17.抗菌药物敏感性试验

操作
待检菌液
无菌棉签 涂布
MH琼脂表面
室温 5min
贴含药纸片 35℃ 观察 16～18h 结果
操作注意事项：
• 菌液应在15分钟内接种完毕 • 注意纸片距离
＞15mm ＞24mm
3．结果解释
• 测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
• 敏感(susceptibile ，S) 推荐剂量的抗菌药物 在体内达到的血药浓度能抑制或杀死待测菌。
•常量肉汤稀释法 •微量肉汤稀释法 •琼脂稀释法
（一）肉汤稀释法
试管肉汤稀释法和微量肉汤稀释法。 1.试管肉汤稀释法
• 方法
– 抗 生 素 的 配 制 （ μ g/ml ） ： 512 、 256 、 128……
– 培养基：MH肉汤 – 待检菌液：107CFU/ml
方法
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
以扩大病原治疗的覆盖面； ② 治疗多种细菌所引起的混合感染； ③ 对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用； ④ 减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生； ⑤ 减少治疗指数低的抗菌药物的用量从而减轻其毒副
作用。
• 联合药敏试验的常用方法
– 纸片扩散法 – 棋盘法
• 特点：
– 操作简便同扩散法， – 同稀释法一样可以直接定量出测试药物对测试
M-H肉汤(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
抗生素(ml) 菌液(ml)
1
1
1
1
1
1
1
1
1弃 －
去
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
35℃孵育16~18h，观察结果
结果观察 以完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC
左起第四管为药物最低浓度而肉眼无细菌生长，即待测菌的MIC为16mg/L
与核糖体50S亚基结合，抑制肽 氯霉素、甲砜霉素等 酰基转移酶，使肽链延伸受阻， 从而抑制蛋白质合成。
抗菌药物种类
作用机理
主要药物
喹喏酮类 抑制DNA复制中的回旋酶， 第一代：窄谱，对G+菌无作用，
阻碍DNA的解链。
目前少用
第二代：G+菌和G-菌均有作用 （环丙沙星、氧氟沙星）
第三代：超广谱（司帕沙星、 妥舒沙星、左氟沙星）
• 质量控制 基本和肉汤稀释法相同，每个琼脂平
板应同时接种标准菌株。
• 优点：可同时作多株细菌的MIC测定，结果的可靠
性优于肉汤稀释法，且易发现污染或耐药交叉株， 是开发新药的体外药敏试验常用的经典参照标准
• 缺点：费时费力
（三）E试验
• 原理：是一种结合了稀释法扩散法的原理和特点测
定细菌对抗菌药物的敏感度的定量技术。
抑 磺胺类
制
核
酸
合 成
利福霉素 类
硝基呋喃
类
与对氨基苯甲酸（PBPA） 磺氨甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺 竞争二氢叶酸合成酶，阻断 甲氧吡嗪等 叶酸的合成，使细菌DNA 合成受阻。
抑制细菌mRNA合成，最后 利福霉素、利福平等 导致DNA和蛋白合成停止。
进入菌体后，经还原产生的 呋喃坦啶、呋喃唑酮 衍生物可使DNA链断裂
影响因素
培养基的组成、pH、渗透压、电解质 接种菌量 抗菌药物 质、量 培养时间
质量控制
采用标准菌株同批测试，MIC应当在相应的质
控范围内。如超出该范围则应检查原因，及时
纠正。
（二）微量肉汤稀释法
• 微量肉汤稀释法的含药微孔板（条）有多种
现成的商品试剂供应，并常与自动化仪器配 套使用。
与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关， 即抑菌圈越大，MIC越小。
2．方法
• 抗菌药物纸片 自制或商品供应。-20℃保存备用 • 培养基 水解酪蛋白(Mueller-Hinton,MH)琼脂
琼脂厚度4mm
• 待检菌液 1.5×108 CFU／ml
菌液制备方法：
– 直接菌落悬液法 – 液体生长法
（二）稀释法（dilution method）
用培养基将抗菌药物作不同浓度稀释，再接种待检细
菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死细菌的最低抗生素 浓度。
最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,
MIC)
最低杀菌浓度(minimal bactericidal
concentration, MBC)
细菌对抗菌药物敏感试验
成都医学院 临床微生物学教研室
药敏试验的目的： 预测治疗效果（否定＞肯定），为临床医生
