细菌内毒素验证
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细菌内毒素方法验证
1
细菌内毒素验证基本程序
试验准备 计算MVD 初筛试验
确定样品内毒素限值
选择试剂
鲎试剂灵敏度复核试验
供试品干扰
干扰试验
结果判断
计算公式：MVD=cL/λ
MVD为供试品的最大有效稀释倍数，c为供试品溶液的浓度，L供试品的细菌内毒素限值。如果 计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式MVc=λ /L.
MVC0.03 --
供试品阳性
--
++
++
++
对照
供试品在某浓度开始无干扰，可选择该浓度或者跟低浓度进行干扰试验
BET水 -++
5
干扰试验预试验
• 结果三
供试品浓度 供试品溶液
MVC0.25 ++
MVC0.125 ++
MVC0.06 ++
MVC0.03 ++
供试品阳性对 + +
++
照
假阳性，更换另一批供试品进行测试 结果四
100单位/ml→20单位/ml→10 单位/ml→5 单位/ml→2.5 单位/ml→1.25 单位 /ml→0.625 单位/ml→0.3125 单位/ml→0.156ml /ml→0.078 单位/ml→0.039 单
位/ml
分别用4λ的内毒素标准品与各梯度的供试品等量稀释，得到相应的供试 品阳性对照。
3
干扰试验预试验
• 先用少量的鲎试剂初步确定供试品的最大 不干扰浓度，为正式干扰试验提供依据。
• 例：某样品C：100单位/ml L：0.8 EU/单位 λ：0.25 EU/ml
MVD0.25 = 320倍 MVC0.25 = λ / L=0. 3125 单位/ml MVC0.125= λ / L =0.156单位/ml MVC0.06= λ / L = 0.078单位/ml MVC0.03 = λ / L = 0.039 单位/ml
• 结果判断：反应管缓缓倒转180°， 阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱落； 阴性（-）：未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者。 实验有效：NC管全部阴性（ - - ）， 2.0 λ管全部阳性（+ + + +）， 0.25λ管全部阴性（- - - - ）。
数据处理：灵敏度测定值λc=antilg(ΣX/n)。X：为反映终点浓度的对数值（lg), 反映终点浓度是系列浓度递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
供试品浓度
MVC0.25
MVC0.125
供试品溶液
--
--
++
MVC0.06 --
源自文库++
MVC0.03 --
供试品阳性对
--
照
--
--
--
BET水 -++
BET水 -++
假阴性，消除干扰后再测试
6
正式干扰试验
• 根据最大不干扰浓度选用相应灵敏度的鲎试剂作正式干扰试验。
编号
内毒素浓 度/被加入
内毒素的 溶液
• 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液 C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。
• 干扰试验中我们需要对三批供试品，两个不同厂家的鲎试剂进行试验
8
干扰试验结果举例
例1、批号1——厂家1鲎试剂试验结果
2λ（ 2λ ）
++ ++ + +
1λ（ 1λ ）
++ ++ + +
正式干扰试验结果计算：用内毒素检查用水制成的内毒素 标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品 溶液制成的内毒素的反应终点浓度的几何平均值（Et）。
Es= antilg (∑Xs/4) Et = antilg (∑Xt/4) Xs，Xt分别为系列溶液反应终点浓度的对数值（lg）。
10
11
4
干扰试验预试验
• 结果一
供试品浓度
供试品溶液 供试品阳性 对照
MVC0.25 -++
MVC0.125 -++
MVC0.06 -++
MVC0.03 -++
供试品无干扰或者干扰很小，可用上述任一浓度进行干扰试验
• 结果二
BET水 -++
供试品溶液
MVC0.25 MVC0.125
--
--
MVC0.06 --
稀释用 液
稀释 倍数
所含内毒 素的浓度
平行管
A
无/供试品 —
—
—
2
溶液
B
2λ /供试品 供试品 1
2λ
4
溶液
溶液
2
1λ
4
4
0.5λ
4
8
0.25λ
4
C
2λ /检查用 检查用 1
2λ
2
水
水
2
1λ
2
4
0.5λ
2
8
0.25λ
2
D
无/检查用 —
—
—
2
水
7
正式干扰试验
• 上张表中，A为供试品溶液，B为干扰试验系列；C为鲎试剂表示灵敏 度的对照系列；D为阴性对照
2
鲎试剂灵敏度复核试验
• 根据鲎试剂灵敏度的标示值（ λ ），将细菌内毒素工作标准品加入1ml内毒素检查 用水溶解，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后按所用的鲎 试剂灵敏度2λ、λ、0.5λ、0.25λ进行稀释。0.1ml鲎试剂+ 0.1ml标准品，平行4管； NC： 0.1ml鲎试剂+ 0.1mlBET用水，平行2管37℃±1℃孵育60min±2min。
0.5λ（ 0.5λ ）
---
0.25λ（ 0.25λ ）
---
阴性对照 -
2、批号1——厂家2鲎试剂试验结果
2λ（ 2λ ）
++ ++ + +
1λ（ 1λ ）
++ ++ -
0.5λ（ 0.5λ ）
---
0.25λ（ 0.25λ ）
---
阴性对照 -
3、重复做3批，计算结果
9
正式干扰试验接受标准 当阴性对照4管为阴性，两组最大浓度2λ均为阳性，最低 浓度0.25λ均为阴性时，试验结果有效。Et/Es值在0.5～2 （包括0.5、2）之间为无干扰，反之为有干扰
1
细菌内毒素验证基本程序
试验准备 计算MVD 初筛试验
确定样品内毒素限值
选择试剂
鲎试剂灵敏度复核试验
供试品干扰
干扰试验
结果判断
计算公式：MVD=cL/λ
MVD为供试品的最大有效稀释倍数，c为供试品溶液的浓度，L供试品的细菌内毒素限值。如果 计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式MVc=λ /L.
