单细胞凝胶电泳步骤新版

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单细胞凝胶电泳

单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首创的,以后经Singh 等(1988)进一步完善而逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法,因其细胞电泳形状颇似慧星,又称慧星试验(cometassay)。

原理：该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，在DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其他生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其他成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，惟独核DNA 仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。

如果细胞未受损伤，电泳中核DNA 因其分子量大而停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。

若细胞受损，在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开DNA向阳极迁移，形成拖尾。

细胞核DNA 损伤愈重，产生的断链或碱易变性片段就愈多，其断链或短片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。

因此，通过测定DNA 迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。

SCGE是评价遗传毒性损害非常敏感的实验,可以检测到每1.657×10-37kg中0.1个DNA 的断裂。

所需试剂：1）PBS2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）3）0.6%低熔点凝胶（PBS配制）4）毛玻璃片5）盖玻片6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠），临用前加10%DNMSO，1%Triton X-1007）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris-HCl，pH7.5）8）EB（2ug/ml）单细胞凝胶电泳步骤1、分离制备单细胞悬液：（1）体外培养的细胞株：用胰酶消化，最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液，细胞要计数，具体的量我前边已经说过。

@单细胞凝胶电泳

将混有待测细胞的琼脂糖铺于载玻片上，凝固后浸入冷溶解液中使细胞裂解，在电泳液中解链后水平电泳，洗涤后用DNA 结合荧光染料染色，在荧光显微镜下观察玻片上细胞的荧光图像，评价DNA 的损伤程度。

3.1 形状指标这是一类比较粗略的指标。

根据细胞荧光图像是否象慧星一样头尾分明将其分为慧星一样细胞和非慧星样细胞，计数一定量细胞中慧星样细胞所占的比例，即慧星样细胞发生率，估计DNA 的损伤程度。

这种指标可通过镜下观察直接得到，方便实用。

3.2 距离指标直接在显微镜下或在照片上测出慧星的一些长度数值，如尾长，即沿电泳方向“慧星”尾部最远端与头部中心间接的距离；总慧星长度，即“慧星”电泳方向上的最大长度；尾长与头部直径比值等，以评价DNA损伤程度。

这些指标描述电泳中DNA泳动的距离，易于测量，无需复杂的仪器设备及图像处理软件，而且在损伤因素剂量较大时，这些数值的大小与作用剂量之间有较为良好的线性关系。

3.3 强度指标Ostling等人最初用SCGE 技术检测射线对DNA损伤时用“慧星”头部中心处荧光强度与电泳方向上一定距离处荧光强度的比值来描述DNA 的损伤。

PoI1er 等人用“慧星”尾部总荧光强度同“慧星”头部总荧光强度的比值来表示DNA 的损伤程度。

新近有报道根据“ 星”尾部荧光强度将细胞分为五类，由弱到强分别计为0、1、2、3、4，将100 个细胞的分值加在一起表示DNA 的损伤程度，并证明该数值与总慧星长度有较好的相关性。

这些指标都不同程度地反映了电泳中泳动DNA 的量。

3.4 “矩”类指标为反映DNA 损伤，上述距离类指标和强度类指标均不全面，有实验证明损伤因素作用剂量增大时，DNA 损伤程度明显增加而尾长基本不变。

为将二者结合起来，更全面反映DNA 损伤程度，Olive 等人于1990 年首次描述了“尾矩”（tail moment ，TM ）的概念，定义为尾部DNA 占总DNA 的百分比与头、尾部中心间距的乘积。

SCGE单细胞凝胶电泳

单细胞凝胶电泳实验方案（实验预备）1，制胶：在adorf管中加入0.018g琼脂糖，加3mlPBS置于大烧杯中隔水加热使得琼脂糖溶解。

加热时间大约为3个小时（注意加热时添加水，同时防止水进入胶中）。

制好的凝胶中应无颗粒。

2，配制PBS（pH=7.4）3，磨片4，配制裂解液（500ml）：称取NaCl :73.15g，Na2EDTA:18.612g，Tris:0.6057g加热溶解后再称取肌氨酸钠:5g 加入上述溶液。