选择药物提供依据 监测耐药性的变迁及流行趋势 对新研制的抗菌药物的抗菌谱及抗菌活性进
行评价 鉴定细菌
一、常用抗菌药物及其作用机理
抗菌药物种类
β-内酰胺类
干 扰 细 胞 壁 合 成
分子生物学试验 PCR直接检测mecA基因 酶试验 β -内酰胺酶、超广谱β -内酰胺酶（ESBL）
（一）纸片琼脂扩散法(Kirby-Bauer test)
• 美国临床和实验室标准化学会（Clinical and
Laboratory Standards Institute ,CLSI）推 荐的标准实验方法。 CLSI过去称作美国国家临 床实验室标准委员会(National Committee of Clinical Laboratory Standard, NCCLS)
纸片法联合药敏试验的结果与类型
1.协同作用 A+B＞A＋B
2.相加作用 A+B＝A＋B
3.无关作用 A+B＝A或B
4.拮抗作用 A+B＜A或B
②药敏纸片的质量 含药量和保存方式。 ③接种菌量 ④操作质量 接种后贴药片的时间；培养温度
和时间；抑菌圈测量工具的精度
5．质量控制
采用标准菌株与测试菌在同一条件下做药敏试验。 标准菌株的抑菌圈应落在预期范围内。如果超出该范围， 则不应发出报告，及时检查原因，予以纠正。
ATCC25923 金黄色葡萄球菌 ATCC25922 大肠埃希菌 ATCC27853 铜绿假单胞菌 ATCC29212 或 33186 粪肠球菌
菌的MIC – 结果准确、重复性好。
• 缺点：成本较贵
1.纸片法联合药敏试验
• 纸片法联合药敏试验所用的培养基、药敏纸片、
菌液和培养条件等均和纸片法药敏试验相同。
• 将所要试验的两种药敏纸片邻近贴在涂菌的琼脂
平板上，使两纸片的中心距离恰好等于两药敏纸 片单独试验时抑菌圈的半径之和，按规定条件孵 育之后观察抑菌圈的形状改变，并据此判断两药 联合药敏试验的结果
• 耐药(resistant，R)：常规剂量的抗菌药物在体 内达到的血药浓度不能抑制或杀死待测菌。
• 中介（intermediate，I）抗菌药物在生理浓集 的部位具有临床效果；也代表缓冲区域，以防止 由微小的技术因素导致的结果偏差。
4.影响纸片法药敏结果的因素
①培养基质量 成分、pH、深度、硬度和表面 湿度等。
E试条是一种宽5mm、 长50mm的商品化塑料试 条，一面固定有干化、 稳定的、浓度呈连续指 数增长分布的抗菌药物， 另一面有药物的浓度刻 度读数（μg/ml）
• 方法：同纸片琼脂扩散法
（四）联合药敏试验
临床上在以下情况下需联合使用抗菌药物： ① 用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治疗，
作用于细胞壁，与粘 万古霉素、替卡拉宁等 肽的侧链形成复合物， 抑制肽聚糖链延伸或 肽链交联。
抗菌药物 种类
氨基糖 苷类
四环素 抑类 制 蛋 白 大环内 质 酯类 合 成 林可酰
胺类
氯霉素 类
作用机理
主要药物
与30S小亚基不可逆地结合，抑 庆大霉素、妥布霉素、
制蛋白质的合成。
奈替米星、阿米卡星、
大观霉素等
• 目前各国临床微生物学实验室广泛采用。
1．原理
• 将含有定量抗菌药物的纸片贴在测
试菌的琼脂平板上，纸片中所含的 药物溶解后不断地向纸片周围扩散， 形成递减的浓度梯度。在纸片周围 可抑菌浓度范围内测定菌的生长被 抑制，从而形成无菌生长的透明圈 抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感性，并
糖肽 类
作用机理
主要药物
竞争性与PBPs结合， 1.青霉素类（天然青霉素、耐酶青霉素、
抑制肽聚糖合成所需 广谱青霉素等）
的转肽酶、羧肽酶或 2.头孢菌素类（第1代～第4代）
二肽酶等，从而抑制
3.单环β－内酰胺类（氨曲南、卡芦莫南） 4.头霉素类 （头孢西丁、头孢替坦、头孢
细胞壁的合成。
美唑）
5.氧头孢烯类（拉氧头孢） 6.碳青霉烯类（亚胺培南、美罗培南 等） 7.青霉烯类（呋罗培南 、利替培南酯等） 8.β-内酰胺酶抑制剂（克拉维酸、舒巴坦）
硝基咪唑 类
通过其分子中的硝基在无氧 环境中还原成氨基或通过自 由基的形成，与细胞成分相 互作用，从而导致微生物的 死亡。
甲硝唑、替硝唑、奥硝唑等
二、AST的常用方法
手工试验
1.纸片扩散法（S，I，R） 2.稀释法（MIC） 3.E test（MIC）
自动仪器 1. Vitek 2. Microscan 3. Sensititre
（三）琼脂稀释法
• 原理：将不同浓度的抗菌药物混匀于琼脂培养基中，
接种细菌，孵育后观察细菌的生长情况来确定MIC。
• 方法：制备含药琼脂（药液：琼脂=1：9 ）→ 点
种细菌（1-2μ l）→ 35℃孵育16-20h →观察结果
• 结果观察：点种菌液处未见细菌生长即是被药物所
抑制。菌落生长被完全抑制的最低药物药物浓度为 该药对待测菌的MIC（μ g/ml）。
作用于核糖体30S亚基A位，影 响蛋白质合成初始阶段和释放， 相互之间存在着密切的交叉耐药 性。