两种动物源性成分阳性质粒分子的构建与检测方法的建立

基金项目：山东省科技厅重点研发计划（2017GSF220018）
作者简介：翟清燕（1989—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：食品微生物学检测与技术研究。

*通信作者：霍胜楠（1980—），女（汉），研究员，博士，
研究方向：食品微生物学检测与技术研究。

食品研究与开发
F ood Research And Development
圆园18年5月
第39卷第10期
DOI ：10.3969/j.issn.1005-6521.2018.10.020
两种动物源性成分阳性质粒分子的构建
与检测方法的建立
翟清燕，郑世超，霍胜楠
（山东省食品药品检验研究院，山东济南250101）
摘
要：旨在构建水貂、紫貂两种成分的阳性质粒分子，对该方法的特异性和灵敏度进行验证，同时对3家公司合成
的引物、探针进行比较，对实时荧光PCR 反应体系进行优化。

结果表明，该检测方法具有较好的特异性和较高的灵敏度，所选择的3家公司的引物、探针均具有较高的检出限，为貂成分检测提供一个新型阳性对照，解决了阳性物质难获取的问题。

关键词：阳性质粒分子；特异性；灵敏度；引物；探针
The Establishment of Detection Methods and Construction of Positive Plasmid Molecule for Two Animal
Derived Components
ZHAI Qing-yan ，ZHENG Shi-chao ，HUO Sheng-nan
（Shandong Institute for Food and Drug Control ，250101，Jinan 250101，Shandong ，China ）
Abstract ：Two kinds of positive plasmids molecule （mink and martes zibellina ）were constructed ，the
specificity and sensitivity were verified ，and the primers and probes synthesized by three companies were compared ，to optimize the real -time PCR reaction system.The results showed that the method had good
specificity and high sensitivity ，the primers and probes from three companies had high detection limit and
provided a new positive control for the detection of mink component ，which solved the difficult problem of the
positive material.
Key words ：positive plasmid molecule ；specificity ；sensitivity ；primer ；probe
引文格式：
翟清燕，郑世超，霍胜楠.两种动物源性成分阳性质粒分子的构建与检测方法的建立[J].食品研究与开发，2018，39（10）：110-115
ZHAI Qingyan ，ZHENG Shichao ，HUO Shengnan.The Establishment of Detection Methods and Construction of Positive
Plasmid Molecule for Two Animal Derived Components[J].Food Research and Development ，2018，39（10）：110-115
近年来，随着人们生活水平的不断提高，各种美食丰富了人们的餐桌，潜伏的食品安全问题也随之出现。

其中，最值得关注的问题就是肉掺假问题，市场上许多不法商家以未经检验的貂肉冒充羊肉、
牛肉掺入肉卷等事件层出不穷[1]，对日常监管和检测能力都提出了新的挑战。

当前，分子生物学是检测动物源性成分的重要手段[2]，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR ）技术是通过热循环对目的基因进行扩增，经过琼脂糖凝胶电泳分析，肉眼估算产物大小的一种检测方法，这种检测手段耗时较长，且溴化乙锭作为荧光染色剂具有一定的致癌性[3]，容易造成人为操作的误差和环境污染。

因此，荧光PCR 技术凭借其省时、特异性强、灵敏度高、无污染等特点，被质检部门
标准与检测
110
广泛的运用到日常检验工作当中，成为打击不法商贩，进而维护消费者合法权益的强有力手段[4]。

在利用荧光PCR 技术对样品进行检测时，通常需要选取含有目的基因的阳性物质作为试验对照，以确保试验结果的准确性，由于有些阳性材料难获取且有证标准物质具有价格昂贵、
制作工艺复杂、有效期短等问题，影响了日常检验工作的开展[5]。

为了解决阳性物质匮乏这一问题，众多检测机构都在研究用阳性质粒分子代替基体标准物质，用于动物源性成分的检测。

2002年，日本科学家Kuribara 等首次提出阳性质粒分子这一概念[6]，阳性质粒分子就是重组质粒分子，具有易构建、纯度高、繁殖快、成本低等优点，这种新型标准物质阳性质粒分子的出现，为动物源性成分的安全监管提供了阳性材料，缓解了由于标准物质缺乏造成的监管压力。

