ca2+ were 8,40,96 and 120,respectively. This study was of certain theoretic and practical significance for preparation and pretreatment of protein solution.【期刊名称】《应用化工》【年(卷),期】2011(040)009【总页数】4页(P1508-1511)【关键词】牛血清白蛋白;荧光;稳定性;缓冲液;超声【作者】陈芳;陈妍;张彦峥;张银堂;徐茂田【作者单位】商丘师范学院化学系纳米生物分析化学河南省高校重点实验室培育基地,河南商丘 476000;贵州大学精细化工研究开发中心,贵州贵阳 550025;郑州大学化学系,河南郑州 450052;商丘师范学院化学系纳米生物分析化学河南省高校重点实验室培育基地,河南商丘 476000;商丘师范学院化学系纳米生物分析化学河南省高校重点实验室培育基地,河南商丘 476000;郑州大学化学系,河南郑州 450052【正文语种】中文【中图分类】TQ931;O657.7血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，它能与许多内源及外源性化合物结合，起到存储与转运的作用［1］，血清白蛋白与药物分子等小分子之间相互作用的研究一直受到人们的关注［2-5］。

bsa分子直径 -回复

bsa分子直径-回复标题：探索BSA分子直径的奥秘一、引言蛋白质是生命活动的基础，其结构和功能的研究对于理解生命的本质具有重要意义。

牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，简称BSA）作为一种常见的模型蛋白质，被广泛应用于生物化学、免疫学、药物传递等领域。

其中，BSA的分子直径是其物理性质的重要参数，对理解和应用BSA具有关键作用。

本文将详细探讨BSA分子直径的测量方法、影响因素以及其在科研中的应用。

二、BSA分子直径的测量方法1. X射线晶体学X射线晶体学是测定蛋白质分子结构的主要方法之一。

通过解析BSA晶体的X射线衍射图谱，可以精确地确定蛋白质分子的三维结构，进而计算出BSA的分子直径。

然而，这种方法需要获得高质量的蛋白质晶体，且实验过程复杂，耗时较长。

2. 粒子跟踪分析（Particle Tracking Analysis，PTA）PTA是一种基于光散射原理的测量技术，可用于测定溶液中粒子的大小和形状。

通过测量BSA溶液的光散射信号，可以推算出BSA分子的直径。

这种方法操作简便，速度快，但精度相对较低。

3. 电泳光散射（Electrophoretic Light Scattering，ELS）ELS是一种基于电泳效应和光散射原理的测量技术，可用于测定蛋白质的分子量和尺寸。

通过测量BSA在电场中的迁移速度和光散射信号，可以计算出BSA的分子直径。

这种方法精度较高，但需要专门的设备和操作技能。

三、影响BSA分子直径的因素1. 环境条件环境条件如温度、pH值、离子强度等会影响蛋白质的构象和聚集状态，从而影响其分子直径。

例如，高温或酸性环境可能导致蛋白质变性或聚集，使其分子直径增大。

2. 分子修饰通过化学修饰或基因工程手段改变BSA的氨基酸序列或添加标签，可能会影响其分子构象和尺寸。

例如，添加荧光标记或抗体结合位点可能会增加BSA的分子直径。

3. 浓度和溶液性质BSA的浓度和溶液性质（如溶剂种类、添加剂等）也会影响其分子直径。

二氢杨梅素锌与牛血清白蛋白的相互作用

二氢杨梅素锌与牛血清白蛋白的相互作用严赞开;陈冬丹【摘要】运用荧光光谱法研究了二氢杨梅素锌(DMY-Zn)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.结果表明, 激发波长为288 nm 时, BSA的发射峰位于341 nm, DMY-Zn对BSA有较强的荧光猝灭作用.由Stern-Volmer 方程计算出DMY-Zn与BSA 体系荧光动态猝灭常数(KSV)可知, DMY-Zn对BSA内源荧光的猝灭机制属于静态猝灭,由Lineweaver-Burk方程计算出静态猝灭常数为3.180×104 L·mol-1; 且在BSA分子上荧光敏感部位有1个结合位点, 结合常数为9.60×105 L·mol-1.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2010(027)003【总页数】3页(P60-62)【关键词】二氢杨梅素锌;牛血清白蛋白;荧光光谱【作者】严赞开;陈冬丹【作者单位】韩山师范学院化学系,广东,潮州,521041;韩山师范学院化学系,广东,潮州,521041【正文语种】中文【中图分类】O657.3有机小分子与蛋白质等生物大分子结合反应热力学特征的研究,是生命科学研究的重要组成部分[1]。

血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白，它能与许多内源性和外源性物质广泛结合。

二氢杨梅素(Dihydromyricetin, DMY)是藤茶的主要活性成分，属双氢黄酮醇类化合物，在抗菌、降血脂、降血糖、保肝、抗氧化、抗癌、增强免疫等方面具有显著的生理活性[2],其分子结构有较高的超离域度、完整的大π键共轭结构、强配位氧原子和合适的空间构型，可作为金属离子良好的螯合配体。

锌离子是体内许多重要反应酶活性中心的组成部分，许多含锌酶参与碳水化合物、脂肪、蛋白质和核酸的代谢[3]。

黄酮类活性物质与金属形成的配合物，往往具有优于黄酮类化合物的生物活性，二氢杨梅素与金属的络合物的合成及抗氧活性研究已有少量报道[4]，而与生物分子相互作用的研究鲜见报道。

受体介导的叶酸-牛血清白蛋白肿瘤细胞靶向给药系统的研究的开题报告

受体介导的叶酸-牛血清白蛋白肿瘤细胞靶向给药系统的研
究的开题报告
研究背景
肿瘤是人类健康的重要威胁之一，治疗效果存在一定限制，因此开发新型肿瘤治疗方法势在必行。

目前，一些纳米给药系统已被用于肿瘤治疗。

其中牛血清白蛋白（BSA）纳米粒子具有较好的生物相容性和生物降解性，在肿瘤治疗中被广泛研究。

然而，现有的BSA纳米粒子给药系统存在药物转运效率低、药物稳定性差、靶向性不够
等问题。

研究内容
本研究将开发一种新型BSA纳米粒子给药系统，该系统将聚焦于以叶酸为引物
的受体介导的肿瘤细胞靶向性。

具体而言，将选择叶酸作为靶向分子，通过BSA纳米
粒子表面的化学修饰，使其与叶酸有效结合，从而实现肿瘤细胞的靶向输运。

研究方法
本研究将采用化学合成的方法制备BSA纳米粒子，并通过化学修饰方法，在
BSA纳米粒子表面引入叶酸，从而构建具有靶向性的给药系统。

通过扫描电镜、荧光
显微镜、动态光散射仪等实验手段，对制备的靶向性BSA纳米粒子进行形态、大小、
粒散分布等表征分析；再进行体外细胞实验，探究该靶向性给药系统在细胞内的吸收、转运和毒性；最后进行动物体内实验，检测其肿瘤靶向性和治疗效果。

预期结果
本研究将探究一种新型叶酸-BSA纳米粒子给药系统，在肿瘤治疗中的应用前景。

预计，该给药系统将具有较高的靶向性和药物转运效率，能够有效地减轻肿瘤患者的
副作用，并提高治疗效果。

光谱法研究小分子与蛋白质间相互作用的进展

光谱法研究小分子与蛋白质间相互作用的进展顾佳丽;伊鲁东;李东玲;胡雪健;赵恒【摘要】The interaction between small molecules and proteins can influence conformation of protein .The re-search results of binding mechanism play an important role revealing the absorption , distribution , metabolism of ex-ogenous small molecules in vivo .Focused on the application of spectroscopic techniques such as UV-vis spectropho-tometry, fluorescent spectrometry , fourier transform infrared spectrometry and circular dichroism in this field , the characteristics and application of these methods are summarized .And the prospects for the development of binding mechanism between small molecules and protein are also presented .%小分子与蛋白质之间相互作用会影响蛋白质构象变化,研究小分子与蛋白质相互作用的机理,对阐明小分子在生物体内的吸收、分布、代谢等过程具有重要意义.综述了近年来紫外光谱法、荧光光谱法、傅里叶变换红外光谱法和圆二色光谱法等技术在该领域的研究进展,分析了这些方法的特点和应用,展望了外源性小分子与蛋白质之间相互作用的发展前景.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2018(018)014【总页数】6页(P85-90)【关键词】光谱法;小分子;蛋白质;相互作用【作者】顾佳丽;伊鲁东;李东玲;胡雪健;赵恒【作者单位】渤海大学化学化工学院,锦州121013;渤海大学化学化工学院,锦州121013;渤海大学化学化工学院,锦州121013;渤海大学化学化工学院,锦州121013;渤海大学化学化工学院,锦州121013【正文语种】中文【中图分类】O657.3外源性小分子包括药物、食品添加剂、染料、表面活性剂和持久性有机汚染物等。