用前加入10%DMSO(二甲亚砜):50ml和1%TritonX-100:10ml的混合液（此混合液先用NaOH调制成pH=10）5，配制电泳缓冲液：NaOH:12g、Na2EDTA:0.372g;、蒸馏水:1000ml。

6，中和液：（pH=7.5）Tris: 24.25g、NaCl:10.8mg 溶于400ml蒸馏水中，定容至50ml。

7，单细胞悬液制备：取肝、肾等目标组织置于青霉素小瓶内除被膜，先用眼科剪刀剪成小块，再用预温的37℃PBS洗两遍，然后用眼科剪刀尽量剪碎脏器。

加适量PBS悬浮细胞，收集细胞悬浮液于1.5ml的dorf管中，静置下沉3min，将上部均匀悬液转至1.5ml的adorf管中，4000r/min，离心30s，其上清，用适当的PBS将细胞浓度调制104-105个/ml。

用台盼蓝排斥法观察细胞存活率，或者剪碎后用1ml无针头针筒吹吸2-3min加PBS后过110目不锈钢筛网过滤收集细胞悬液。

8，EB配制（50mg/L）母液：称取0.03gEB于5ml的adorf管中加入ml蒸馏水配成母液，用前取母液3ul和1000ul蒸馏水稀释。

制法：A，在45℃下将正常溶点的琼脂糖（NMA）的磷酸缓冲液(PBS)浇注到磨粗的载玻片上，置于4℃下10min使得琼脂糖固化。

B，在37℃下，将约1000个悬于10ul的PBS中的受检细胞与75ul0.5%低熔点琼脂糖相混（LMA）。

凝胶电泳操作步骤

琼脂糖凝胶电泳（一）材料（二）试剂1、1*TAE2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。

3、DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、RNA甲醛变性胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mM EDTA(PH8.0)，50%甘油（w/v），用DEPC水配制，高压灭菌备用。

常使用，深黄色应弃用。

波炉中将琼脂糖融化均匀。

在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；3．加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。

用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。

（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。

4．电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。

当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。

样品由围降低。

当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

5．观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。

在波长为254nm的紫外灯下观察染色条带。

于凝胶成像系统中拍照并保存之。

（二）在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳（选做）配制23 mL甲醛电泳胶：0.336g琼脂糖溶于20mL DEPC水中，冷却至60?C，加入5mL的5x甲醛变性胶电泳缓冲液和5.5mL的甲醛，在通风橱内倒胶，冷却30分钟后使用。

甲醛变性胶RNA样品的制备：1μL RNA，5?甲醛变性胶电泳缓冲液0.5μL，甲的EB。

步骤：4．小心地进行点样，记录样品次序与点样量；然后开始电泳，电压为3-4V/cm。

单细胞凝胶电泳技术

单细胞凝胶电泳技术的试验步骤试剂及材料：1）0.01M PBS pH7.3：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.3，最后加蒸馏水定容至1L即可。

保存存于室温或4℃冰箱中。

2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）3）0.6％低熔点凝胶（PBS配制）4）毛玻璃片5）盖玻片6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠），临用前加10％DNMSO，1％Triton X-1007）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH7.5）8）EB（2ug/ml）步骤：1.制备第一层胶：100ml 0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min；2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6％低熔点胶（cell 与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固化10min；3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10％DMAO，1％Triton X-100），4℃裂解1h；4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。

5.电泳：电压20V，300mA，30min6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；或双蒸水漂洗2次，每次5～15min，7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。

