DHL细胞中5-ALA代谢PpIX的双光子荧光光谱
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收 稿 日期 ： ０ ６１—８ ２ ０ — １１ 。修 订 日期 ： ０ ７０－９ ２ ０ —３０
Ｉ ， 青霉素 １０ｋ Ｉ ， ～ ０ ｕ・ 链霉素 ５ Ｌ 中培养 ， ～ Ｏｇ・ １） 并
基金项 目： 国家 自然科学基金项 目（０ ７０ ６ ， ６ ７８ ４ ） 厦门大学 固体表面物理化学国家重点实验室 以及 半导体材料应 用福建省重点 实验室开放课
第２ 卷 ， １ 期 ８ 第 １ ２００８年 １１月
光
谱
学
与
光
谱
分
析
Ｖ １ ８Ｎ ．１ｐ２３—６９ ｏ ２ ， ｏ１，ｐ６６２３ ．
Ｎｏ ｅ ｅ ， ｌ ａｙ ｉ ｐ ｃｒ ｓｏ ｙａ ｄ Ｓ ｅ ｔａ Ａｎ ｌｓｓ
公 司；Ｒ ＭＩ ６ ０培养基 购于 Ｇｉｃ 公 司 ； 牛血清购于 四 Ｐ －４ １ ｂｏ 胎 季青公 司。其他试 剂均为分析纯 。
激光扫描共 聚焦显微镜 （ ａｌ ｅ ｓＬ Ｍ １） 双光子激 Ｃ ｒＺ ｉ Ｓ ５ ０ ； ｓ 发光 源 ：Ｍｉ ９ ０Ｆ钛 宝石 飞秒 激 光器 （ ｏ ｅｅｔ ｒ ０一 ａ Ｃ ｈｒｎ，ＵＳ 波 Ａ） 长可调范 围 ： ０ ￣９ ０ｎ ７ ０ ８ ｍ，重复频率 ７ ６ＭＨｚ 脉宽 １ ０ｆ； ， １ ｓ Ｃ ） 培养箱 ； （ ２ 离心机 。 １ ２ 溶液配制和细胞 培养 ．
ＤＨＬ细胞 中 ５ＡＬ － Ａ代 谢 Ｐ ｌ 的双 光 子荧 光光 谱 ｐＸ
黄祖 芳 ，陈 荣¨ ， 李永增 ，陈冠楠 陈显凌 冯 尚源 贾培敏。 ， ， ，
１ ．福建师范大学 ，医学光电科学 与技术教育部重点实验室，福建 福州 ３０ ０ ５０ ７ ２ ．福建医科 大学 附属协和医院血液研究所 ，福建 福州 ３ ０ ０ ５０ １ ３ ．上海第 二医科大学附属瑞金医院 ， 上海血液学研究所 ， 上海 ２ ０ ２ ００５
引 言
细胞 内摄取并积 聚的光敏剂含量及其 随时间 的变 化 ，即
平衡 ，因此细胞中加入 ５ＡＩ 后 的孵育时间是影响 Ｐ ｌ 一 Ａ ｐＸ积 聚 的重要考 虑因 素。本 文 尝试 用双光 子激 发孵 育 有 ５ＡＬ 一 Ａ 的 ＤＨＬ细胞 ，获得 Ｄ ＨＬ细胞 的荧 光光谱 ， 希望研究孵育有 不 同浓度 ５ＡＬ 的 ＤＨＬ细胞 中，代谢产物 Ｐ Ｉ 一 Ａ ｐＸ含量随时 间的变化情况 ，并寻找研究细胞药代动力学 的新方法 。
双 光 子 激 发 扫描 显 微 术 是 细胞 生 物 学 研 究 采 用 的技 术 ，
１ 材料 和方法
１ １ 试 剂 与 仪 器 ． ５氨 基 酮 戊 酸 （－ｍｉ ｌ ｕｉｉ ａｉ，ＡＬ 购 于 ｓ ｍａ 一 ５ａ ｎ ｅ ｌ ｃ ｃ ｏ ｖ ｎ ｄ Ａ） ｉ ｇ
由于激发光源采用超快飞秒红外激光器 ，具有非 常高的峰值