虎红-牛血清白蛋白共振光散射光谱研究及其分析应用

ｉｔｎｉｙａｄｔｎｏｒｔｉｎｐ３０ＢｂｆｒＴｅｉｆｅｃｓｏＨ，ｙｓｕ，ｕｆｅａｔｉｎｃｓｅｇｈａｄｃｅｉｔｎｎｅｓｔｂｄｉｏｆｐｏｅｎｉＨ．Ｒｕｆ．ｈｎｌｎｅｆＰｙｉｅｕｄｅｔｆｓｒｔｎ，ｏｉｔｎｔｎｏｘｓｔａｈｅｓｂｔｎｅｎｓｇａｒｘｌｒｄｉｏｅａｌＴｅｓａｔｒｇｉｔｎｉｆｔｅｓｓｍｓｐｏｏｔｎｌｔｈｏｃｎｒｔｎｏｕｓａｃｓＯｉｎｌｗｅｅｅｐｏｅｎｓｍｅｄｔｉｈｃｔｉｎｅｓｔｏｈｙｔｗａｒｐｒｏａｏｔｅｃｎｅｔｉｆ．ｅｎｙｅｉａｏ
虎红一牛血清白蛋白共振光散射光谱研究及其分析应用
李琼，宋九华贺莉，
（．乐山师范学院化生学院，１四川乐山６４０；１０４
２．农业部沼气科学研究所，四川
成都
６０６）１０４
摘要：于在ｐ３０的Ｂ基Ｈ．Ｒ缓冲溶液中蛋白质的加入使虎红的共振光散射信号增强，立了一种蛋白质测定建
关键词：虎红；白质；蛋共振光散射；荧光
中图分类号：６７３０５．文献标识码：Ａ
ＳｔｙｏｅｏａｃｉｈｔｓａｔｒｎｇｏｓｎａｕｄｆｒｓｎｎｅｌｇｃｔｅｉｆＲｏｅＢｅｇｌＮａｓｌ－ｖｎｅｓｒａｔＢｏｉｅｕｍｌｕｉｎｄｉｓａａｙｉａｐｉａｉｎａｂｍｎａｔｎｌｔｃｌａｐｌｔｏｃ