或者4℃，潮湿，闭光的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。

1.2.5 改良彗星试验操作步骤为节省实验时间，本研究将铺三层胶法改为铺一层胶法，同时在中和及染色等步骤进行了改良，具体操作如下:将已染毒的淋巴细胞悬液与40℃的1%低溶点琼脂糖等浓度混匀后，取70μl混合液直接滴加在磨毛玻片上，加盖玻片，4℃冷凝，20min后揭盖片;4℃于碱性裂解液中裂解1h;解旋20min;4℃电泳（25V，300mA）30min;中和5min;加碘化丙啶，暗处染色10min，加盖片;于莹光显微镜下镜检，照像。

凝胶电泳步骤

凝胶电泳步骤
凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA或蛋白质的常用实验方法。

以下是凝胶电泳的一般步骤：
1. 准备凝胶：根据需要分离的目标分子大小选择合适的凝胶，常用的有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。

按照产品说明书的要求溶解凝胶粉末，并加入缓冲液，进行融化和固化。

2. 准备样品：根据实验目的，将需要分离的DNA、RNA或蛋白质样品进行处理。

例如，可以通过酶切DNA，或者将蛋白质样品进行还原和变性处理。

3. 装置凝胶电泳槽：使用凝胶电泳槽，将凝胶定位在槽中并加入足够的缓冲液，以保持凝胶浸泡在电解质缓冲液中。

4. 加载样品：使用微量移液器将样品加入凝胶的载样孔或井中。

为了准确确定迁移位置，在几个载样孔或井中加入标准品样品。

5. 进行电泳：将电泳槽连接到电源并设定适当的电压和运行时间。

DNA和RNA通常在常温下进行电泳，而蛋白质需要在冰水中进行电泳。

6. 可视化分离结果：当电泳完成后，取出凝胶，使用染色剂或荧光探针染色。

然后使用透光台或影像设备观察凝胶上分离的目标分子带。

7. 分析和解读结果：根据分离带的位置和密度，进行分析和解读实验结果。

通常可以通过与标准品样品对照来确定目标分子的大小和含量。

需要注意的是，凝胶电泳是一种常见的实验方法，但具体步骤可能会因为实验目的和样品类型的不同而有所变化。

因此，在进行凝胶电泳实验前，最好参考相关的实验方法和文献资料，确保按照正确的步骤操作。

凝胶电泳步骤

凝胶电泳步骤凝胶电泳是一种常用的分离和分析生物大分子的技术。

它通过利用凝胶的孔隙结构，根据生物大分子的大小和电荷差异，将它们分离开来。

凝胶电泳广泛应用于生物医学研究、基因工程、医学诊断等领域。

本文将详细介绍凝胶电泳的步骤，并探讨其在科研中的应用。

一、样品制备在进行凝胶电泳之前，首先需要制备样品。

样品制备是决定凝胶电泳结果质量的关键步骤之一。

常见的样品制备方法包括DNA提取、RNA提取、蛋白质提取等。

1. DNA提取DNA提取是从细胞或组织中获得DNA样本的过程。

常见方法包括酚-氯仿法、盐法等。

通过这些方法可以将DNA从细胞中纯化出来，并得到高质量和高浓度的DNA样本。

2. RNA提取RNA提取是从细胞或组织中获得RNA样本的过程。

常见方法包括酚-氯仿法、硅基法等。

通过这些方法可以将RNA从细胞中纯化出来，并得到高质量和高浓度的RNA样本。

3. 蛋白质提取蛋白质提取是从细胞或组织中获得蛋白质样本的过程。

常见方法包括裂解法、超声法等。

通过这些方法可以将蛋白质从细胞中纯化出来，并得到高纯度和高浓度的蛋白质样本。

二、凝胶制备凝胶制备是凝胶电泳的关键步骤之一。

凝胶电泳常用的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。

1. 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是一种常用于DNA和蛋白质分离的基质。

制备聚丙烯酰胺凝胶需要聚合物化合物、交联剂、缓冲液等。

首先将聚合物化合物和交联剂按一定比例混合，加入缓冲液后，通过加入过氧化氢等引发剂进行聚合反应，最终得到凝胶。

2. 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是一种常用于DNA分离的基质。

制备琼脂糖凝胶需要琼脂糖、缓冲液等。

首先将琼脂糖加入缓冲液中，加热溶解后，将溶液倒入制备好的凝胶模具中，待其冷却固化后即可得到琼脂糖凝胶。

三、样品加载样品加载是将待分离的样品加载到凝胶中的过程。

加载样品需要使用特定的管道或孔隙，以确保样品均匀地进入到凝胶中。

单细胞凝胶电泳(SCGE)技术

单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。

它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。

【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。

