甲醇营养型酵母表达系统
酵母表达系统
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化：
选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达 毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点 的低
2）分泌表达产物过糖基化
（二） 甲醇酵母表达系统
甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的优缺点 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的应用
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pastoris) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha) 假丝酵母（Candia boidinii)
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活 性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸 基团
4、酿酒酵母表达系统的缺陷
1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵
酵母表达系统
C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
性结合因子：MF-α
酸性磷酸酯酶：PHO5
蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
酿酒酵母信号肽特点
*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用
*信号肽结构：
Met 信号肽剪切位点
正电荷区 疏水区
极性区
目的蛋白
MF-α信号肽
*分泌效率高
*在酵母统具有通用性
*88个残基组成
Met KEX2 DAP DAP
AOX1与AOX2 *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因 AOX1、AOX2 *AOX1与AOX2基因97%同源 *AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
8）表达产物稳定性
分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素
降低培养基pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低
培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制
采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲醇酵母部分优点：1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达；2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平；3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产；4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化；5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。
产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。
酵母表达系统
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子
AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
2、甲醇酵母表达系统的优缺点
甲醇酵母系统的整合事件
YRp型载体：汉森系统 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择
压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。 YIp型载体： A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组 B、有“插入”和“取代”二类整合模式 C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目 最适温度 最适pH值 甘油阻遏 糖基化 高密度发酵
毕赤酵母 30℃ 4.5 是 部分过度 100g/L
汉森酵母 37℃ 4.5 否 较正常 100g/L
甲醇酵母系统宿主
A、表达水平高（最高水平的系统） B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化 C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150
个甘露糖） D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统） E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。 F、实验室和工业操作简单 G、不能满足结构要求严格的糖基化
1、转录起始位点； 2、TATA盒：富含AT； 3、UAS：上游激活序列;
4、URS：上游阻遏序列 5、DAS：下游激活序列
酿酒酵母表达系统常用启动子