功率和较低 的平均功率 ，且对于双光 子非线性激 发 ，它仅作
用于 １ ｍ左右 的区域 ＿ ，与 常规荧光激 发技术 相 比具 有对 ２ ］
样 品的光漂 白区域和光毒性小 ， 高信 噪 比和成像 亮度 。因此
更适合 于细胞和生物组织活体 的观察与研究Ｌ 。 ３ ］ ５Ａ Ａ（－ ｎ ｌ ｕｉｉ ａｉ， Ａ） 一 Ｌ ５ａ ｏｅ ｌ ｃ ｃ ＡＬ 是一种 内源性 光动 ｍｉ ｖ ｎ ｄ 力诊断和治疗 药物 ，它对 白血 病 系肿瘤 细 胞有 特殊 的 亲和 性Ｅ 。对 ＡＬ －ＤＴ 杀 伤 Ｋ５ ２细 胞 和 ＨＬ ０细 胞 的 实 ＡＰ ６ ６
ＤＨＬ细胞 内积聚 的卟啉九 （ ｐＸ 特征荧光值 。 得了浓度 分别为 ２ ４和 １ Ｐ Ｉ） 获 ， ０ｍｍｏ ・ 的 ５ＡＬ ｌＬ 一 Ａ溶 液中 ， 细胞代谢 的 Ｐ Ｉ ｐＸ含量随孵育时间 的变化情况 。 ＤＨＬ细胞 内积聚 的 Ｐ ｌ ｐＸ处于动态变化过程 ， 呈现 出两 阶 并 段性 的特点 ： 细胞 内积聚的 Ｐ Ｉ ｐＸ含量随着孵 育时间增 长而增加 ，在 ３ｈ附近 达到最大值 ，随后 随着 孵育 时 间增 长反 而下 降。结果表明 ， 基于激光 扫描显微 的双光 子荧光光 谱可 成为 Ｄ ＨＩ细胞 等 白血 病细胞 摄取 ５ 一
Ｄ ＨＬ细胞 是滤泡性淋巴瘤细胞株 （ 由福建 协和医院血液 研究所提供） Ｒ ＭＦ ６ ０培养液 （ 活胎牛血 清含 １ ０ｍＬ 在 Ｐ １４ 灭 ０
・
验＿ 表 明， ＡＬ Ｐ ５ ］ 在 Ａ－ＤＴ 中 ＡＬ 在 细胞 内合成 具 有光 敏 Ａ 性物质 的 Ｐ ｌ 而 Ｐ Ｉ ｐＸ， ｐＸ与铁离子结合 ，在一 系列酶 的作用
Ａ Ａ并生成 Ｐ Ｉ Ｌ ｐＸ的动力学研究的有 效方 法。
关键 词 双光 子激发荧光光谱 ；５氨基酮戊酸 ；卟啉九 ； － ＤＨＩ细胞
中图分 类号 ： ６ ７ ３ ０ ５ ． 文献标 识码 ： Ａ Ｄ ：１ ．９ ４ ｊｉｓ． ０ ００ ９ （０ ８ １—６ ６０ ＯＩ ０ ３ ６ ／．ｓｎ １０ —５３ ２ ０ ）１２３ —４ 下又会被转化合成血 红素 ，即细胞 内合成 的 Ｐ ｌ ｐＸ处 于动态
摘
要
双光 子激 发生物组织荧光 ，激发光仅作用于焦点区域 ， 对生物样品 的光漂 白性和光毒性都很小 ，因
而双 光子荧光 显微技术 已成 为细胞生物学研究 的一种新技术 。文章采用波长为 ８ ０Ｆｒ飞秒激光激发孵育有 ２ ｉ ｌ ｔ ５ＡＬ 的 ＤＨＬ细胞 ，在激光扫描显微镜 的 Ｌ ｍｂ ａ 一 Ａ ａ ｄ 模式 中获得单个 Ｄ ＨＬ细胞 的双光 子荧光 光谱 ，并测量
细胞药代动力学 ， Ｐ Ｔ研究 的关键 问题 。 是 Ｄ 光敏剂在细胞 中 代谢规律 ， 以往研究主要是利用荧光分光光度计测 量在不 同 孵 育时间 ， 细胞 内积聚 的光敏剂特征 荧光峰强 度值 ，然后对 比标准 曲线 间接获得 细胞 中的光敏剂含 量。此类方 法的缺点