为了解决掺假问题对食品业的影响，商品化食品检测试剂盒作为一种新型快检方法被广泛应用到PCR 分析当中，具有操作简便、方法可靠、
成本可控等特点，适合现场的快速检测[7]。

越来越多的机构投入到试剂盒的研发与生产中，也造成试剂盒质量良莠不齐的现象越来越明显，使得试剂盒的检验质量得不到保证。

针对以上问题，本研究构建了水貂、紫貂两种成分的阳性质粒分子，并对其灵敏度和特异性进行了验证，同时对比了3家公司引物、探针对荧光PCR 反应效率的影响，拟研究出一种经济、高效的实时荧光PCR 反应体系，对于食品中动物源性成分准确可靠的
鉴定具有重要意义和应用前景。

1
材料与方法
1.1质粒的构建
根据设计的PCR 引物，选择水貂线粒体细胞色素
b 基因、紫貂16s rRNA 基因引物对基因组DNA 进行
扩增，得到扩增序列，链接pUC57载体，构建相应阳性质粒DNA 分子，序列合成由济南博尚生物技术有限公司完成。

1.2主要试剂
Premix Ex Taq HS 酶（0.05U/μL ）：Trkara 公司；水
貂、紫貂的引物和探针（见表1）分别由生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon ）、济南博尚生物技术有限公司（Biosune ）、宝日医生物技术（北京）有限公司（Trkara ）三家公司合成。

表1实时荧光PCR 检测引物、
探针Table 1Specific primers and probes sequences in RT-PCR
名称引物序列（5’-3’）
探针序列
水貂
F-GCTTCAATCCTCTATTTCATAA FAM-CCTCCTAGTCTTCATGCCAATCGT -Eclipse
R-GCTTCTTCCTTGAGTCTTA 紫貂F-TAGCRAAGAGACCTTAAG FAM-AACCAGACGAGCTACCTATGAG-Eclipse
R-CTRYAAGTCTTYTCACTA
翟清燕，等：两种动物源性成分阳性质粒分子的构建与检测方法的建立
标准与检测
1.3主要仪器
QuantStudio7Flex 实时荧光PCR 仪：美国ABI 公
司；NanoDrop 2000c 生物紫外可见分光光度计：美国
Thermo 公司；5424R 高速冷冻离心机：德国Eppendorf 公司；UV3HEPA PCR 反应工作台：美国思博明科学器材公司。

1.4实时荧光PCR 检测
实时荧光PCR 反应体系：Premix Ex Taq HS 酶12.5μL ，上下游引物（10μmol/L ）各1μL ，探针
（5μmol/L ）1μL ，样品DNA （10μg/mL~100μg/mL ）2.0μL ，加蒸馏
水补足至25μL 。

实时荧光PCR 反应参数为：95℃/10s ，
1个循环；95℃/5s ，52℃/10s ，72℃/34s ，40个循环。

试验结果用QuantStudio7Flex 实时荧光PCR 仪进行分析，根据SN/T 3730.1-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第1部分：貂成分检测实时荧光PCR
法》[8]
对结果的表述，当Ct 值≤35时判定扩增结果为
阳性。

2
结果与分析
2.1阳性质粒分子检测体系的验证
2.1.1特异性检测
按照1.4的PCR 反应体系，分别以水貂、紫貂阳
性质粒分子为模板进行荧光PCR 扩增，同时以水貂、紫貂提取的DNA 作为阳性对照，以猪肉提取的DNA 作为阴性对照，以灭菌水作为空白对照，对所构建的水貂、紫貂阳性质粒分子的PCR 反应体系进行特异性验证。

检测结果表明，两种质粒分子和阳性对照均在40个循环内出现显著扩增，阴性对照没有信号，表明
构建的两种质粒具有良好的特异性，可以代替基因组作为阳性对照来使用（图1）。

111
性，以能够检出样品的最低浓度作为相应的检出下限，由此可见，水貂、紫貂质粒分子的灵敏度检出下限分别为10-4、10-3ng/μL ，均具有较高的检测灵敏度。