1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脱氢酶基因ADH
酵母表达系统
Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2 M Bicine, pH 8.35
19
pAO815和pPIC9K 在
5 AOX1
Bgl II双切：
Bgl II
在5AOX1位点和
3AOX1双交换，替
换掉了宿主的AOX1
基因，
gene
转化后GS115产生
AOX1
His +/Muts
His4
3AOX1 His4
20
21
技术路线
选择合适的内切酶位点 将基因插入载体
注:pAO815 和pIC9K是穿梭载体, 可在 大肠杆菌中操作
grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞， 用50 ml of Buffer A洗细胞，
室温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成0.2 ml于灭
菌的管中， 每管加 11 μl DMSO（-70度） ，混匀， 液氮快速冷冻， -70°C保存。
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子
AOX1 是主要的酶 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达
AOX2 利用甲醇的能力低
生长慢
7
histidinol dehydrogenase gene (his4)
甲醇诱导酵母表达的原理
甲醇诱导酵母表达是一种基因工程技术，它的原理是利用受体与配体相结合的原理，通过添加甲醇到培养基中，从而诱导酵母表达特定的外源基因。
这里的“受体”是一种称为Mxr1的转录因子，它不含甲醇时处于非活性状态，加入甲醇后与其配体Met4结合形成活性形式。
而Met4是Mxr1的配体，等待激活Mxr1转录因子的信号来自于甲醇的代谢产物-甲醛。
当酵母中有外源基因需要表达时，可以将该基因与Mxr1和Met4组成的启动子串联起来，在培养基中添加甲醇后，促使Mxr1与Met4相结合，使得启动子被活化，从而使外源基因得以表达。
基于此原理，甲醇诱导酵母表达技术可以实现高效和可控的外源基因表达。
甲醇的使用量可以在一定范围内调节外源基因表达水平，使得表达能够满足研究或应用的需求。
该技术不仅应用于科学研究，如蛋白质的产生与纯化等，还在药物和生物燃料等领域有广泛应用。
酵母表达系统所需实验材料
一、菌种1.大肠杆菌一种克隆感受态（JM109，DH5α，TG1，TOP10）2.毕赤酵母菌.GS115,甲醇利用正表型(Mu+)。
培养基含有甲醇时，菌正常生长，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子中，Mu+和Muts两种表型都有，需要在MM 和MD培养基上鉴定表型，转化整合效率高。
KM71H, 甲醇利用慢表型(Muts)。
培养基含有甲醇时，菌生长比野生株缓慢，组表达载体转化KM71H后，长出的转化子中，都是Muts表型，不需Mu表型鉴定。
SMD1168(Mu+)，蛋白酶缺陷型宿主菌，降低了目的蛋白被蛋白水解酶降解的风险。
二、毕赤酵母菌分泌表达载体诱导型启动子：pPIC9K，采用α因子信号序列，含卡那抗性基因，可用遗传霉素筛选外源基因多拷贝转化子。
（无标签）pPICZαA，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易于筛选阳性多拷贝转化子。
（有标签）组成型启动子：pGAPZα，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易于筛选阳性多拷贝转化子。
（有标签）另外，大肠杆菌表达载体pCold也可以进行诱导分泌表达蛋白。
三、实验试剂限制性内切酶EcoRI，NotI，NcoI，Sac I，T4DNA连接酶，Takara公司G418（遗传霉素），葡萄糖，生物素，甲醇，山梨醇，甲醛，咪唑，Na2S203，酵母氮源(YNB)，含His的补充培养基，酵母基因组DNA纯化试剂盒，大肠杆菌质粒提取试剂盒，0.2μm无菌滤膜。
四、实验简要计划用软件对pET28a-重组人胰岛素质粒进行EcoRI，NotI，NcoI酶切位点分析发现，NotI 在NcoI位点的上游，并且都是单酶切位点。
所以可以通过EcoRI和NotI对重组大肠杆菌质粒双酶切获取目的基因，这对目的基因的阅读框无影响。
通过EcoRI和NotI对酵母表达载体双酶切，可以获得载体片段。
将获得的载体片段与目的基因用T4 DNA连接酶4摄氏度连接过夜，并转化到大肠杆菌克隆感受态中，在抗生素培养基中培养，提取质粒进行酶切及PCR鉴定正确后，送去测序。
外源基因在甲醇营养型酵母中的表达及优化表达策略
外 源 基 因 克 隆 位 点 、 止 序 列 、 选 标 记 。此 终 筛 外 ， 于表达载 体都是 穿梭质粒 ， 由 因此 还 含 有 大 肠 杆 菌 质 粒 的 复制 单 元 及 筛 选 标 记 。 ＡＯＸ、 ＭＯＸ、 ＭＤ、 Ｆ ＤＨＡＳ是 甲 醇 营 养 型 酵 母 甲 醇 利 用 途 径 关 键 酶 ， 别 以 其 作 为 启 动 分 子 构 建 了 表 达 载 体 。 甲醇 营 养 型 酵 母 系统 可 以 利 用 两 类 筛 选 标 记 ， 类 是 营 养 缺 陷 型 选 一 择标 记 ， Ｐ 如 ｐ系 统 以 ＨＩ４为 筛 选 标 记 ， Ｓ Ｈｐ 以 ＬＥ 、 Ｕ２ ＵＲＡ３为 筛 选 标 记 带 有 筛 选 标 记 的 载 体 ＤＮＡ 导 入 酵 母 细 胞 后 与 宿 主 染 色 体 发 生 整 合 后 ， 宿 主 细 胞 能 在 选 择 培 养 基 上 使 生 长 ， 而 便 于 筛选 “ 。 另 一类 是 显 性 选 择 从 。 标 记 ， Ｔｎ ０ Ｋａ ￣ Ｓ 如 ９ ３ ｎ 、 ＵＣ２等 ， 使 利 用 全 即 培 养 基 也 能 达 到 筛 选 目 的 。 有 Ｔｎ ０ 含 ９ ３序 列 的 表 达 载 体 转 化 酵 母 菌 后 可 获 得 Ｇ４ ８抗 １ 性 ， 据 其 Ｇ４ ８抗 性 的 强 弱 ， 筛 选 到 含 高 根 １ 可 拷 贝外 源 基 因 的 转 化 子 。由 于 在 多 数 场 合 下 ， 醇 营 养 型 酵 母 不 能 有 效 识 别 外 源 蛋 白 甲 本 身的 信号 肽 ， 以在 Ｐ 所 ｐ表 达 载 体 中 ， 别 分 构 建 了 含 交 配 因 子 （ 称 因 子 ） ８ 亦 的 ９个 氨 基 酸 残 基 的 引 导 肽 或 含 酸 性 磷 酸 酶