因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。

1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。

从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变。

SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。

在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。

为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。

最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。

不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。

但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。

1984年由Ostling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。

单细胞凝胶电泳试验

（一）原理单细胞凝胶电泳试验（，）是近年来经过不断完善逐步发展起来地一种快速检测单细胞水平损伤地新技术.文档来自于网络搜索有核细胞地分子量很大，超螺旋结构附着在核基质中，分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液地作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内地、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核仍保持缠绕地环区附着在剩余地核骨架上，并留在原位.如果细胞未受损伤，电泳时，核因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形地荧光团，无拖尾现象.若细胞受损，在中性电泳液（）中，核仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响双螺旋大分子地连续性.只有当双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星.如果在碱性电泳液（>）中，先是双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂地碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核向阳性迁移，形成拖尾.细胞受损愈重，产生地断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移地量也就越多，迁移地距离越长，表现为尾长地增加和尾部荧光强度地增强.因此，通过测定迁移部分地光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞地损伤程度.文档来自于网络搜索（二）仪器．全磨砂载玻片．号盖玻片．微量吸管和吸头．冰盒．电泳仪．荧光显微镜（三）试剂．正常熔点及低熔点琼脂糖.．细胞裂解液：，，，％肌氨酸钠，用调值到.用前加％和％.文档来自于网络搜索．碱性电泳液：，调到.．缓冲液（）.．荧光染料：µ地溴乙锭，也可用µ地吖啶橙或µ地碘丙锭等.（四）方法.制备细胞悬液单细胞来自人、动物(小鼠、大鼠、狗、鱼、鸡等)和植物地组织或培养地细胞系，或从活体组织分离出地原代细胞等.动物体内测试可以根据靶器官适当选择有针对性地原代细胞进行测试.选择合适地培养基和缓冲液，分离纯化制成单细胞悬液，用台盼蓝法测定细胞存活率>，细胞密度为(～)×备用.文档来自于网络搜索. 凝胶制片为了加强凝胶对玻片地附着力，在载玻片上先铺一基底层：在磨砂面上滴加℃水浴后地％～％正常熔点琼脂糖µ.然后再铺胶层.第层：取密度为×地细胞悬液，以体积比为：地比例与预热到℃地％低熔点琼脂糖混匀，取µ加到第层胶上，铺匀凝固；第层：以％低熔点琼脂糖覆盖中层细胞，这样制成细胞“三明治”. 文档来自于网络搜索.细胞裂解将细胞“三明治”载玻片浸入新配制地预冷℃地裂解液中，保持℃ .解旋细胞裂解后，将载玻片置于水平电泳槽内，用新配制地碱性电泳液盖过胶面约～，加盖避光，置于℃～.使充分解旋.碱性条件下（>）可使展开、解旋为单链，碱性易变性区段() 变为单链断片( ) .文档来自于网络搜索.电泳解旋结束后，通电电泳.电泳条件为和，电泳～.或按～确定电压.最适条件实验者可自行选择.最好能使阴性对照有部分细胞出现短拖尾，以保证试验有足够地敏感性并减少实验室间差异.文档来自于网络搜索.