荧光、圆二色及共振光散射光谱研究熊果酸与牛血清白蛋白的相互作用

荧光、圆二色及共振光散射光谱研究熊果酸与牛血清白蛋白的相互作用丁兰;彭舒;柳志军;腾秀兰;令利军【摘要】利用荧光光谱(FS)、紫外吸收光谱(UV)、圆二色谱(CD)和共振光散射谱(RLS)研究熊果酸(UA)与牛血清白蛋白(BSA)相互作用.荧光光谱显示,熊果酸能与BSA分子相结合,结合位点数为0.912 4,结合常数为0.693 4×103 L·m01-1,能量转移效率为0.036,结合距离为1.43 nm,并导致BSA荧光产生静态淬灭,其淬灭主要由色氨酸所贡献,并随熊果酸的浓度增高相应淬灭作用增强；紫外和圆二色光谱显示,熊果酸对BSA的紫外吸收峰具有增色效应,并减少BSA中α-螺旋含量,由56.72％减少至39.08％,使BSA的二级结构发生显著变化；共振光散射光谱显示,熊果酸使BSA分子聚集形成分子聚集体.【期刊名称】《西北师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(049)001【总页数】9页(P78-85,95)【关键词】熊果酸;牛血清白蛋白;荧光光谱;圆二色光谱;共振光散射【作者】丁兰;彭舒;柳志军;腾秀兰;令利军【作者单位】西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070;西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070;西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州 730070;西北师范大学化学化工学院,甘肃兰州 730070;西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州730070【正文语种】中文【中图分类】O657.3我国的香茶菜属植物（Radbosia）资源极为丰富，约有90余种，许多种类一直作为民间用药［1］，某些种类已经开发成为市售药［2］.迄今为止，已对约70多种香茶菜属植物进行了植物化学研究，研究表明，该属植物除了含有丰富的对映－贝壳杉烷类二萜化合物外，还含有大量的乌苏烷型和齐墩果烷型三萜类化合物，而熊果酸（UA）则是其中含量最为丰富的三萜酸之一［3］.熊果酸也大量存在于其它植物之中，如接骨木属、双蝴蝶属和桉属等，并且，从中分离得到的熊果酸被确定为这些植物保肝的有效成分［4］.此外，大量的研究证实熊果酸还具有抗炎［5］、抗HIV［6］、抑制细胞增殖［7］、诱导细胞凋亡［7］、抗癌［8］、抗氧化［9，19］和镇静［10］等药理活性.目前，含有丰富熊果酸的中草药在临床上大量使用［11］，但关于熊果酸的多种药理学机制还知之甚少.因此，在不同的研究层面以及利用不同的研究手段系统深入地研究熊果酸的相关作用机理，对于该化合物的深度开发和利用具有重要意义.蛋白质是最重要的生物大分子之一，在细胞内外有上千种之多，在生命活动中担负着众多功能.药物分子进入有机体后会与多种蛋白质分子相互作用，并通过特异性的靶蛋白发挥其药理学功能.牛血清白蛋白（BSA）是血浆中含量最丰富的载体蛋白，它具有结合及运输内源和外源性物质的作用［12］，牛血清白蛋白与其它蛋白具有相似的基本单元结构，如氨基酸组成及二级结构，同时其高级结构也已阐明，因而它是研究高分子蛋白质理化性质、生物学功能的理想蛋白质［13，14］.紫外吸收光谱（UV）、荧光光谱（FS）、圆二色谱（CD）和共振光散射谱（RLS）等方法被广泛应用于蛋白质与小分子药物分子相互作用的研究［15］，从分子层面解析了药物分子对蛋白质结构的影响，这对于阐明药物分子的作用机理有重要意义.本课题组一直从事香茶菜属植物的植物化学［16］、抗癌［7，17］和抗氧化研究［18］. 从甘肃产香茶菜属植物中分离得到大量的熊果酸［19，20］，进一步的药理学研究表明，该化合物具有良好的抗癌细胞增殖、诱导凋亡及抗氧化能力［7，17，18］，这表明该化合物对于香茶菜属植物的抗癌活性具有较大的贡献.关于熊果酸与BSA相互作用的光谱学研究报道极少，仅有张璐颖等［21］运用荧光光谱研究了BSA与熊果酸结合反应中蛋白质的折叠变化型态以及金属离子Ni （Ⅱ）存在下的反应机制.本课题组在此基础上应用紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱、共振光散射谱及其二维光谱，进一步研究了熊果酸对牛血清白蛋白的一级结构、二级结构的影响，为最终阐明该化合物的抗癌和抗氧化等药理学机制提供相关的分子相互作用信息.1 材料与方法1.1 仪器与试剂LS－55荧光分光光度计（美国PE公司）；UV－1800紫外分光光度计（日本岛津公司）；J－810型圆二色光谱仪（日本JASCO公司）；pHS－3C型酸度计（上海雷磁仪器厂）.牛血清白蛋白（美国AMRESCO公司）用Tris－HCl缓冲溶液（10mmol·L－1，含有50mmol·L－1 NaCl以维持离子强度，pH＝7.4）分别配置成1×10－4 mol·L－1储备液和1×10－5 mol·L－1储备液，4℃保存.熊果酸由本实验室自甘肃产蓝萼香茶菜中分离得到［4］，分别用甲醇配置20mmol·L－1储备液，二甲基亚砜（DMSO）配置200mmol·L－1储备液，4℃保存，测试时用Tris－HCl缓冲溶液稀释使用；实验室用水为3次蒸馏水；其余试剂均为分析纯.1.2 实验方法1.2.1 紫外吸收光谱测定分别向10mL比色管中加入1mL BSA（1×10－4 mol·L－1）溶液及不同浓度熊果酸（甲醇溶解），用Tris－HCl缓冲溶液定容至10mL，比色管中熊果酸与BSA的摩尔比分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1.每个测试组均含1%甲醇.20℃孵育1h后，移取至1.0cm石英比色皿，以含1%甲醇的Tris－HCl缓冲溶液为参比，扫描190～320nm波长范围内紫外吸收光谱.1.2.2 荧光光谱测定分别向10mL比色管中加入1mL BSA（1×10－4 mol·L－1）溶液及不同浓度熊果酸（因甲醇是荧光物质，对BSA荧光测定产生影响［20］，故选用DMSO作为熊果酸的助溶剂），用Tris－HCl缓冲溶液定容至10mL，比色管中熊果酸与BSA的摩尔比分别为2.5∶1，5∶1，10∶1，15∶1，20∶1.每个测试组含0.1%DMSO.20℃孵育1h后，移取至1.0cm石英比色皿，以λex＝282nm为激发波长，狭缝宽Em＝Ex＝5nm，扫描300～450nm波长范围内的荧光光谱.1.2.3 同步荧光测定分别向10mL比色管中加入200μL BSA（1×10－4 mol·L－1）溶液及不同浓度熊果酸（DMSO溶解），用Tris－HCl缓冲溶液定容至10mL，比色管中熊果酸与BSA的摩尔比分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1.每个测试组含0.1%DMSO.20 ℃ 孵育1h后，移取至1.0cm石英比色皿，以狭缝宽Δλ＝15nm，Em＝Ex＝10nm，扫描速度100nm·min－1，扫描260～350nm波长范围内的同步荧光；Δλ＝60nm，以狭缝宽Em＝Ex＝3.5nm，扫描速度100nm·min－1，扫描260～350nm波长范围内的同步荧光光谱.1.2.4 圆二色谱测定分别向10mL比色管中加入200μL BSA（1×10－5 mol·L－1）溶液及不同浓度熊果酸（甲醇溶解），用Tris－HCl缓冲溶液定容至10mL，比色管中熊果酸与BSA的摩尔比分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1.每个测试组含0.1%甲醇.20℃孵育1h后，移取至1.0cm石英比色皿，以含有0.1%甲醇的Tris－HCl缓冲溶液作为参照，在200～250nm波长范围内进行扫描.1.2.5 共振光散射谱测定分别向10mL比色管中加入200μL BSA（1×10－5mol·L－1）溶液及不同浓度熊果酸（DMSO溶解），用Tris－HCl缓冲溶液定容至10mL，比色管中熊果酸与BSA的摩尔比分别为5∶1，10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1.每个测试组含0.03%DMSO.20℃孵育1h后，移取至1.0cm石英比色皿，以λex＝λem （Δλ＝0nm），狭缝宽度Ex＝10nm，Em＝20nm，扫描速度100nm扫描250～650nm波长范围的RLS谱.2 结果与讨论2.1 紫外吸光光谱蛋白质由20种常见氨基酸组成，在其紫外吸收光谱中，除芳香族氨基酸，如酪氨酸和苯丙氨酸以及含硫的氨基酸外，其余大部分氨基酸在230～310nm范围内没有吸收峰［22］.BSA在275nm处的特征吸收峰主要是由于BSA肽链中19个酪氨酸和2个色氨酸的芳杂环n－π＊和π－π＊跃迁引起的［23］.本实验以甲醇为助溶剂，各测试组均含1%甲醇，如图1所示，1%甲醇对BSA紫外吸光值有微弱影响.图2为BSA与熊果酸相互作用的吸收谱图，BSA在278nm处有紫外吸收峰.BSA溶液与不同浓度的熊果酸共同孵育1h后，BSA的紫外吸收峰均表现为明显的增色效应，并随着熊果酸浓度的提高其相应吸收峰的强度也增加.这可能是由于熊果酸使蛋白质肽链伸展，蛋白质内部氨基酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来，疏水基团之间的疏水作用减弱，使得吸收峰强度增强［24］.图1 1%甲醇溶液与牛血清白蛋白相互作用的紫外吸收光谱Fig 1UV spectra of 1%methanol compounds－BSA solutions图2 熊果酸与牛血清白蛋白的紫外吸收光谱Fig 2Effect of ursolic acid on the absorption spectra of BSA2.2 荧光光谱2.2.1 荧光光谱色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸这3种芳香族氨基酸荧光强度差异很大（100∶9∶0.5），这主要是由于它们结构的不同造成的［25］.由于色氨酸和酪氨酸在蛋白质中比例最大，荧光强度最大.因此，本实验主要研究熊果酸对BSA中这2种氨基酸的影响.因助溶剂甲醇荧光峰对BSA干扰较大［26］，故用DMSO作为助溶剂.测试样品中均含有0.1%DMSO，如图3所示，0.1%DMSO对BSA的荧光强度无影响.在浓度为1×10－5 mol·L－1的BSA溶液中加入不同量的熊果酸，测试BSA的荧光发射光谱，结果如图4所示.随着熊果酸浓度的增加，BSA的荧光发射强度逐渐下降，这表明BSA的荧光逐渐淬灭，且荧光的最大发生峰在342nm 附近，没有发生明显位移，该现象表明BSA与熊果酸发生了相互作用［27］.究其原因，极可能是BSA的空间构象发生变化导致氨基酸残基的疏水性降低而引起［28］.图3 0.1%二甲基亚砜与牛血清白蛋白的荧光光谱Fig 3Fluorsence spectra of0.1%DMSO compounds－BSA solutions图4 熊果酸与牛血清和白蛋白的荧光光谱Fig 4Effect of Ursolic acid on fluorescence spectra of BSA2.2.2 荧光淬灭方式溶液荧光的淬灭，是指荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学的作用过程.