组 ， 其 稳 定 地 表 达 外 源 蛋 白 外 源基 因 依 据 使
酵母表达系统
比较基因组学
通过比较不同物种之间的基因组 和转录组，分析生物进化的特征 和规律。
05 酵母表达系统的未来发展
提高表达产物的产量与质量
基因编辑技术
利用基因编辑技术，如CRISPR-Cas9，对酵母基因进行精确修饰， 以提高目标蛋白的表达量和纯度。
沉默子
沉默子是能够抑制基因表达的DNA序列，通过与转录因子结合来抑制基因的表达，在基因表达调控中具有重要作 用。
转录因子与基因表达调控
转录因子
转录因子是能够识别并结合DNA序列的蛋白质，通过与特定DNA序列的结合来调控基因的表达。
转录因子与基因表达调控
转录因子在基因表达调控中发挥关键作用，通过与启动子、增强子或沉默子等DNA序列的相互作用来 调节基因的表达。
蛋白质相互作用
通过酵母双杂交等技术研究蛋白质之间的相互作用，揭示基因调控 的分子机制。
基因突变分析
通过构建突变体分析基因突变对酵母生长、代谢等的影响，研究基因 的功能。
生物进化研究
物种进化
利用酵母表达系统研究物种之间 的进化关系，通过比较不同物种 之间基因表达的差异，揭示物种 进化的规律。
适应性进化
利用酵母表达系统生产食品添 加剂、酶制剂等，提高食品质 量和安全性。
农业领域
通过酵母表达系统改良农作物 ，提高抗逆性、产量和品质等
。
酵母表达系统的优缺点
优点
操作简便、周期短、成本低、可大规 模生产、安全性高。
缺点
表达水平相对较低、分泌蛋白的加工 和修饰能力有限、易受宿主菌遗传背 景的影响。
02 酵母表达系统的基本组成
对启动子、终止子等表达元件进行优化，提高其转 录和翻译效率，促进目标蛋白的表达。
甲醇酵母表达系统研究进展
摘要 ： 甲醇 酵 母 是 一 种 新 的 基 因 表 达 系 统 ， 着 许 多 突 出 有 ｍ ｔｎ ｃ ａ ｍ ｄｉ ａ也 是 一 种 甲醇 代 谢 酵 母 ， 甲醇 代 谢 与 其 ｉｆ ａｔ ｌ ｏｓ ｉＴ ｍ ｔ ｎ ｃ ａ ａ有 两 个 乙 醇 氧 化 酶 基 因 的优 点 。多 种重 组 蛋 白 已在 甲醇 酵 母 获 得 成 功 表 达 。该 文 综 Ｐｄ ａｐ ｓ ｒ 相 似 。 Ｐｄｉ ａｍ ｄｉ 述几 种 甲醇 酵母 表达 系统 的特 点和 现状 。 Ａ Ｇ１ Ａ Ｇ ， Ｕ １ 甲 醇 代 谢 中 起 主 要 作 用 ， Ｇ Ｕ 和 Ｕ ２Ａ Ｇ 在 ＡＵ ２与 Ａ Ｇ Ｕ １ 有 ８ ％ 的 同 源 性 ， 细 胞 中 乙 醇 氧 化 酶 的 活 性 主 要 有 Ａ Ｇ１ ３ 但 Ｕ 提 关键 词 ： 甲醇 酵母 ； 组 蛋 白； 重 高密 度 培养 ； 达 系统 表 中图分 类 号 ：７２ Ｑ８ 文献 标 识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ４— ３ １ 供 。如果 Ａ Ｇ 缺 损 仅 有 Ａ Ｇ １０ １Ｘ Ｕ １ Ｕ ２提 供 乙 醇 氧 化 酶 活 性 ， 甲醇 在 （Ｏ ２ Ｏ ２ ０ ） ４—０ ４ ０ ２一位 作唯 一碳 源 培养基 上表 现为慢 生 型 ｂ ￣ ｌ Ｕ ｌ ［ 。Ａ Ｇ１的启 动子受 ｕ ３ 甲醇 酵母 是指 能 利用 甲醇作 唯 一碳 源 的 一类 酵 母 ， 代 谢 甲醇专 一诱 导且 高水 平表 达 ， ／ ｌ ｅ ｏｕ／ 其 Ｐｃ ａ ｍ ｔ ／￣ｃ ｈ ｈ ／ ａ就 是利 用 Ａ Ｇ１ Ｕ 甲醇 的第 一 步是 ， 醇 氧化 酶 的作 用 下 甲醇 被 氧化 成 甲醛 。调 启动子 调 控 外 源 基 因 的表 达 。Ａ Ｇ１基 因 的 表达 被 葡 萄 糖 抑 在 Ｕ
甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍
甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、
被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。
目前通过毕赤
酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭
建毕赤酵母表达系统的平台，相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越
来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。
1.其优点主要为：
1) 具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；
2) 作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，
从而使表达出的蛋白具有生物活性；
3) 营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产； 4) 可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L以上； 5) 表达量高，许多蛋白可达到g/L以上水平；