是操作烦琐［ ，而且并不能直接测量 出单个细胞 的实际光敏 １ ３ 剂含量 ，误差较大 。
Ｉ ， 青霉素 １０ｋ Ｉ ， ～ ０ ｕ・ 链霉素 ５ Ｌ 中培养 ， ～ Ｏｇ・ １） 并
基金项 目： 国家 自然科学基金项 目（０ ７０ ６ ， ６ ７８ ４ ） 厦门大学 固体表面物理化学国家重点实验室 以及 半导体材料应 用福建省重点 实验室开放课
第２ 卷 ， １ 期 ８ 第 １ ２００８年 １１月
光
谱
学
与
光
谱
分
析
Ｖ １ ８Ｎ ．１ｐ２３—６９ ｏ ２ ， ｏ１，ｐ６６２３ ．
Ｎｏ ｅ ｅ ， ｌ ａｙ ｉ ｐ ｃｒ ｓｏ ｙａ ｄ Ｓ ｅ ｔａ Ａｎ ｌｓｓ
公 司；Ｒ ＭＩ ６ ０培养基 购于 Ｇｉｃ 公 司 ； 牛血清购于 四 Ｐ －４ １ ｂｏ 胎 季青公 司。其他试 剂均为分析纯 。
激光扫描共 聚焦显微镜 （ ａｌ ｅ ｓＬ Ｍ １） 双光子激 Ｃ ｒＺ ｉ Ｓ ５ ０ ； ｓ 发光 源 ：Ｍｉ ９ ０Ｆ钛 宝石 飞秒 激 光器 （ ｏ ｅｅｔ ｒ ０一 ａ Ｃ ｈｒｎ，ＵＳ 波 Ａ） 长可调范 围 ： ０ ￣９ ０ｎ ７ ０ ８ ｍ，重复频率 ７ ６ＭＨｚ 脉宽 １ ０ｆ； ， １ ｓ Ｃ ） 培养箱 ； （ ２ 离心机 。 １ ２ 溶液配制和细胞 培养 ．
ＤＨＬ细胞 中 ５ＡＬ － Ａ代 谢 Ｐ ｌ 的双 光 子荧 光光 谱 ｐＸ
黄祖 芳 ，陈 荣¨ ， 李永增 ，陈冠楠 陈显凌 冯 尚源 贾培敏。 ， ， ，
１ ．福建师范大学 ，医学光电科学 与技术教育部重点实验室，福建 福州 ３０ ０ ５０ ７ ２ ．福建医科 大学 附属协和医院血液研究所 ，福建 福州 ３ ０ ０ ５０ １ ３ ．上海第 二医科大学附属瑞金医院 ， 上海血液学研究所 ， 上海 ２ ０ ２ ００５
引 言
细胞 内摄取并积 聚的光敏剂含量及其 随时间 的变 化 ，即
平衡 ，因此细胞中加入 ５ＡＩ 后 的孵育时间是影响 Ｐ ｌ 一 Ａ ｐＸ积 聚 的重要考 虑因 素。本 文 尝试 用双光 子激 发孵 育 有 ５ＡＬ 一 Ａ 的 ＤＨＬ细胞 ，获得 Ｄ ＨＬ细胞 的荧 光光谱 ， 希望研究孵育有 不 同浓度 ５ＡＬ 的 ＤＨＬ细胞 中，代谢产物 Ｐ Ｉ 一 Ａ ｐＸ含量随时 间的变化情况 ，并寻找研究细胞药代动力学 的新方法 。
双 光 子 激 发 扫描 显 微 术 是 细胞 生 物 学 研 究 采 用 的技 术 ，
１ 材料 和方法
１ １ 试 剂 与 仪 器 ． ５氨 基 酮 戊 酸 （－ｍｉ ｌ ｕｉｉ ａｉ，ＡＬ 购 于 ｓ ｍａ 一 ５ａ ｎ ｅ ｌ ｃ ｃ ｏ ｖ ｎ ｄ Ａ） ｉ ｇ
由于激发光源采用超快飞秒红外激光器 ，具有非 常高的峰值
功率和较低 的平均功率 ，且对于双光 子非线性激 发 ，它仅作
用于 １ ｍ左右 的区域 ＿ ，与 常规荧光激 发技术 相 比具 有对 ２ ］