中和与染色电泳后取出载玻片，在缓冲液（）中浸没或漂洗次，每次.每张胶板上滴加～µ荧光染色剂，后用蒸馏水洗涤.以上各步骤应在黄或红光下操作.中和后地凝胶片应在内染色，以免过多扩散.否则应将之浸入无水乙醇或无水甲醇中脱水左右，或在室温中晾干.对于干燥地凝胶片，使用中性缓冲地甲醛处理数分钟，将有利于长期保存.文档来自于网络搜索.结果观察结果观察有肉眼观察测量和图像分析两种方式.在荧光显微镜下，观察单细胞电泳图像(放大～倍)，每片记数～个细胞，每个剂量组检查个细胞.无损伤地细胞表现为一圆形荧光细胞核.受损地细胞所产生地断片游动移出细胞核之外，向阳极伸延而形成“慧头”带“慧尾”地慧星现象.文档来自于网络搜索镜下观察时，首先应记录出现拖尾地细胞数，计算拖尾细胞率.同时用目镜测量拖尾细胞地尾长，统计各试验（剂量）组地平均尾长.尾长是指断片从其主核向电泳正极迁移地距离，而不同地实验室尾长测定方法有所不同.但并不妨碍将各剂量组平均尾长与阴性对照组进行比较.文档来自于网络搜索图象分析需有相应地设备和专门地分析软件.使用电脑逐个对细胞进行图像分析.应用图像分析系统可得到更多地分析参数.目前主要观察指标有尾长（）、慧尾地百分含量、尾距（）、尾块( )和尾惯量（）等.尾长( )即迁移地长度，在低损伤剂量范围内与损伤呈线性关系；尾矩是尾长与慧尾百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾块( )即彗星尾部分散地大小不一地断片组成，与损伤程度有关；尾惯量是与每个尾块地面积、平均荧光强度、在轴上与彗核中心距离有关地综合性指标.目前通常选用迁移细胞率、尾长、尾矩作为检测指标.文档来自于网络搜索目前，国外彗星电脑分析软件主要有英国公司地、美国公司地()、德国公司地分析系统、捷克公司地彗星图像分析系统等，这些软件能定量测定尾部长度、尾部面积、尾部力矩、尾部力矩臂、尾部力矩惯性、细胞密集程度、尾部地百分比、碎片等.但这些软件均需与其相应地仪器设备配套使用，价格十分昂贵.国内也正在开发一些分析系统.文档来自于网络搜索除了昂贵地商业软件外，也有一些免费地彗星分析软件.如等所设计地分析软件( ) 能测量彗星强度、尾长、头面积、尾面积、尾部含量、尾矩等多项参数. 等在地基础上研制了另一软件()，该软件可在多种硬件及软件平台上运行，所测量地彗星参数中增加了尾矩，而且用户界面更友好.这个免费软件地一个特点是，它们地源代码是公开地，人们可以看到每一个彗星参数地运算方法和编写程序.因此，软件使用者可以根据实验目地地不同来改变这些参数地运算方法和计算程序，从而建立一个新地测量遗传损伤地参数.这些源代码文件很简单，可以自行改写，以便使之适用于分析要求，如计算试验菌落数以及电泳凝胶地分析等.年建立了免费下载系统，其网址为：和.近年来使用较多地国外免费分析软件见以下网址：；文档来自于网络搜索.随着彗星试验地发展，在资源共享地网络空间里，会有更完善更方便地彗星分析软件出现.文档来自于网络搜索（五）注意事项虽然具有简便、快速等特点，但在整个实验过程中可能会受到诸多因素地影响而难以得到理想地实验结果.下面是几点注意事项..单细胞悬浮液地制备：最好将细胞数目调至约×个.如果细胞数目过高，位于凝胶不同层面地细胞可能会发生相互重叠，难以对其结果进行分析；如果细胞数目过低，则很难对实验结果进行统计学分析.文档来自于网络搜索.制片：目前制片地方法主要有三种:“三明治”凝胶、双层凝胶和单层凝胶.制片总地原则是: 获得牢固稳定凝胶地同时，避免额外地损伤与修复.文档来自于网络搜索.电泳条件：一般选用低电压和短时间.电压过高、电泳时间过长虽然能够提高检测地灵敏度，但也会使正常地细胞形成拖尾而出现假阳性结果；反之，电压过低、电泳时间过短，受损细胞不会形成拖尾而出现假阴性结果.文档来自于网络搜索.实验条件：整个实验过程需在低温(约℃) 和暗光下进行，避免额外地损伤和修复，防止假阳性和假阴性结果地产生.文档来自于网络搜索.与凋亡细胞断片地区分：由于试验剂量过大或细胞保存不当及某些不适地试验条件地影响，会出现细胞坏死和凋亡，坏死和凋亡细胞会产生大量断片，也会在电泳以后出现拖尾.由于它们与常见断裂剂诱导地损伤在形成机制、生物学和毒理学上地意义迥然不同，应对它们进行区分，排除对实验结果地干扰.在碱性彗星试验中，凋亡细胞与普通链断裂损伤细胞地差异主要是：①在彗星形态上，凋亡细胞地断片彗星头很小，头长不超过µ，仅由核内不能裂解地与蛋白质框架相连地片段组成，亮度高，慧尾近似椭圆形，纵径与横径地比值小，彗星头与慧尾之间往往有一分离带.而普通链断裂，彗星头直径一般都大于µ，尾纵径明显大于横径，同时彗星头与慧尾之间没有明显界限，因为一部分慧尾是由单个链断端地延伸形成，它地另一端仍与主核相连.②无论在低剂量组还是在高剂量组，凋亡细胞地断片形态基本一致，尾长也基本相同，其剂量反应关系表现为凋亡指数增加，而不是尾长增加.而链断裂损伤地剂量反应关系表现为彗星尾长地增加.文档来自于网络搜索（沈孝兵，浦跃朴）。