6) 在P. pastoris中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，
自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；
7) 糖基化程度低，与S. cerevisiae相比，P. pastoris不产生过度的糖基化。
P. pastoris表达的糖蛋白的糖链长度为8-14个甘露糖，而S. cerevisiae 糖链中甘露糖多达50-150个；S. cerevisiae分泌的糖蛋白的核心寡聚糖具有终端α-1，3糖苷连接，使分泌的糖蛋白的抗原性明
显增强，而P.pastoris的糖基化位点与哺乳类细胞的相同，其所分泌
的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。
酵母表达系统研究概述
酵母表达系统研究概述田晓娟【摘要】目前常用的外源基因表达系统主要分为两类:原核表达系统和真核表达系统.前者主要包括大肠杆菌表达系统和枯草杆菌表达系统,后者一般包括酵母表达系统、昆虫/杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统以及新兴的转基因植物表达系统等.在这众多的表达系统中酵母表达系统因其培养比较方便、简单、价格低廉、外源蛋白表达量高、表达的蛋白活性好、能进行翻译后修饰等诸多优点脱颖而出,成为目前最主要的外源基因表达系统.概述了常见的几种酵母表达系统的特点,并对发酵过程中影响外源蛋白表达量的因素做了探讨,以期为人们表达重组蛋白时选择合适的表达系统和获得高效的表达产物提供帮助.【期刊名称】《陇东学院学报》【年(卷),期】2018(029)001【总页数】5页(P72-76)【关键词】酵母表达系统;外源基因;蛋白表达【作者】田晓娟【作者单位】陇东学院岐伯医学院,甘肃庆阳 745000【正文语种】中文【中图分类】R379.9;Q93-33酵母常被广泛地用于生产医用或有工业前景的重组蛋白。
为了高效获得某种单一的蛋白产物，首先必须考虑目的蛋白本身的特点、宿主菌的特性等问题，以确定和优化它的最适表达系统。
酵母表达系统有众多品质优良的宿主菌株，包括酿酒酵母、毕赤酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母和Arxula adeninivorans等。
与多数复杂的真核生物不同，酵母表达系统比较经济节约，能快速地达到较高的细胞密度，产生高浓度的蛋白，并且不含有致热源、病原体和病毒夹杂物；具有良好的耐热性；能利用一些罕见的不易被其他生物利用的碳源；有些菌株还进行了一些更具优势的加工，例如人源化的糖基化、缺失一些蛋白酶等。
此外，它们使用各种各样的载体、启动子和选择性标记以供选择。
酵母因其单细胞生物的这种优势和独特的翻译后修饰的能力，使得它们已经广泛地用于生产工业化的重组蛋白(如核糖体蛋白)。
随着工业化发酵工艺知识的积累和目前基因工程技术的发展，有望设计出更符合成本效益的表达系统，以满足日益增长的对重组蛋白和糖蛋白的需求。
甲醇营养型酵母表达系统
甲醇营养型酵母表达系统甲醇营养型酵母包括汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，能在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长，甲醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶I(AOX1)，二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)等。
AOX1的甲醇诱导表达量可占胞内总蛋白质的20％~30％，表明AOX1的合成受转录水平的调控。
AOX1启动子(PAox )具有较高的调控功能，可用于外源基因的表达调控。
甲醇营养型酵母表达系统以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统最为常用，它由野生型石油酵母Y11430突变而来，常用的3株宿主菌是GS115，KM71 和MC1o0-3。
GS115和KM71是Y1 1430的组氨醇脱氢酶基因(histidinol dehydrogenase gene，h/s 4)缺失突变体，不能合成H/s4，因此质粒载体需携带h/s4，转染后的阳性重组子可以用h/s4缺陷(h /s4-)平板进行筛选，但是GS115和KM71存在一定的低频率自发回变，即重新变为h/s正常菌株，致使h/s4’平板筛选阳性重组子存在假阳性情况。
GS115的启动子为P，在含甲醇的培养基中可以快速生长。
KM71的启动子为P，除了h/s4-外，其精氨酰琥珀酸裂解酶基因(argininosuccinate lyase gene，arg4)也被缺失突变，不能在缺乏Arg的培养基上生长。
KM71的基因型为h/s4 argaox1：：ARG4，由于野生型ARG4基因插入截断了AOX1，KM71只有依赖较弱的AOX2基因进行甲醇代谢，生长速度较为缓慢。
MCIO0-3的两个AOX基因都被剔除，其基因型为his4 arg4 aox1：：SARG4 OX2：：Phis4，完全不能在含甲醇的培养基上生长。
Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。
毕赤酵母产木聚糖酶实验方案
重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验毕赤酵母简介甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。
40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。