样 品的光漂 白区域和光毒性小 ， 高信 噪 比和成像 亮度 。因此
更适合 于细胞和生物组织活体 的观察与研究Ｌ 。 ３ ］ ５Ａ Ａ（－ ｎ ｌ ｕｉｉ ａｉ， Ａ） 一 Ｌ ５ａ ｏｅ ｌ ｃ ｃ ＡＬ 是一种 内源性 光动 ｍｉ ｖ ｎ ｄ 力诊断和治疗 药物 ，它对 白血 病 系肿瘤 细 胞有 特殊 的 亲和 性Ｅ 。对 ＡＬ －ＤＴ 杀 伤 Ｋ５ ２细 胞 和 ＨＬ ０细 胞 的 实 ＡＰ ６ ６
ＤＨＬ细胞 内积聚 的卟啉九 （ ｐＸ 特征荧光值 。 得了浓度 分别为 ２ ４和 １ Ｐ Ｉ） 获 ， ０ｍｍｏ ・ 的 ５ＡＬ ｌＬ 一 Ａ溶 液中 ， 细胞代谢 的 Ｐ Ｉ ｐＸ含量随孵育时间 的变化情况 。 ＤＨＬ细胞 内积聚 的 Ｐ ｌ ｐＸ处于动态变化过程 ， 呈现 出两 阶 并 段性 的特点 ： 细胞 内积聚的 Ｐ Ｉ ｐＸ含量随着孵 育时间增 长而增加 ，在 ３ｈ附近 达到最大值 ，随后 随着 孵育 时 间增 长反 而下 降。结果表明 ， 基于激光 扫描显微 的双光 子荧光光 谱可 成为 Ｄ ＨＩ细胞 等 白血 病细胞 摄取 ５ 一
Ｄ ＨＬ细胞 是滤泡性淋巴瘤细胞株 （ 由福建 协和医院血液 研究所提供） Ｒ ＭＦ ６ ０培养液 （ 活胎牛血 清含 １ ０ｍＬ 在 Ｐ １４ 灭 ０
・
验＿ 表 明， ＡＬ Ｐ ５ ］ 在 Ａ－ＤＴ 中 ＡＬ 在 细胞 内合成 具 有光 敏 Ａ 性物质 的 Ｐ ｌ 而 Ｐ Ｉ ｐＸ， ｐＸ与铁离子结合 ，在一 系列酶 的作用
Ａ Ａ并生成 Ｐ Ｉ Ｌ ｐＸ的动力学研究的有 效方 法。
关键 词 双光 子激发荧光光谱 ；５氨基酮戊酸 ；卟啉九 ； － ＤＨＩ细胞
中图分 类号 ： ６ ７ ３ ０ ５ ． 文献标 识码 ： Ａ Ｄ ：１ ．９ ４ ｊｉｓ． ０ ００ ９ （０ ８ １—６ ６０ ＯＩ ０ ３ ６ ／．ｓｎ １０ —５３ ２ ０ ）１２３ —４ 下又会被转化合成血 红素 ，即细胞 内合成 的 Ｐ ｌ ｐＸ处 于动态
摘
要
双光 子激 发生物组织荧光 ，激发光仅作用于焦点区域 ， 对生物样品 的光漂 白性和光毒性都很小 ，因
而双 光子荧光 显微技术 已成 为细胞生物学研究 的一种新技术 。文章采用波长为 ８ ０Ｆｒ飞秒激光激发孵育有 ２ ｉ ｌ ｔ ５ＡＬ 的 ＤＨＬ细胞 ，在激光扫描显微镜 的 Ｌ ｍｂ ａ 一 Ａ ａ ｄ 模式 中获得单个 Ｄ ＨＬ细胞 的双光 子荧光 光谱 ，并测量
细胞药代动力学 ， Ｐ Ｔ研究 的关键 问题 。 是 Ｄ 光敏剂在细胞 中 代谢规律 ， 以往研究主要是利用荧光分光光度计测 量在不 同 孵 育时间 ， 细胞 内积聚 的光敏剂特征 荧光峰强 度值 ，然后对 比标准 曲线 间接获得 细胞 中的光敏剂含 量。此类方 法的缺点
是操作烦琐［ ，而且并不能直接测量 出单个细胞 的实际光敏 １ ３ 剂含量 ，误差较大 。