单细胞凝胶电泳(SCGE)技术

单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。

【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。

因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。

SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。

在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。

为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。

最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。

不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。

但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。

单细胞凝胶电泳技术操作方法介绍

单细胞凝胶电泳技术操作方法介绍
单细胞凝胶电泳技术是一种用于分析和检测细胞的分子遗传学方法。

它的原理是使用电场将细胞内的核酸以其电荷特性分离，并基于分子量将
其分成不同的组分，以此达到检测细胞内特定核酸分子的目的。

具体操作
步骤如下：
1.将拆解的细胞悬浮液加入凝胶腔中，然后添加凝胶固定液进行凝固；
2.将凝固的凝胶加入电泳槽中，并将底部加人电源，然后上部加入溶
解液进行溶解；
3.调节电压，使核酸片段沿电场梯度向某一方向移动；
4.当片段移动到一定位置时，进行靶标分析，以此实现细胞内特定核
酸片段的检测。

单细胞凝胶电泳试验操作步骤

一、实验准备工作，要在实验前一天完成。

1.镀膜：将载片竖直放入盛有1%常熔点琼脂糖的立式染缸中，静置1 min后缓慢取出，并置于立式染缸中，在37 ℃烘箱中烤膜12 h（防尘）。

2.配制细胞裂解储备液：分别按称量146.25 g氯化钠，37.224g乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA），1.2114 g三羟甲基氨基甲烷，肌氨酸钠（10.124 g），上述质量的四种药品于烧杯中依次溶解，溶解时由于肌氨酸钠容易起泡，故最后加入，由于Na2EDTA难溶可适当加热进行溶解，同时可用磁力搅拌器进行搅拌，溶解后用容量瓶定容至1000 mL，将配好的溶液放入冰箱4 ℃保存。

）3.配置磷酸缓冲液（PBS、pH=6.8）：KH2PO44.5 g、Na2HPO4·12H2O 11.81 g、H2O 1000 mL，混合后置4 ℃备用。

二、实验工作，要细心操作。

1.构槽：用市售的透明胶带（两层）在镀上正常熔点琼脂糖膜的载玻片中央构建一个长方形小槽，或者在一张载玻片上搭两个槽。

构建好后放回载玻片架并用一次性手套套住（防尘）。

2.取细胞裂解储备液、二甲亚砜、TritonX-100按体积比89：10：1量于锥形瓶中混匀（TritonX-100粘性大，用枪头吸取时手要慢慢放开，将液体打入锥形瓶中，然后要反复吹打，尽量把枪头壁上的液体打入锥形瓶中），然后用NaOH调pH=10！！！4 ℃静置,放入冰箱，进行温度平衡。