荧光物质分子同淬灭剂相互作用方式的差异，导致了不同的淬灭方式，如动态淬灭、静态淬灭和电荷转移淬灭等多种形式.静态淬灭是淬灭剂和荧光物质分子在基态时发生配合反应所引起的一种淬灭过程；动态淬灭是淬灭剂和荧光物质的激发分子之间发生相互作用而引起的一种淬灭过程［29］.动态淬灭过程符合Stern－Volmer方程其中，F0是未加入淬灭剂时的荧光强度；F是加入淬灭剂后的荧光强度；Kq是双分子淬灭过程速率常数；KSV是Stern－Volmer动态淬灭常数；CQ是淬灭剂的浓度；τ0是淬灭剂不存在条件下生物大分子的平均荧光寿命（约为10－8 s）［30］.为确定熊果酸与BSA的淬灭机理，首先用Stern－Volmer方程处理，熊果酸与BSA荧光淬灭的F0／F与CQ的关系如图5所示.图5 熊果酸对牛血清白蛋白荧光淬灭的Stern－Volmer曲线Fig 5Stern－Volmer plots for fluorescene quenching of BSA由Stern－Volmer曲线计算得到，BSA的KSV＝0.135×104 L·mol－1（R＝0.983 8）.双分子淬灭过程速率常数Kq＝KSV／τ0，且无淬灭剂时生物大分子的平均荧光寿命τ0＝10－8 s［29］，＝0.135×1012 L·mol－1·s－1.由于生物大分子的最大动态淬灭常数为2.0×1010 L·mol－1·s－1［30］，本实验体系中双分子淬灭过程常数大于最大动态淬灭常数，说明熊果酸对BSA的淬灭是由于形成复合物而引起的静态淬灭［31］，这个结果同已报道的结果一致［21］.本实验得到的Kq值小于张璐颖等［21］报道的结果（K＝0.189 3×1013 L·mol－1·s－1），这可能主要归q咎于两者所选用测试缓冲溶液、助溶剂以及熊果酸的浓度存在差异.即本实验所用Tris－HCl缓冲溶液的浓度较之报道中的浓度小5倍，其中所含NaCl浓度也较之小2倍.2.2.3 熊果酸和牛血清白蛋白相互作用的结合位点数在静态淬灭过程中，荧光物质与淬灭剂分子之间的结合常数可以通过静态淬灭公式（2）计算：其中，F0是未加入淬灭剂时的荧光强度；F是加入淬灭剂后的荧光强度；K是结合常数；CQ是配合物的浓度；n是结合位点数.得到lg（F0／F－1）与lgCQ 的关系（图6）和相关方程：lg［（F0－F）／F］＝2.841＋0.912 4lgCQ（R＝0.981 07）.图6中曲线的斜率代表化合物与BSA的结合位点数n值，n＝0.912 4.而曲线的截距代表化合物与BSA的结合常数K 值，K＝0.693 4×103 L·mol－1.这个结果远小于已报道的结果［21］，本实验所使用的Tris－HCl缓冲溶液浓度较小，里面含有的NaCl浓度也较小，选用测试温度20℃，以上实验体系存在的差异，可能导致熊果酸与BSA相互作用结果存在较大差异.图6 lg（F0／F－1）与lgCQ 的关系Fig 6Plot of lg（F0／F－1）versus lg CQ 2.2.4 熊果酸－牛血清白蛋白的结合距离为了确定蛋白质与药物分子间的荧光发射残基的距离和能量转移效率，依据Fōster的非辐射能量转移机理［32，33］，对实验进行进一步分析.根据Fōster的理论，荧光发射体和荧光淬灭体之间的距离、临界能量转移距离和能量转移效率符合方程其中，E为能量转移效率；R0为临界能量转移距离；r为荧光发射体和荧光淬灭体之间的距离.R0－E＝50%时的临界能量距离.其中，K为偶极空间取向因子；N为介质的折射指数；φ为受体的光量子效率；J为授体荧光发射光谱与受体吸收光谱间的光谱重叠积分（cm3·L·mol－1）其中，F（λ）为荧光授体在波长λ处的荧光强度；ε（λ）为受体在波长λ处物质的能量吸收系数（L·（mol·cm）－1）.由公式（5）计算光谱重叠积分，JBSA＝1.46×10－18 cm3·L·mol－1.在本实验中，取偶极空间取向因子（K）为两结合物各向随机分布的平均值，即K2＝2／3［32］，光量子效率（φ）取色氨酸标准值，即φ＝0.13［34，35］，折射指数（N）分别取 N水＝1.33和N有机物＝1.39的平均值 N＝1.36［32］.将上述各数值带入（4）式可求得BSA临界能量距离R0＝0.56nm.由得到EUA－BSA＝0.036.由（3）式求得BSA中色氨酸残基与熊果酸之间的距离为rUA－BSA＝1.43nm.2.3 同步荧光光谱图7 牛血清白蛋白和熊果酸相互作用的同步荧光光谱Fig 7Synchronous fluorescence spectra with ursolic acid－BSA同步荧光光谱因其图谱简单、谱带窄、能够减少光谱重叠等优点，可用来研究小分子与蛋白质相互作用对蛋白质构象产生的影响［36］.Δλ＝15nm是酪氨酸残基的荧光，Δλ＝60nm是色氨酸残基的荧光.由图7可知，在Δλ＝60nm时（图7：A），BSA的同步荧光强度随着熊果酸浓度的逐渐增加而减小，而在Δλ＝15nm 时（图7：B），BSA的同步荧光强度随着熊果酸浓度的增加而增加，说明BSA 与熊果酸发生淬灭主要是色氨酸残基的贡献.2.4 圆二色谱BSA因其结构的不对称性而具有光学活性，圆二色谱（CD）是研究稀溶液条件下生物大分子二级结构的重要手段.蛋白质的CD光谱通常分为250～320nm的近紫外区CD光谱和178～250nm的远紫外区CD光谱.具有典型α－螺旋构象的分子其CD光谱在195nm处有正特征峰，在222nm和208nm处分别有负特征峰［37］（图8）.本实验主要通过对CD谱208nm处的特征峰强度进行计算，分析BSA与熊果酸相互作用时BSAα－螺旋的变化，进而推证熊果酸对BSA构象的影响.实验中使用含有0.5%甲醇作为助溶剂，该浓度的甲醇对BSA的CD光谱没有影响（图8）.由图9可知，伴随熊果酸浓度逐渐增加，BSA在208nm和222nm 处负峰的强度逐渐减小，说明BSA中α－螺旋发生了变化.由图8 0.5%甲醇溶液与BSA相互作用的圆二色谱Fig 8CD spectra of0.5%methanol compounds－BSA solutions图9 不同浓度的熊果酸与牛血清白蛋白相互作用的CD谱Fig 9Effect of ursolic acid on the CD of BSA计算出BSA二级结构中α－螺旋含量（表1）.表明随着熊果酸浓度逐渐增加，BSA的α－螺旋逐渐减少，BSA的构象变得疏松.表1 不同浓度熊果酸对牛血清白蛋白二级结构α－螺旋含量的影响Tab 1Affectof various concentrations of the ursolic acid on α－helix content of BSA’s secondary structure56.72 53.40 50.66 43.95 39.08 5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 α－螺旋α－helix／%测试溶液Solutions n（Ursolic acid）∶n（BSA）BSA（2×10－7 mol·L－1）2.5 共振光散射谱共振光散射强度与体系电子密度起伏有关，通过共振散射强度可以表征聚合物体系的微观结构信息.这种方法常用于生物大分子的生化研究［38－41］.RLS光谱通常位于或是靠近分子吸收带，RLS信号的产生与溶液中形成聚集有关，其程度决定于溶液中粒子的直径［42］.本实验体系中含有0.03%DMSO，该浓度的DMSO对BSA的RLS强度有轻微影响.如图10所示，a谱线是BSA（2.0×10－7 mol·L－1）的RLS强度，b谱线是熊果酸（2.0×10－7 mol·L－1）的RLS强度，c到h谱线是BSA与不同浓度熊果酸相互作用的RLS强度.由图11可知450nm处有最大散射峰，随着熊果酸浓度逐渐增大，体系的RLS的强度也逐渐增大.可以说明，由于复合物的生成，BSA／熊果酸体系的RLS强度增大，并且随着熊果酸浓度的增大，BSA与熊果酸之间的结合越来越多.图10 0.03%二甲基亚砜与牛血清白蛋白的共振光散射谱Fig 10RLS spectra of 0.03%DMSO compounds－BSA solutions为了更进一步探究复合物大分子在外扰下，分子内各个官能团、结构单元发生变化的先后关系［42］，将光谱信号扩展到二维上分析.数据导入2Dshige 软件（2Dshige（C）Shigeaki Morita，Kwansei－Gakuin University，2004—2005）进行处理，分别计算得到二维同步和异步光谱（图12）.根据Noda的理论［44］，由同步二维光谱（图12（a））可知，在127nm，282nm，366nm处有自相关峰.结合RLS谱分析，外界扰动在366nm处有明显的变化.异步二维光谱（图12（b））中没有观察到明显的相关峰，可能是由于淬灭速率没有发生明显差别所造成的.二维谱分析说明，越靠近分子最大吸收处（366nm），RLS谱变化越快，分子间相互作用越强.图11 熊果酸与牛血清白蛋白的共振光散射谱Fig 11Effect of ursolic acid on the RLS of BSA图12 熊果酸与BSA相互作用的二维共振光散射光谱Fig 12 2DRLS correlation spectroscopy of the interaction of BSA and ursolic acid in different concentration3 结论利用紫外吸收光谱、荧光光谱、圆二色谱、共振光散射谱对从甘肃产蓝萼香茶菜中分离得到熊果酸与BSA相互作用进行了较为系统的分析.实验结果表明，熊果酸与BSA之间生成不发荧光的复合物而导致了静态淬灭，熊果酸与BSA之间的结合位点数为0.912 4，结合常数K值为0.693 4×103 L·mol－1，能量转移效率为0.036，结合距离为1.43nm.这些数据说明熊果酸与BSA相互作用结合距离较长，结合强度较弱，BSA与熊果酸相互作用主要是色氨酸的贡献.紫外和圆二色谱显示，熊果酸使BSA二级结构发生变化，α－螺旋显著减少，肽链伸展，疏水基团裸露，疏水作用减弱；同时，共振光散射实验证实，熊果酸还导致BSA分子间的聚集，在溶液中形成了较大的分子聚集体，RLS二维分析说明，越靠近366nm分子最大吸收处，分子间相互作用越强.这些实验结论在分子层面解释了熊果酸和BSA的相互作用规律，为最终阐明熊果酸的药理学机理提供了科学依据.参考文献：［1］孙汉董，许云龙，姜北.香茶菜属植物二萜化合物［M］.北京：科学出版社，2001.［2］冀春茹，袁珂，胡润淮，等.复方冬凌草含片的质量标准研究［J］.中国实验方剂学杂志，1997，3（6）：7－10.［3］桂明玉，金永日，王宝珍.蓝萼香茶菜化学成分研究［J］.中国药学杂志，1999，34（8）：12－14.［4］LIU Jie.Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid［J］.Journalof Ethnopharmacology，1995，49（2）：57－68.［5］CARLO F，MARIO P，GIORGIO P.Synthesis and anti－ul－cer activityof new derivarives of glyeyrrhetic，oleanolic and ursolic acids［J］.IL 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用荧光和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血清白蛋白的相互作用