MVC0.03 --
供试品阳性
--
++
++
++
对照
供试品在某浓度开始无干扰，可选择该浓度或者跟低浓度进行干扰试验
BET水 -++
5
干扰试验预试验
• 结果三
供试品浓度 供试品溶液
MVC0.25 ++
MVC0.125 ++
MVC0.06 ++
MVC0.03 ++
供试品阳性对 + +
++
照
假阳性，更换另一批供试品进行测试 结果四
100单位/ml→20单位/ml→10 单位/ml→5 单位/ml→2.5 单位/ml→1.25 单位 /ml→0.625 单位/ml→0.3125 单位/ml→0.156ml /ml→0.078 单位/ml→0.039 单
位/ml
分别用4λ的内毒素标准品与各梯度的供试品等量稀释，得到相应的供试 品阳性对照。
3
干扰试验预试验
• 先用少量的鲎试剂初步确定供试品的最大 不干扰浓度，为正式干扰试验提供依据。
• 例：某样品C：100单位/ml L：0.8 EU/单位 λ：0.25 EU/ml
MVD0.25 = 320倍 MVC0.25 = λ / L=0. 3125 单位/ml MVC0.125= λ / L =0.156单位/ml MVC0.06= λ / L = 0.078单位/ml MVC0.03 = λ / L = 0.039 单位/ml
• 结果判断：反应管缓缓倒转180°， 阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱落； 阴性（-）：未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者。 实验有效：NC管全部阴性（ - - ）， 2.0 λ管全部阳性（+ + + +）， 0.25λ管全部阴性（- - - - ）。
数据处理：灵敏度测定值λc=antilg(ΣX/n)。X：为反映终点浓度的对数值（lg), 反映终点浓度是系列浓度递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
供试品浓度
MVC0.25
MVC0.125
供试品溶液
--
--
++
MVC0.06 --
源自文库++
MVC0.03 --
供试品阳性对
--
照
--
--
--
BET水 -++
BET水 -++
假阴性，消除干扰后再测试
6
正式干扰试验
• 根据最大不干扰浓度选用相应灵敏度的鲎试剂作正式干扰试验。
编号
内毒素浓 度/被加入
内毒素的 溶液
• 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液 C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。
• 干扰试验中我们需要对三批供试品，两个不同厂家的鲎试剂进行试验
8
干扰试验结果举例
例1、批号1——厂家1鲎试剂试验结果
2λ（ 2λ ）
++ ++ + +
1λ（ 1λ ）
++ ++ + +
正式干扰试验结果计算：用内毒素检查用水制成的内毒素 标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品 溶液制成的内毒素的反应终点浓度的几何平均值（Et）。
Es= antilg (∑Xs/4) Et = antilg (∑Xt/4) Xs，Xt分别为系列溶液反应终点浓度的对数值（lg）。
10
11
4
干扰试验预试验
• 结果一
供试品浓度
供试品溶液 供试品阳性 对照
MVC0.25 -++
MVC0.125 -++
MVC0.06 -++
MVC0.03 -++
供试品无干扰或者干扰很小，可用上述任一浓度进行干扰试验
• 结果二
BET水 -++
供试品溶液
MVC0.25 MVC0.125
--
--
MVC0.06 --
稀释用 液
稀释 倍数
所含内毒 素的浓度
平行管
A
无/供试品 —
—
—
2
溶液
B
2λ /供试品 供试品 1
2λ
4
溶液
溶液
2
1λ
4
4
0.5λ
4
8
0.25λ
4
C
2λ /检查用 检查用 1
2λ
2
水
水
2
1λ
2
4
0.5λ
2
8
0.25λ
2
D
无/检查用 —
—
—
2
水
7
正式干扰试验
• 上张表中，A为供试品溶液，B为干扰试验系列；C为鲎试剂表示灵敏 度的对照系列；D为阴性对照
2
鲎试剂灵敏度复核试验
• 根据鲎试剂灵敏度的标示值（ λ ），将细菌内毒素工作标准品加入1ml内毒素检查 用水溶解，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后按所用的鲎 试剂灵敏度2λ、λ、0.5λ、0.25λ进行稀释。0.1ml鲎试剂+ 0.1ml标准品，平行4管； NC： 0.1ml鲎试剂+ 0.1mlBET用水，平行2管37℃±1℃孵育60min±2min。
0.5λ（ 0.5λ ）
---
0.25λ（ 0.25λ ）
---
阴性对照 -
2、批号1——厂家2鲎试剂试验结果
2λ（ 2λ ）
++ ++ + +
1λ（ 1λ ）
++ ++ -
0.5λ（ 0.5λ ）
---
0.25λ（ 0.25λ ）
---
阴性对照 -
3、重复做3批，计算结果
9
正式干扰试验接受标准 当阴性对照4管为阴性，两组最大浓度2λ均为阳性，最低 浓度0.25λ均为阴性时，试验结果有效。Et/Es值在0.5～2 （包括0.5、2）之间为无干扰，反之为有干扰