3.电泳缓冲液：称取0.3722 gNa2EDTA，12.0000 gNaOH定容至1L，pH=13，室温保存。

4.将水浴锅打开，把温度调到65 ℃。

5.骨髓细胞悬液制备：分离股骨，PBS液清洗，打开骨髓腔，取4 ℃PBS液4 mL反复冲洗骨髓，吸取1.5~2 mL所得混合液，4 ℃、3000 r/min离心1 min弃上清；加4 ℃PBS 液1 mL，轻柔混匀，1500 r/min离心5 min弃上清；加入4 ℃PBS液500 µL轻柔混匀，置4 ℃待用，若离心后发现骨髓细胞较少可以适当延长3000 r/min离心时间。

凝胶电泳的操作方法

凝胶电泳的操作方法
1. 准备样品：将待分离的样品加入到凝胶中或者混合物中。

2. 制造凝胶：将凝胶粉末加入到缓冲液中，均匀搅拌至溶解。

将凝胶混合液倒入凝胶模具中，等待其凝固。

3. 将凝胶模具置于电泳槽中，并加入足够的缓冲液（也叫电泳缓冲液），以使凝胶完全覆盖在缓冲液中。

4. 在需要电泳的样品中添加DNA的载体，如甲醛、非离子性洗涤剂等。

5. 将样品加入电泳槽的样品孔中，连接电源，设置恰当的电场力和电泳时间。

6. 在电泳结束后，将凝胶从模具中取出，然后染色。

常用DNA染色剂有乙溴聚丙烯酰胺（EB）和硫磺化氰酸亚铁（FeCN）。

7. 在染色结束后，将凝胶用透明薄膜封装好，然后使用紫外线灯照射，并使用质谱分析仪进行测量和分析。

8. 最后，将数据进行整理、研究和分析，得到所需的结果。

单细胞凝胶电泳试验

单细胞凝胶电‎泳试验（一）原理单细胞凝胶电‎泳试验（single‎cell gel electr‎o phore‎s is，SCGE）是近年来经过‎不断完善逐步‎发展起来的一‎种快速检测单‎细胞水平DN‎A损伤的新技‎术。

有核细胞的D‎N A分子量很‎大，DNA超螺旋‎结构附着在核‎基质中，SCGE 分析技术是先‎用琼脂糖凝胶‎将细胞包埋在‎载玻片上，在细胞裂解液‎的作用下，细胞膜、核膜及其它生‎物膜遭到破坏‎，使细胞内的R‎N A、蛋白质及其它‎成分外泄到凝‎胶中，随后扩散到细‎胞裂解液中，但核DNA仍‎保持缠绕的环‎区附着在剩余‎的核骨架上，并留在原位。

如果细胞未受‎损伤，电泳时，核DNA因其‎分子量大停留‎在核基质中，荧光染色后呈‎现圆形的荧光‎团，无拖尾现象。

若细胞受损，在中性电泳液‎（pH=8.0）中，核DNA仍保‎持双螺旋结构‎，虽偶有单链断‎裂，但并不影响D‎N A双螺旋大‎分子的连续性‎。

只有当DNA‎双链断裂时，其断片进入凝‎胶中，电泳时断片向‎阳极迁移，形成荧光拖尾‎现象，形似彗星。

如果在碱性电‎泳液（pH>13）中，先是DNA双‎链解螺旋且碱‎变性为单链，单链断裂的碎‎片分子量小可‎进入凝胶中，电泳时断链或‎碎片离开核D‎N A向阳性迁‎移，形成拖尾。

细胞DNA受‎损愈重，产生的断链或‎碱易变性断片‎就愈多，其断链或断片‎也就愈小，在电场作用下‎迁移的DNA‎量也就越多，迁移的距离越‎长，表现为尾长的‎增加和尾部荧‎光强度的增强‎。