Ｆｒｈｒｒ，ｅｂｎｉｇｄｓｃｆ．６ａｗａｂａｎｄｂｔｅｔｎｄｚｌｄｂｖｎｅｕａｂｍｉａｅｎｕｔｅｍｏｅｔｉｄｎｉｔｅｏ１ｍｓｏｔｉｅｅｗｅｎｍｅｏｉａｏｅａｏｉｅｓｒｍｕｎｂｓｄｏｈｎａ３ｒｎｌｈｃａｓｔｅｍｅｈｉｏ￣ｓｒｎｎｒｄａｉｎｅｅｇａｓｅ．ｅｅｆｃｆｔｎｄｚｌｎｔｅｃｎｏＴａｉｎｏＡｓｎｍｆＦＳｔｏ —ａｉｔｎｒｙｔｒｅｏｒｎｆｒＴｆｅｔｒｉａｏｅｏｏｆＩｔｆｈｏｍｅｏｈｎｏＢＳｗａ
【ｔ】Ｎｏｅ
用荧光和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血清白蛋白的相互作用
李晓燕
（山师范学院化学与生命科学系，乐四川乐山６４０）１０４
摘要：用荧光光谱和共振光散射光谱对甲硝唑与牛血清白蛋白的作用进行了对比研究，测定了该反应的结合常数、结合位点数、探讨了甲硝唑对牛血清白蛋白荧光和共振光散射猝灭的机理．利用热力学参数确定了分子问
的作用力性质；根据非辐射能量转换机制，确定了甲硝唑一牛血清白蛋白间的结合距离．采用同步荧光技术考察
了甲硝唑对牛血清白蛋白构象的影响、
关键词：甲硝唑；牛血清白蛋白；荧光光谱；共振光散射光谱
中图分类号：０４，０５．，Ｒ６．６４６７３９９２

荧光铁载体与牛血清白蛋白作用的光谱研究_安鸣

８］处的吸光度确定其浓度［．
１．２．２实验步骤吸收光谱在Ｃ使用光程为１ｃ选择ａｒ５０Ｂｉｏ型紫外分光光度计上测定，ｍ的石英比色皿进行测定，ｙ－１ ·Ｌ，温度２５０ｍｍｏｌＨ８．０的Ｔｒｉｓｌ缓冲液做空白，５℃．－ＨＣｐ ·Ｌ－１荧光光谱的测定在Ｖ移取１ａｒｉａｎＣｒａＥｃｌｉｓｅ荧光光谱仪上测定，．５ｍＬ、８．０、５０ｍｍｏｌＴｒｉｓＨ－－ｙｐｐ）逐次用荧光铁载体（溶液进行荧光滴定并反应３ｍ以ＨＣｌ缓冲溶液配制的ＢＳＡ于１ｃｍ石英池中，Ｐｖｄｉｎ，激发和发射狭缝宽度分别为５ｎ电压为６２９０ｎｍ为激发波长，ｍ和１０ｎｍ，００Ｖ．荧光寿命的测定在Ｅ用时间关联单光子计数法测定．用ＬｄｉｎｂｕｒｈｎＦ９００荧光仪上进行，ｕｄｏｘＨＳ３０－ｇ，硅溶胶散射液来收集记录仪器响应（激发和发射波长分别选定为４ＩＲ）０５ｎｍ和４６０ｎｍ．
ＳｅｃｔｒａｌＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆＰｏｖｅｒｄｉｎｅａｎｄＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎｐｙ
１２１２，ＡＮＭｉｎＸＵＣａｉｈｏｎＭＥＮＧＪｉｎａｎＹＡＮＧＢｉｎｓｈｅｎｇ，ｇ，ｇｙｇ