2.1.3标准曲线的绘制
以X 轴代表质粒拷贝数的对数，Y 轴代表Ct 值，
绘制标准曲线（见图3）[9]。

图2阳性质粒分子实时荧光PCR 特异性检测结果
Fig.2Real-time fluoresce quantitative sensitivity curve of positive plasmid molecule
17500000
15000000125000001000000075000005000000
25000000
2
4
40
循环数
6
8
101214161820222426283032343638阴性对照
水貂基因组
水貂质粒
880916.229764
6000000550000050000004500000400000035000003000000250000020000001500000
1000000500000
-500000
2440
循环数
68
101214161820222426283032343638阴性对照
紫貂基因组
紫貂质粒
318580.045041图1阳性质粒分子实时荧光PCR 特异性检测结果
Fig.1Real-time fluoresce quantitative specificity curve of positive plasmid molecule
7000000
650000060000005500000500000045000004000000350000030000002500000200000015000001000000
5000000
2440
循环数
68
101214161820222426283032343638阴性对照
10-3ng/μL
紫貂225493.264469
12000000110000001000000090000008000000700000060000005000000400000030000002000000
10000000
2440
循环数
68101214161820222426283032343638阴性对照
10-4ng/μL
水貂
616073.665096
翟清燕，等：两种动物源性成分阳性质粒分子的构建与检测方法的建立
标准与检测
2.1.2灵敏度验证
将水貂、紫貂阳性质粒分子进行10倍浓度梯度稀
释，从100ng/μL 稀释至10-5ng/μL ，用梯度稀释后的
质粒做模板进行荧光PCR 扩增，分别对灵敏度进行验证，结果见图2。

通常认为，当Ct 值≤35时，可判定被检样品为阳
112
根据图3标准曲线可知，当质粒浓度从100ng/μL~10-2ng/μL 时，随质粒稀释度的增加，对应的Ct 值也逐渐增大，且具有一定的梯度关系。

两个标准曲线的扩增效率分别为103.211%、98.834%，且相关系数R 2均大于0.99，说明在模板浓度范围内都具有很好的线性关系，可以用于样品的定量分析。

2.2不同公司引物探针对实时荧光PCR 反应的影响将水貂、紫貂阳性质粒分子进行10倍梯度稀释，
从100ng/μL 稀释至10-5ng/μL ，选取Sangon 、Biosune 、Trkara 三家公司合成的引物、探针对各浓度模板分别进行实时荧光PCR 反应，对其反应效果进行比较分
析，结果见图4~图5。

检测结果表明，使用3家公司合成的引物、探针对各浓度模板进行扩增时均可得到标准的S 型扩增曲线，所有扩增曲线拐点清楚，指数增长期明显，基线平稳无上扬[10]，且扩增曲线的重复性比较好，基线起峰范围适当，Ct 值随模板浓度下降而下降[11]，不同的引物、探针所得到的检出限略有不同。

如图4所示，利用Sangon 、Biosune 、Trkara 合成的引物、探针分别进行实时荧光PCR 反应，水貂阳性质粒的灵敏度检出限分别为10-4、10-4、10-3ng/μL 。

显然，
Sangon 与Biosune 合成引物、探针的灵敏度检出限与26
2524232221201918171615141312
0.0010.002
1000
水貂阳性质粒分子浓度/（ng/μL ）
0.010.1水貂0.020.2
12345102030100200水貂阳性质粒标准曲线
32.532.027.525.022.520.017.515.012.5
0.0010.002
1000
水貂阳性质粒分子浓度/（ng/μL ）
0.010.1紫貂
0.02
0.2
12345102030100200紫貂阳性质粒标准曲线
图3阳性质粒分子实时荧光PCR 标准曲线
Fig.3Real-time fluoresce quantitative standard curve of positive plasmid molecule
1750000015000000125000001000000075000005000000
25000000
2
4
40
循环数
6
8
10121416182022242628303234363810-4ng/μL
水貂-Sangon
940706.748715
翟清燕，等：两种动物源性成分阳性质粒分子的构建与检测方法的建立
标准与检测
113
Trkara 相比要高一个浓度梯度，且重复性和反应效率都略优于Trkara 公司的DNA 聚合酶。

由图5可知，利用Sangon 、Biosune 、Trkara 合成的
引物、探针分别进行实时荧光PCR 反应，紫貂阳性质
粒的灵敏度检出限分别为10-3、10-2、10-1ng/μL 。