随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。
在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。
70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。
在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。
成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。
1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。
毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX ——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。
而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。
AOX的合成是在转录水平调控的。
其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。
外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。
酵母表达系统
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80 GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达 毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点 的低
甲醇酵母系统的整合事件
YRp型载体：汉森系统 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择
压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。 YIp型载体： A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组 B、有“插入”和“取代”二类整合模式 C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合
毕赤酵母系统模式表达载体
1表达水平普遍不高a表达载体传代不稳定yepyrpb所采用的强启动子调控不严谨c不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵2分泌表达产物过糖基化1表达水平普遍不高a表达载体传代不稳定yepyrpb所采用的强启动子调控不严谨c不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵2分泌表达产物过糖基化4酿酒酵母表达系统的缺陷4酿酒酵母表达系统的缺陷由于人类活动或者自然过程引起某些物质进入大气中达到足够的浓度滞留足够的时间并因此导致大气环境质量下降影响人类生活的现象
酵母表达系统与方法
一种常用的巴氏毕赤酵母表达载体结构图
甲醇营养型的两种酵母表达系统比较
甲醇营养型酵母表达系统的主要优点：
1. 应用AOX启动子，转录效率高，易于诱发调控； 2. 表达质粒易于整合到基因组,不易丢失,适于高密度发
1981年Hizeman等人首次报道了人重组干扰素基 因在酿酒酵母中表达并获成功。
酵母表达系统的组成
◆宿主：酿酒酵母、裂殖酵母、乳酸克鲁维亚酵母、
巴氏毕赤酵母等。
◆质粒载体
1. 质粒类型: 自主复制型质粒（Yeast replicating plasmid, YRp） 着丝粒质粒（Yeast centromeric plasmid, YCp ） 附加体质粒(Yeast episomal plasmid,YEp) (自主复制,拷贝数高,不稳定, 易丢失) 整合型载体(Yeast integrating plasmid,YIp) (稳定性好,拷贝数低) YAC载体（Yeast artificial chromosome, ）
1. 以分裂的方式繁殖 2. 裂殖酵母与哺乳动物有许多相似之处 3. 表达的产物具有天然的构象和活性 4. 高效表达载体: pTL2M (含有高效的hCMV启动子)
裂殖酵母表达系统的优点
尽管裂殖酵母作为外源基因表达系统的发展远远 落后于酿酒酵母和巴氏毕赤酵母，但随着载体的发展， 裂殖酵母不仅可以表达胞内蛋白，也能高效表达膜蛋 白和分泌蛋；特别是裂殖酵母表达系统可以使外源基 因的产物保持天然的特性。因此，裂殖酵母作为外源 基因表达系被认为是最有前途的。
◆裂殖酵母表达系统
Schizo saccharomyces pombe （粟酒裂殖糖酵母）
甲醇酵母系统表达的影响因素
酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。
了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析基因表达的规律有重要意义，也可为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。
如果外源基因密码子中存在过多的宿主低利用密码子，位于起始密码子附近的低利用密码子对基因的表达就会产生很大影响。
解决这一问题的方法有2种：一是通过点突变的方法用同义高利用率密码子替代低利用密码子而不改变氨基酸序列；另一方法是截取基因中影响其生物活性的部分。
目前，这些方法在甲醇酵母表达系统中都能提高表达水平。
外源蛋白的空间构象、糖基化位点、水溶特性、氨基酸组成以及其他的理化特点都会影响毕赤酵母对其分泌，所以应根据外源蛋白自身的理化特点来选择胞内表达或分泌型表达方式。