牛血清白蛋白粒径及团聚作用

1介绍牛血清白蛋白（BSA）是一种小的稳定且中等程度的非反应性蛋白质，通常用作实验室蛋白质浓度标准，在各种免疫测定中用作阻断剂或作为细胞培养补充剂。

作为牛血中最丰富的血清蛋白，养牛业的副产品，BSA是一种相对便宜且易于获取的化合物。

根据文献，BSA标准粒径是7.1nm、分子量是66.5kDa。

牛血清白蛋白在压力条件下显示出自然的二聚趋势，BSA二聚体的分子量是132kDa。

磷酸盐缓冲盐水（PBS）是一种水基盐溶液，与哺乳动物细胞等渗，可将pH值稳定在中性值（通常pH7.4）。

缓冲液广泛用于溶解蛋白质，重悬细胞或作为生物样品的运输溶液。

为了突出样品制备方法对溶解蛋白质结构的影响，我们溶解纯的BSA在去离子水或PBS中。

我们接下来比较两种BSA溶液用Litesizer™测试的粒径和分子量数值。

2实验设计制备了两种不同的BSA储备溶液。

样品1包含BSA（≥96%，通过冷乙醇分馏获得）溶解于0.2um过滤的去离子水。

样品2包含相同来源的BSA溶解于PBS（0.01M，pH7.4）每个样品制备四种不同浓度（8，4，2和1mg/mL），在25℃通过Litesizer™ 500在石英池中进行测试。

对于粒径测试，使用8mg/mL样品。

运行回合数、测试角度和滤光、聚焦位置由仪器自动确定。

分子量测试用侧向散射dn/dc比例0.185mL/g进行。

四个不同的BSA浓度用于生成德拜图。

甲苯用作参考物质。

粒径和分子量测试都重复三次。

3结果与讨论3.1粒径结果Litesizer用动态光散射（DLS）来计算悬浮颗粒的水合动力学直径。

如图1，溶解于水的BSA显示双峰的粒径分布，正如光强粒径分布曲线可见的两个明确的峰。

第一个峰对应平均粒径小于3nm，远小于BSA单体预期的7nm，第二个峰平均粒径是22nm，大于BSA二聚体预期的粒径值。

因此，BSA单体和BSA二聚体在这个样品中都不能观察到。

这表明一定程度的变性或团聚发生。

图1 去离子水溶解的BSA光强粒径分布相反，PBS溶解的BSA样品DLS结果显示清晰的单峰粒径分布（图2）。

蛋白质与小分子相互作用的研究

蛋白质与小分子相互作用的研究
介绍了一个内容开放式的仪器分析实验，涉及生命科学和分析化学领域的研究热点：小分子和蛋白质的相互作用研究。

该实验需用到的仪器为荧光分光光度计，拓展实验部分需用到的仪器为紫外-可见分光光度计和傅里叶红外光谱仪。

学生可以结合自己的需求和兴趣，自选蛋白质和小分子体系，不仅可以将科研热点融入基础实验教学，还可以最大化地发挥学生的主观能动性，培养学生独立分析问题、解决问题的能力。

研究蛋白质与小分子物质之间的相互作用，不仅可以揭示二者相互作用的配位本质，而且对改进和发展分析蛋白质的新方法有促进作用，是超分子化学、蛋白质组学等研究领域的重要课题。

本论文采用荧光、共振光散射、化学发光等分子光谱法，以溶菌酶，肌红蛋白和牛血清白蛋白为模型蛋白，研究这三种蛋白质与小分子物质的相互作用机理。

牛血清蛋白稀溶液的粘度研究

adsorbed m olecule on the capillary wall
bads
b exclusion b e ff
Flowing m olecule in solution
图 5 在 BSA 粘度测量过程中吸附分子的有效吸附层厚度示意图 Fig 5 Schematic illustration of the effctive adsorption layer thickness during the viscosity measurement

牛血清蛋白稀溶液的粘度研究1
李艺 1，蔡正春 1，程镕时 1,2
1 南京大学化学化工学院，南京 (210093) 2 华南理工大学材料科学与工程学院，广州 (510640)
E-mail：rscheng@
摘要：本文测量了 15-40℃之间不加盐的牛血清蛋白水溶液的粘度随浓度的变化，发现：牛血清蛋白是一种“硬蛋白”，从特性粘数估算出的分子尺寸随温度的变化很小，它在毛细管玻璃内表面的吸附量很低。自缔合常数在所有温度下都为零，证实了它难于聚集的特点。牛血清分子吸附后会发生构象变化，表现为分子变“扁”。当温度降低吸附量增大后，吸附层的厚度出现了先减小后增大的现象，考虑到牛血清蛋白在界面以单层吸附为主的特点，我们推测由于分子在界面上随着温度降低进一步铺展，导致吸附层的平均高度降低。其后吸附层的厚度的增大是由于单层吸附量达到最大饱和值后开始出现多层吸附所致。有效吸附层厚度远大于分子在溶液中的尺寸，是由于分子之间存在库仑斥力，导致吸附分子和流动分子之间存在一个排斥层。关键词：粘度，牛血清蛋白，吸附ml来自gCa×105, g/ml
A×105 Km
g/ml
15
0.00460 229.3 8.6042

荧光光谱法研究左氧氟沙星、拉米夫定同时与牛血清白蛋白的相互作用

荧光光谱法研究左氧氟沙星、拉米夫定同时与牛血清白蛋白的相互作用胡威;付彩霞;黄玉玲【摘要】在模拟生理条件(pH值为7.40的Tris-HCl缓冲溶液)下,应用荧光光谱法研究了左氧氟沙星和拉米夫定对牛血清白蛋白(BSA)的荧光猝灭过程.结果表明:BSA 与2种药物发生强烈猝灭,主要是静态猝灭;2种药物之间存在着相互作用,一种药物的存在提高了另一种药物与BSA之间结合的稳定性,减少了游离药物含量,药效降低.左氧氟沙星和拉米夫定之间的相互作用为临床合理用药提供了帮助.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2014(031)004【总页数】3页(P29-31)【关键词】荧光光谱法;左氧氟沙星;拉米夫定;牛血清白蛋白【作者】胡威;付彩霞;黄玉玲【作者单位】滨州医学院化学教研室,山东烟台264000;滨州医学院化学教研室,山东烟台264000;滨州医学院化学教研室,山东烟台264000【正文语种】中文【中图分类】O657.34左氧氟沙星（LVFX），具有广谱抗菌作用，毒性小，疗效高，是目前临床上广泛应用的新一代喹诺酮类药物，通过抑制细菌DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ活性，阻止细菌DNA的合成和复制。

拉米夫定（LMVD），是新一代核苷类抗病毒药，强烈抑制逆转录酶活性，在细胞内经磷酸化后与脱氧胞嘧啶核苷（dCTP）竞争，掺入合成的DNA链中，使病毒不能继续延伸而终止复制［1－2］。

作者在此采用荧光光谱法研究左氧氟沙星和拉米夫定同时与牛血清白蛋白的相互作用，拟为临床合理用药提供指导［3－4］。

1 实验1.1 试药与仪器牛血清白蛋白第五组分，上海生物工程有限公司；拉米夫定，杭州创世纪医药科技有限公司；左氧氟沙星，浙江医药股份有限公司新昌制药厂；三羟甲基氨基甲烷（Tris），北京拜尔迪生物技术有限公司；0.1mol ·L－1 NaCl水溶液，烟台中环化学试剂有限公司。

KQ－600TDE型超声波清洗仪，昆山舒美超声仪器有限公司；AR1140型电子分析天平，ohaus，corp.pineBrook Nj USA；LS55型荧光／磷光／发光分光光度计，美国Perkin－Elmer公司；比色管（10mL）。

牛血清蛋白标准曲线

牛血清蛋白标准曲线各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢牛血清蛋白表酚法定制牛血清蛋白及测定人体血清蛋白加样操作表01234567样1样2试管编号200ug/mL牛血清蛋白标准液1mol/1000mL人血清蛋白磷酸缓冲液以上各管均加入，振荡均匀后，反应15min Folin酚乙以上各管均加入，振荡均匀后，55℃水浴反应25minA650nm实测OD值表酚法定制牛血清蛋白标准曲线，微机数据处理表0123456试管编号标准牛血清蛋白呈色浓度A650nm实测OD值回归方程对应OD值线性回归方程斜率a线性回归方程截距b线性回归方程实验相关性=+凝血酶原时间标准曲线半定量测定纤维蛋白原含量的方法的临床应用凝血酶原时间标准曲线半定量测定纤维蛋白原含量的方法的临床应用孙彦平1杨光2(11黑龙江省鸡西市矿业集团总医院,黑龙江鸡西158100;21黑龙江省林业总医院,黑龙江150040)〔文章编号〕1002-2376(xx)02-0017-02〔中图分类号〕TH773〔文献标识码〕B〔摘要〕目的:利用Controlplasma 建立一种简便、易于临床实验室开展的半定量纤维蛋白原(FiB)检测方法,并对其初步评价。

方法:用亚硫酸钠手工法检测不同浓度FiBReferenceplasma血浆的FiB含量,用其为参比血浆,用半自动血凝仪测其PT凝固时间及吸光度,建立PT凝固时间(s)参比血浆浓度(%)的曲线1,及FiB含量(g/L)与吸光度(E)的标准曲线2。