可见，Sangon 公司合成引物、探针的灵敏度最高，且反应效
12000000
110000001000000090000008000000700000060000005000000400000030000002000000
10000000
-1000000
2440
循环数
68
10121416182022242628303234363810-4ng/μL
水貂-Biosune 573446.28089
7000000
65000006000000550000050000004500000400000035000003000000250000020000001500000
1000000500000
2
4
40
循环数
6
810121416182022242628303234363810-3ng/μL
水貂-Trkara 410584.780291图43家公司引物、探针实时荧光PCR 反应效果比较（水貂）
Fig.4Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of primers and probes of three companies （mink ）
60000005500000500000045000004000000350000030000002500000200000015000001000000
5000000
-500000
2440
循环数
68
10121416182022242628303234363810-3ng/μL
紫貂-Sangon
297646.526468
60000005500000500000045000004000000350000030000002500000200000015000001000000
5000000
-500000
2440
循环数
68
10121416182022242628303234363810-3ng/μL
紫貂-Biosune 297646.526468
翟清燕，等：两种动物源性成分阳性质粒分子的构建与检测方法的建立
标准与检测
114
6000000
5500000500000045000004000000350000030000002500000200000015000001000000
5000000
-500000
2440
循环数
68
10121416182022242628303234363810-1ng/μL
紫貂-Trkara
297646.526468
图53家公司引物、
探针实时荧光PCR 反应效果比较（紫貂）Fig.5Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of primers and probes of three companies （Martes zibellina ）
翟清燕，等：两种动物源性成分阳性质粒分子的构建与检测方法的建立
标准与检测
率高于其他两家公司。

3
结论
引物、探针的正确选择是PCR 反应成功的前提，高质量的引物、探针对PCR 扩增效率具有很大的影响[12]。

完成水貂、紫貂两种阳性质粒分子的构建，发现这两种质粒分子均具有灵敏度高、特异性强等特点，同时对PCR 反应的关键技术指标-引物、探针进行验证，发现Sangon 公司合成的引物、探针的灵敏度略优于Biosune 与TaKaRa 公司。

为进行荧光PCR 反应时引物、探针的选择提供一定的技术依据，为广大食品企业及有关监管部门监测评价和控制动物制品的品质提供新的思路和有效手段，对于食品中动物源性成分日常鉴定和风险评估具有重要的应用价值。

参考文献：
[1]李欣楠,关一夫.掺假肉检验技术现状[J].食品研究与开发,2016,37(5):189-193
[2]侯东军,韩合敬,郝智慧,等.三重荧光PCR 法鉴定食品中牛、猪、
鸭3种动物源性成分[J].畜牧与兽医,2016,48(4):45-48[3]
Kitpipit T,Sittichan K,Thanakiatkrai P.Direct-multiplex PCR as -say for meat species identification in food products[J].Food Chem -istry,2014(163):77-82[4]郭凤柳,熊蕊,刘晓慧,等.应用PCR 技术检测掺假肉类[J].食品
安全质量检测学报,2014,5(2):541-545[5]
Taverniers I,Van Bockstaele E,De Loose M.Cloned plasmid DNA fragments as calibrators for controlling GMOs:different real -time duplex quantitative PCR methods[J].Anal Bioanal Chem,2004,378:1198-1207
[6]
Kuribara H,Shindo Y,Matsuoka T,et al.Novel reference molecules for quantitation of genetically modified maize and soybean [J].J AOAC Int,2002,85(5):1077-1089
[7]蔡珊珊.商品化食品安全检测试剂盒评价制度研究[D].福州:福
建农林大学,2013
[8]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 3730.3-2013
食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第1部分:貂成分检测实时荧光PCR 法[S].北京:中国标准出版社,2014:1-5[9]
关棣锴,胡文忠,朴永哲,等.单核细胞增生性李斯特氏菌荧光定量PCR 快速检测方法的建立及初步应用[J].食品工业科技,
2014,35(20):49-52
[10]高东,孙宏伟,刘雪清,等.水稻MOC1mRNA TaqMan 实时荧光
定量RT-PCR 检测方法的建立[J].分子植物育种,2008,6(6):
1197-1203
[11]刘烜,郑文杰,赵卫东,等.饲料中六种动物源性成分多重PCR
快速检测方法[J].食品研究与开发,2009,30(3):141-143[12]Qu W,Shen Z,Zhao D,et al.MFEprimer:multiple factor evaluation
of the specficity of PCR primers[J].Bioinformatics,2009,25(2):276-
288
收稿日期：2017-11-09
115。