外源基因在酵母基因组中的整合数也可以影响外源基因的表达水平，应该选用高拷贝整合来提高外源基因的表达水平。
2、表达框的染色体整合位点和方式虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。
整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。
AOX1和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase，HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。
Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。
这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。
因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。
3、宿主的甲基营养表型：Mut+或Muts用末端与aox1基因5'和3'端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。
aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。
酵母外源基因分泌表达系统
服务简介酵母具有与其他真核生物类似的蛋白质分泌途径，外源基因的分泌表达, 不仅方便了表达产物的分离纯化, 同时也和表达产物的翻译后加工有关, 很有意义。
酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，酵母外源基因分泌表达系统（简称酵母外泌表达系统）采用的宿主是巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris），该表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。
服务原理甲醇酵母系统分泌表达载体巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）编码基因AOX1和AOX2，两种序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。
当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
服务优势1. 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。
2. 培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基成本合理，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。
3. 外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能得到高表达菌株。
4. 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。
酵母外泌表达系统的优势1. 具备完备的毕赤酵母表达平台，可以根据蛋白特性或客户的需求设计不同的实验方案；2. 具有高通量的筛选平台，可以快速有效的得到最佳表达条件；3. 具有大规模发酵生产能力服务内容科研人员建立了成熟的酵母表达纯化服务平台，提供优质的重组蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化服务。
酵母外泌表达系统服务项目:1.重组酵母表达质粒构建；2.重组质粒电转化；3.重组表达子筛选；4.小规模蛋白表达和纯化（2L培养基培养产物）；南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。
常见蛋白表达系统的比较
常见蛋白表达系统的比较
在生物学研究中，重组蛋白的研究越来越受到关注，而重组蛋白最为重要的莫过于表达系统的选择。蛋白表达系统是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。常见的蛋白表达系统分为原核表达系统和真核表达系统，具体又可以细分多种，每一种有各自的优缺点。在此，小编给大家整理了各表达系统间的差异，供大家参考。
外源蛋白占菌体总蛋白量：10%-30%。
真核生物
酵母
酿酒酵母
兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力，但存在产量低及过度糖基化等问题。
外源蛋白占菌体总蛋白量：约10%。
甲醇营养型酵母
巴斯德毕赤酵母
第二代酵母表达系统，部分克服了利用酵母表达的过度糖基化缺点，有较好的分泌性，产量较高，但产品结构与天然分子仍有一些差异。
外源蛋白占菌体总蛋白量：10%-30%。
昆虫杆状病毒系统
病毒：AcNPV、BmNPV
昆虫：sf9细胞
具有高等真核生物表达系统的优点，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，但其糖基化程度较低，形式较为单一。
发酵液中目的产物含量：1-500mg/L。
植物细胞
植物根分泌、叶分泌
植物易于大规模培养和生产，在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势，但转基因植物制作费时，表达量较难提高，分离纯化不便。
重组蛋白可EK293、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3.
产品的抗原性、免疫源性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最准确，表达水平较低。