利用标准曲线测定待检血浆FiB的含量(g/L)。

结果:血浆FiB含量与PT(s)及吸光度(E)有很好的相关性(r=01992)。

单种试剂本法测定Controlplasma血浆FiB值,重复性良好(CV现代验检学杂志第医６卷２第４２１期０１年７月ＪＭｏａｄＬＭｂｅＶ．ｏＮｏ６４Ｊｌ０・１ｄ，１，．，２ｕｙ２１１１瓶０其，ＣＣ＂和和流行病研学都究迫切要需同实不验室及同一实期到抽取时３转移至液中，氮中一２４￣２￣存的样品先在一８５Ｃ储０＂冰箱放Ｃ置夜过再转至验室不同时的血间测定脂结果准确、可比性，有因２血此测脂定必须做到标准化。

牛血清白蛋白的共振光散射光谱法测定

收稿日期:2007212218 修回日期:20082042213通讯联系人:田　媛,女,副教授,主要从事光谱化学分析研究.第24卷第6期Vol.24　No.6分析科学学报J OU RNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE 2008年12月Dec.2008文章编号:100626144(2008)0620685204牛血清白蛋白的共振光散射光谱法测定牧　丹,吴立航,高德江,孙滟涛,邓新煜,田　媛3,张寒琦(吉林大学化学学院,长春130012)摘　要:通过测量β2巯基乙醇(β2M E )2十二烷基苯磺酸钠(SDBS )2牛血清白蛋白(BSA )体系的共振光散射强度,建立了一种测定BSA 的快速、简便的共振光散射光谱法。

考察了p H 值、β2M E 和SDBS 的浓度、试剂的加入顺序等因素对共振光散射强度的影响。

实验结果表明,在p H 值为2.4,β2M E 的浓度为0.71mol ・L -1,SDBS 的浓度为6.5×10-4mol ・L -1条件下,测定BSA 的线性范围为1.0×10-8～7.0×10-7mol ・L -1,检出限为6.0×10-9mol ・L -1。

将该法应用到合成样品中BSA 及人血清样品中总蛋白的测定,所得结果与传统的考马斯亮蓝法的测定结果基本一致。

关键词:共振光散射光谱法;牛血清白蛋白;β2巯基乙醇;十二烷基苯磺酸钠中图分类号:O657.39 文献标识码:A蛋白质是人们认识细胞功能和疾病过程的关键,是生命科学的基础。

蛋白质含量的测定在临床医学、生命科学的研究方面有着十分重要的意义。

蛋白质含量的测量方法很多,常用的经典方法有定氮法、双缩脲法(Biuret 法)、Folin 2酚试剂法(Lowry 法)、考马斯亮蓝法(Bradford 法)等[1]。

共振光散射光谱法是近几年发展起来的一种新的分析技术。

该方法简单,灵敏度高,可以用普通的荧光分光光度计测量,因此在蛋白质[2]和核酸[3]等生物大分子的研究中得到了广泛的应用。

甲钴胺与牛血清白蛋白相互作用的光谱特性

甲钴胺与牛血清白蛋白相互作用的光谱特性辛建伟;马红燕;杨猛【期刊名称】《发光学报》【年(卷),期】2012(033)005【摘要】应用荧光光谱法、紫外吸收光谱法及共振光散射法,研究了甲钴胺(Mecobalamin)与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用.在pH =7.40的三羟甲基胺基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液中,随着甲钴胺浓度的增加,BSA的荧光强度、共振散射光强度逐渐减弱.通过计算不同温度(293,303,310 K)下的猝灭常数(Ksv=5.40×104,6.90×104,8.00×104 L/mol)及扫描紫外吸收光谱,确定了甲钴胺对牛血清白蛋白的猝灭机理为动态猝灭.测定了该反应的表观结合常数(KA=1.68 × 104,4.34×104,7.90×104 L/mol)和结合位点数(n≈1).利用热力学参数(△H＞0、△G＜0和△S ＞0)确定了分子间的作用力性质,作用力主要是疏水作用力,作用过程是自发的.同时应用同步荧光技术研究了甲钴胺对BSA构象的影响.结果表明,甲钴胺没有引起BSA构象的变化.【总页数】5页(P553-557)【作者】辛建伟;马红燕;杨猛【作者单位】延安大学化学与化工学院分析化学研究所,陕西延安716000;延安大学化学与化工学院分析化学研究所,陕西延安716000;延安大学化学与化工学院分析化学研究所,陕西延安716000【正文语种】中文【中图分类】O657.3【相关文献】1.紫外吸收光谱和荧光光谱法研究大黄酚与牛血清白蛋白相互作用机制 [J], 孟丽艳;屈凌波;杨冉;陈晓岚;李建军2.脉冲电场与牛血清白蛋白相互作用的同步荧光光谱和拉曼光谱比较研究 [J], 李乐军;陈树德;乔登江3.维生素B5与牛血清白蛋白相互作用的同步荧光光谱和紫外差光谱研究 [J], 王志军;梁瑞瑞;王慧慧;雷海英4.光谱法与计算机模拟法研究六溴环十二烷与牛血清白蛋白的相互作用 [J], 庹浔;宋继敏;付豪;吕小兰5.丹酚酸B与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究 [J], 张传英;彭鑫;饶恒军;齐崴;苏荣欣;何志敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

停流荧光法研究牛血清白蛋白和叶酸反应动力学

停流荧光法研究牛血清白蛋白和叶酸反应动力学叶三仙;罗云敬;乔树亮;李莉;刘彩虹;史建龙;安学静【摘要】叶酸属于B族维生素，作为生物体内转移一碳单位酶系中的辅酶，与其他维生素相互作用，共同维持体内红细胞的稳定，对氨基酸之间的转化、细胞的分裂生长，蛋白质合成的反应都有重要意义。

药物半衰期、峰浓度和反应速度常数是研究药代动力学的重要参数，实验运用荧光分光光度计和停流光谱分析仪研究了仿生环境下牛血清白蛋白和叶酸反应的动力学参数，为叶酸相关的药物代谢参数提供参考。

结果表明：利用Stern‐Volmer方程处理荧光猝灭实验数据，得到25，30和37℃下叶酸对牛血清白蛋白内源荧光的静态猝灭常数分别为2.455×1010，4.900×1010和6.427×1010 L・mol-1・s-1；动力学反应速率常数的计算结果表明不同温度、pH值和缓冲介质下BSA和叶酸反应的速率常数都大于100 mol・L -1・s-1，阐明了BSA与叶酸之间的猝灭机理是通过形成复合物的静态猝灭过程；生理温度下，牛血清白蛋白浓度与其初始浓度满足二级反应公式，相关系数为0.9987，药代半衰期 t1／2为0.059 s ；反应的表观速率常数随着叶酸浓度的增加呈线性增加趋势，且叶酸催化牛血清白蛋白荧光猝灭的速率常数 kcat ＝3.174×105 mol・L -1・s-1。

此外还测定了不同缓冲介质下牛血清白蛋白与叶酸相互作用的表观速率常数和反应速率常数，以此来探讨生理介质对于二者反应的影响，为确定临床用药方案、预测药物的疗效和毒性以及合理用药有着重要意义。

%As a kind of coenzyme of one‐carbon enzymes in vivo ,folic acid belongs to B vitamins ,which can interact with other vitamins and has great significance for converting among amino acids ,dividing growth of cells and protein synthesis reactions . Half‐life ,concentration and reaction rate constant of drugs are important parameters in pharmacokinetic study .Inthis paper ,by utilizing fluorescence spectroph otometer and stopped‐flow spectrum analyzer ,reaction kinetic parameters between bovine serum albumin(BSA) and folic acid in a bionic system have beeninvestigated ,which provide references for parameters of drug metabo‐lism related to folic acid .By using Stern‐Volmer equation dealing with fluorescence quenching experiments data ,we concluded that under25 ,30 ,and 37 ℃ ,the static quenching constants of folic acid to intrinsic fluorescence from bovine serum albumin were 2.455 × 1010 ,4.900 × 1010 and 6.427 × 1010 L・mol-1 ・s-1 respectively ;The results of kinetic reaction rate have shown that the reaction rate of BSA and folic acid are greater than 100 mol・ L -1 ・ s-1 at different temperatures ,pH and buffering media ,illustrating that the quenching mechanism between BSA and folic acid is to form composite static quenching process .Re‐action concentration of bovine serum albumin and its initial concentration were equal to the secondary reaction formula ,and the correlation coefficient was 0 .998 7 ,while the half‐life (t1/2 ) was 0.059 s at physiological temperature .With the increase of folic acid concentration ,the apparent rate constant of this reaction had a linear increasing trend ,the BSA fluorescence quenching rate constant catalyzed by folic acid was 3.174 × 105 mol・L -1 ・s-1 .Furthermore ,with different buffer ,the apparent rate constant and reaction rate constant of BSA interacting with folic acid were detected to explore the influence on the reaction under physio‐logical medium ,which is of great significance to determine the clinicalregimen ,forecast the efficacy and toxicity of drugs and ra‐tional drug .【期刊名称】《光谱学与光谱分析》【年(卷),期】2016(036)001【总页数】6页(P134-139)【关键词】牛血清白蛋白;叶酸;荧光光谱;动力学参数【作者】叶三仙;罗云敬;乔树亮;李莉;刘彩虹;史建龙;安学静【作者单位】北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124;包头出入境检验检疫局，内蒙古包头014010;中国检验检疫科学研究院，北京 100123;中国检验检疫科学研究院，北京100123;北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124【正文语种】中文【中图分类】O657.3叶酸是一种水溶性维生素，它能传递一碳基团(甲基或甲酰)给脱氧尿苷酸，使之变为脱氧胸苷酸，进而合成DNA。

一种双子表面活性剂与BSA相互作用的荧光研究

一种双子表面活性剂与BSA相互作用的荧光研究王娅;蒋晓慧;周丽梅;张瑜瑜;吴刚;王玉军【摘要】The interaction between Gemini surfactant glycol bis-N-tetradecyl nicotinate dibromide with bovine serum albumin (BSA) was studied by fluorescence spectra.The results showed that glycol bis-N-tetradecyl nicotinate dibromide quenched the intrinsic fluorescence of BSA through a combined (dynamic arid static) procedure.The binding constant (K),binding site (n) and the thermodynamic parameters were calculated,and the data revealed that the binding was a spontaneous,endothermic and entropy driving process and hydrophobic force predominated the interaction of glycol bis-N-tetradecyl nicotinate dibromide and BSA.However,the electrostatic interaction and π-π stacking should be taken into account.Hydrophobic tails of glycol bis-N-tetradecyl nicotinate dibromide embedded to the hydrophobic pocket of BSA in site Ⅰ and altered the structure of BSA.%采用荧光光谱法研究了双子表面活性剂溴化双-N-十四烷基二甘醇酯与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.实验结果表明该双子表面活性剂主要以静态猝灭和动态猝灭结合的方式猝灭BSA的内源荧光.计算了结合常数K和结合位点数n及热力学参数,结果表明两者的结合是一个吸热熵驱动的自发过程,疏水作用力是主要作用,但考虑到该双子表面活性剂的结构和所带的正电荷,及该条件下BSA中一些含芳香环的氨基酸残基及某些残基可能带负电荷,因此两者之间的静电相互作用和π-π堆积作用也不可忽略.竞争实验表明,表面活性剂的疏水链通过疏水作用插入到BSA的疏水微区,在位点Ⅰ结合,从而引起蛋白质的构象变化.【期刊名称】《西华师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(034)002【总页数】8页(P153-160)【关键词】双子表面活性剂;牛血清白蛋白;荧光光谱;相互作用【作者】王娅;蒋晓慧;周丽梅;张瑜瑜;吴刚;王玉军【作者单位】化学合成与污染控制四川省重点实验室,西华师范大学化学化工学院,四川南充637009;化学合成与污染控制四川省重点实验室,西华师范大学化学化工学院,四川南充637009;化学合成与污染控制四川省重点实验室,西华师范大学化学化工学院,四川南充637009;化学合成与污染控制四川省重点实验室,西华师范大学化学化工学院,四川南充637009;化学合成与污染控制四川省重点实验室,西华师范大学化学化工学院,四川南充637009;化学合成与污染控制四川省重点实验室,西华师范大学化学化工学院,四川南充637009【正文语种】中文【中图分类】O647.2如今食品安全已受到人们越来越广泛的关注. 而表面活性剂广泛用于食品、农业等领域，在食品中广泛用作增粘剂、防腐剂和乳化剂. 近年来，表面活性剂与血清白蛋白相互作用的研究是一个广泛的课题. 一旦表面活性剂结合到蛋白质，蛋白质的溶解、聚集性质和构象参数均会发生变化. 因此，研究小分子与血清白蛋白的相互作用对于理解小分子在生物体内的运输和分布，阐释小分子的作用机理具有重要意义[1-4].目前研究小分子配体与蛋白质间相互作用的方法有紫外光谱法[5]、红外光谱法[6]、圆二色谱法[7]、核磁共振光谱法[8]、荧光光谱法[9]等. 荧光光谱法是目前研究蛋白质与各种有机小分子离子或无机化合物相互作用的重要手段之一[10].本文利用荧光光谱法研究了双子表面活性剂溴化双-N-十四烷基二甘醇酯与牛血清白蛋白BSA在pH 7.4的tris-HCl缓冲溶液中的相互作用，并对其作用机理进行了初步分析.1 实验部分1.1 实验试剂烟酸(CR), 二氯亚砜 (AR), 二甘醇 (AR) 以及溴代十四烷 (AR) 从成都科龙试剂公司购买. BSA购买自上海泛柯生化生物试剂公司，tris-HCl 缓冲液(1.0 mol·L-1, pH 7.4) 从北京索莱宝科技有限公司购买. 其他试剂均为分析纯，使用前不再纯化. 双子表面活性剂由实验室自制[11]，溶液均用三次蒸馏水配制.1.2 实验仪器荧光分光光度计(Cary Eclipse fluorescence spectrophotometer, 美国瓦里安公司).1.3 稳态荧光光谱BSA的原溶液(5×10-5 mol·L-1)用tris-HCl 缓冲溶液配制，在4 ℃下保存，使用前稀释到所需浓度. 在1.0 cm 的石英比色皿中放置3.0 mL的20 μM BSA溶液，向其中连续滴加3.2×10-3 mol·L-1的溴化双-N-十四烷基二甘醇酯的原溶液(维持其浓度范围为1.06×10-7 mol·L-1 - 4.33×10-4 mol·L-1). 采用仪器Cary Eclipse 荧光光谱仪在5 nm / 5 nm激发狭缝下记录BSA在300-500 nm的荧光发射光谱，激发波长为295 nm. 实验温度范围为293-313 K.1.4 同步荧光光谱在298 K时分别记录BSA(2 μM)在不同浓度溴化双-N-十四烷基二甘醇酯在波长间隔(Δλ)分别为15 nm和60 nm时的同步荧光光谱.1.5 位点竞争实验选用3种位点竞争试剂灭鼠灵、布洛芬和洋地黄毒干，在激发波长为295 nm时进行位点竞争实验. BSA和3种竞争试剂的浓度均为2.0 μM，溴化双-N-十四烷基二甘醇酯的浓度范围为0-7.74 μM. 向BSA-灭鼠灵、BSA-布洛芬和BSA-洋地黄毒干混合体系中逐渐滴加0.24 m mol·L-1的溴化双-N-十四烷基二甘醇酯溶液，并记录体系的荧光光谱.1.6 三维荧光三维荧光实验在298 K下进行，测定条件如下：发射波长从200到500 nm, 激发从200 nm开始，激发波长的增量为2 nm, 激发和发射狭缝宽度均为5.0 nm, 扫速为24 000 nm/min, BSA 浓度为5 μM，溴化双-N-十四烷基二甘醇酯的浓度分别为：0、7.97、39.34和77.42 μM.2 结果与讨论2.1 荧光猝灭光谱采用稳态荧光实验方法分别测定了293 K、298 K、303 K、308 K和313 K温度下表面活性剂对BSA的荧光猝灭光谱，激发波长为295 nm，对应于BSA中的色氨酸残基Trp的激发. 图1为298 K时不同浓度表面活性剂对BSA的荧光猝灭光谱.由图1可知，随着表面活性剂浓度的逐渐增加，BSA的特征峰(340 nm)荧光强度逐渐降低，且最大发射波长从340 nm蓝移到336 nm. 结果表明表面活性剂的加入使BSA中色氨酸残基周围的微环境的疏水性增加.2.2 BSA的荧光猝灭机理及猝灭常数的测定荧光猝灭可以根据不同的机理进行，通常包括动态猝灭和静态猝灭[12]. 为了阐明猝灭机理，我们采用Stern-Volmer方程分析猝灭数据[13].=KSV[Q]+1=kqτ0[Q]+1(1)其中F0和F分别表示不存在和存在猝灭剂表面活性剂时BSA的荧光强度，KSV，[Q]，kq分别为Stern-Volmer猝灭常数、猝灭剂的浓度和表观生物大分子猝灭速率常数. τ0 表示没有猝灭剂时生物大分子的平均寿命，其值为10-8 s[14]. 因此，用F0/F对[Q]作图可得到KSV.图2显示Stern-Volmer关系不呈直线，而是偏向Y轴，说明动态猝灭不是唯一的猝灭机理. 因此，F0/F与[Q]之间的关系应该用修饰后的Stern-Volmer方程分析[15].=(1+KD[Q])(1+KSV[Q])(2)其中KD和KSV分别为动态猝灭常数和静态猝灭常数. 方程(2)是[Q]的二次函数，当表面活性剂浓度较高时，同时存在动态猝灭和静态猝灭. 由方程(2)分析的结果列于表1.从表1明显看出KD随温度增加而增加，而KSV从293到308 K增加，313 K时降低. 说明溴化双-N-十四烷基二甘醇酯与BSA发生了结合. 计算的kq值比最大散射碰撞速率常数(2×1010 L·mol-1·s-1)大1个数量级，说明存在静态猝灭. 因此，我们推测EQ14-2-14同时通过动态和静态方式猝灭BSA的内源荧光.当小分子独立的结合到大分子一系列等效位点时，结合常数K和结合位点数n可以由以下公式计算[16]：log=logK+nlog[Q](3)用(F0-F)/ F 对log [Q]作图，由斜率和截距得到K和n的值，结果列于表2. K值的数量级可达到104 L·mol-1，说明表面活性剂与BSA间的结合作用很强；n的值约等于1，说明溴化双-N-十四烷基二甘醇酯在BSA的结合位点为1个.表1 不同温度下溴化双-N-十四烷基二甘醇酯-BSA体系的KSV、KD 和kq值Tab.1 KSV、KD and kq of glycol bis-N-tetradecyl nicotinate dibromide-BSA at different temperatures体系T(K)KSV(×10-3 L·mol-1)KD(×10-4 L·mol-1)kq×10-11(L·mol-1·s-1)R2表面活性剂-BSA293-0.857-0.98292980.1780.8590.1780.98253031.1320.8841.1320.99603081.7151.1671.7150.99803131.6651.2021.6650.9985表2 不同温度下BSA/溴化双-N-十四烷基二甘醇酯体系的结合常数和热力学参数Tab.2 Binding constant and thermodynamic parameters in BSA/glycol bis-N-tetradecyl nicotinate dibromide at different temperatures体系T(K)K(×10-4 L·mol-1)nR2ΔG0(kJ·mol-1)ΔH0(kJ·mol-1)ΔS0(kJ·mol-1·K-1)表面活性剂-BSA2930.0490.70650.9950-15.482980.1670.79520.9904-18.953031.4691.01090.9957-22.423082.3971.03780.9972-25.893135.9881.14240.9956-29.36187.760.692.3 位点竞争实验与人血清白蛋白HSA相似，BSA由氨基酸链形成一个单一的多肽链，其含有3个α-螺旋域(I-III)，每个域又包含两个亚域A和B[17]. 众所周知配体在BSA的结合位点主要位于亚域IIA和IIIA，分别为位点I和位点II[18]. 许多配体能特定的结合到不同的亚域，如灭鼠灵结合在位点I，布洛芬结合在位点II以及洋地黄毒苷结合在位点III. 为了确定表面活性剂在BSA的结合位点，将表面活性剂溶液分别滴加入BSA-位点试剂体系中，测定体系的荧光强度变化，再用方程(3)分析所得数据，结果列于表3.表3 298K下BSA/溴化双-N-十四烷基二甘醇酯/竞争试剂体系的结合常数Tab.3 Binding constants by competitive experiments in BSA/ glycol bis-N-tetradecyl nicotinate dibromide/site marker at 298 K位点竞争剂Log KK(10-3 L·mol-1)R2本体溶液 3.45112.830.9916布洛芬 3.43812.740.9942灭鼠灵3.34332.200.9905洋地黄毒苷3.43672.730.9983从表3中看出加入灭鼠灵后结合常数明显降低，而滴加布洛芬和洋地黄毒苷后，它们的结合常数均无明显变化，说明溴化双-N-十四烷基二甘醇酯竞争BSA中亚域ⅡA的色氨酸残基，即溴化双-N-十四烷基二甘醇酯与BSA的结合发生在位点I.2.4 同步荧光实验当小分子结合到BSA时通常会引起BSA的构象变化. BSA的荧光主要来自色氨酸残基和络氨酸残基，而色氨酸残基和络氨酸残基具有相似的荧光光谱，通常荧光光谱会发生较大的重叠[19]. 据报道，同步荧光光谱能有效的区分BSA中色氨酸残基(△λ = 60 nm)和络氨酸残基(△λ = 15 nm)[20]. 所以我们进行了同步荧光实验，图3为不同溴化双-N-十四烷基二甘醇酯存在时BSA的同步荧光光谱.从图中可见，△λ=60 nm时，随着溴化双-N-十四烷基二甘醇酯浓度的增加，BSA 的最大发射波长从281 nm轻微移动到282 nm，即引起了色氨酸残基的轻微的构象变化. 而△λ=15 nm时BSA的最大发射波长没有移动，说明溴化双-N-十四烷基二甘醇酯结合到BSA的色氨酸残基.2.5 三维荧光实验三维荧光光谱能提供更多的信息证实溴化双-N-十四烷基二甘醇酯存在时BSA的构象变化. 图4中BSA和BSA/溴化双-N-十四烷基二甘醇酯的三维荧光光谱中有四个峰. 根据文献报道[21]，峰A是瑞利散射峰(λex=λem=330 nm)，峰B是二级散射峰(λex/λem=248/495 nm).随着溴化双-N-十四烷基二甘醇酯浓度的增加，峰A和峰B的强度增加，这是BSA/溴化双-N-十四烷基二甘醇酯复合物形成、分子直径增加引起的. 峰Ⅰ (λex/λem = 282/340 nm)主要揭示了BSA的色氨酸和络氨酸残基的荧光性质. 峰Ⅱ (λex/ λem = 234/335 nm)主要揭示了肽链骨架结构的荧光性质[22]，其峰归因于C=O的n → π*跃迁，强度与二级结构相关联. 随着溴化双-N-十四烷基二甘醇酯浓度的增加，峰Ⅰ和Ⅱ的强度显著降低，峰Ⅱ的最大发射波长蓝移(从340到335 nm) (表 4). 这些结果显示BSA中两个残基周围的环境极性减小，BSA/溴化双-N-十四烷基二甘醇酯复合物的形成诱导了BSA肽链的轻微解折叠.表4 BSA/溴化双-N-十四烷基二甘醇酯体系的三维荧光光谱数据Tab.4 The Data from Three-dimensional Fluorescence Spectra of BSA/ glycol bis-N-tetradecyl nicotinate dibromideC表面活性剂(μM)peak Ⅰλex/λem(nm/nm)FF/F0*peakⅡλex/λem(nm/nm)FF/aF0peak Aλex/λem(nm/nm)FF/aF0peakBλex/λem(nm/nm)FF/aF00280/340754.91232/340280.31330/330223.11248 /495199.417.97282/340601.90.80234/335224.20.80330/330295.21.32248/4 95218.51.1039.34282/340307.80.41234/335109.70.39330/330426.31.91248 /495241.51.2177.42284/335140.20.19236/33549.00.17330/330651.12.9224 8/495242.31.22* is the intensity of BSA (5.00 μM).2.6 溴化双-N-十四烷基二甘醇酯与BSA间的作用力小分子结合到生物大分子通常主要通过4种作用力：氢键作用、疏水作用力、静电作用力和范德华力，该过程的热力学参数常用于判别这些作用. 如果ΔH0 < 0 且ΔS0< 0, 则主要是范德华力和氢键作用起主要作用; 如果ΔH0 > 0 且ΔS0 > 0, 则主要是疏水作用力占主导;当ΔH0 < 0 且ΔS0 >0时，静电作用力起主要作用[23].不同温度下的热力学参数可用van’t Hoff方程来分析[24]：(4)其中K为结合常数，R和T分别为气体常数和绝对温度. 吉普斯自由能变(ΔG0)可由公式(5)计算得到ΔG0=ΔH0-TΔS0(5)从图5可以看出ln K与 1/T有很好的线性关系. 从斜率和截距可以分别计算得到ΔH0和ΔS0. 热力学参数列于表2.从表2可见，ΔH0(187.76 kJ·mol-1)为正值，说明所发生的过程是一个吸热过程. ΔS0 (0.69 kJ·mol-1·K-1)说明，该过程是一个熵增加过程，过程有利于BSA和溴化双-N-十四烷基二甘醇酯的结合. 一般的吸附过程是一个熵减小的过程，BSA和溴化双-N-十四烷基二甘醇酯的结合是熵增加过程，说明二者之间存在很强的相互作用. 负的ΔG0值表明溴化双-N-十四烷基二甘醇酯结合到BSA是一个自发的过程，表2数据显示，随着温度升高，ΔG0值越负，该过程的自发倾向增加. 尽管ΔH0值很大，但ΔG0还是一个负值，可见BSA和溴化双-N-十四烷基二甘醇酯的结合是一个熵驱动过程. 由于该过程中ΔH0 > 0 且ΔS0 > 0，根据前人研究结果说明疏水作用在结合过程中占主导. 另外，由于溴化双-N-十四烷基二甘醇酯分子中存在正电荷头基和含有π电子云的吡啶环，而BSA分子中有含芳香环的残基和带负电荷的基团(如羧酸根)，所以在一定程度上，BSA和溴化双-N-十四烷基二甘醇酯之间存在静电作用和π-π堆积作用[25].3 结论本文利用荧光光谱法研究了双子表面活性剂溴化双-N-十四烷基二甘醇酯与牛血清白蛋白BSA的相互作用，结果表明静态猝灭和动态猝灭的结合是导致BSA荧光猝灭的主要原因，且导致了蛋白质构象发生变化. 结合是一个吸热的熵驱动的自发过程，结合主要驱动力是疏水作用，还存在静电作用和π-π堆积作用.表面活性剂与BSA的结合发生在位点Ⅰ.参考文献：[1] 尹爱萍，白佛，李慧卿. 甲基紫与牛血清白蛋白作用的荧光光谱研究[J]. 分析试验室, 2012, 2( 31): 71-74.[2] WU D, XU G, FENG Y, et al. Comparative Study on Interaction of Bovine Serum Albumin with Dissymmetric and Symmetric Gemini Surfactant by Spectral Method [J]. Colloid Polym Sci, 2009, 287: 225-230.[3] KHAN A B, KHAN J M, ALI M S, et al. Interaction of Amphiphilic Drugs with Human and Bovine Serum Albumins[J]. 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