因此，通过测定DN‎A 迁移部分的‎光密度或迁移‎长度可定量地‎测定单个细胞‎的DNA损伤‎程度。

（二）仪器1．全磨砂载玻片‎2．1号盖玻片3．微量吸管和吸‎头4．冰盒5．电泳仪6．荧光显微镜（三）试剂1．正常熔点及低‎熔点琼脂糖。

2．细胞裂解液：2.5mol/L NaCl，100mmo‎l/L Na2EDT‎A，10mmol‎/L Tris-HCl，1％肌氨酸钠，用NaOH调‎p H值到10‎。

单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及应用

六、未来展望
预计在未来，DNA凝胶电泳分析系统将会与更多前沿的生物技术相结合，如纳米技术、微流体技术等，实现更高效的分离和检测。同时，随着精准医疗和基因组学的发展，凝胶电泳将在疾病诊断和治疗、个性化医疗等方面发挥重要作用。此外，随着环境科学和生态学的发展，凝胶电泳也将被广泛应用于环境 DNA样品的分析和研究。
五、结论
单细胞凝胶电泳技术是一种灵敏且实用的工具，可用于检测单个细胞的DNA损伤。它已经广泛应用于环境科学、放射医学和遗传学等领域，为研究DNA损伤和修复提供了重要的手段。尽管存在一些挑战和问题，但随着技术的不断发展和完善，相信单细胞凝胶电泳技术在未来的研究中将发挥更大的作用。
参考内容二
方法
单细胞凝胶电泳的主要步骤包括收集单个细胞、细胞裂解、凝胶电泳和染色。该技术的原理是基于DNA在凝胶中的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关。当DNA分子受到损伤时，其迁移速率会受到影响，从而可以通过电泳图像进行观察和定量分析。
1、收集单个细胞：采用显微操作、流式细胞术或其他细胞分离技术收集单个细胞。
单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及应用
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）是一种用于检测单个细胞内DNA损伤的方法。该技术通过将单个细胞裂解后在凝胶上进行电泳，可以检测到DNA的片段化程度和总DNA量的变化，从而评估细胞内DNA的损伤程度。本次演示将介绍单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及其在各个领域的应用，并通过具体案例进行分析和说明。
2、实验过程：收集单个白细胞或睾丸细胞，裂解后将DNA样本在凝胶上进行电泳。通过观察电泳图像，发现经过辐射处理的样品中出现了明显的DNA片段化现象，而对照样品则没有。同时，通过定量分析软件对电泳图像进行半定量分析，比较不同样本中DNA片段化和总DNA量的变化情况。

dna凝胶电泳步骤

dna凝胶电泳步骤DNA 凝胶电泳啊，这可是个很有趣的实验呢！咱就来说说它的那些步骤吧。

首先呢，得准备好凝胶。

这就好比是给 DNA 们搭个舞台呀，得让它们有地方展示自己呢。

把琼脂糖粉末放到水里煮一煮，等它变成胶状，再倒进模具里，等它冷却凝固，这凝胶就算是搭好啦。

接下来，就是上样啦。

把咱要检测的 DNA 样品，加上一些特殊的染料，就像是给 DNA 化个妆，让它们更显眼。

然后小心地把这些样品加到凝胶的孔里，就好像是让演员们登上舞台一样。

然后呢，就是电泳啦。

把凝胶放到电泳槽里，通上电，这时候啊，DNA 们就会在电场的作用下开始奔跑啦。

不同大小的 DNA 跑的速度可不一样哦，就像人跑步有快有慢似的。

小的 DNA 跑得快，大的就跑得慢些。

在这个过程中，可别闲着呀，要好好看着它们跑。

这就跟看比赛似的，得盯着选手们的表现呢。

看看它们跑得怎么样，有没有跑偏啦，有没有出啥问题呀。

等跑了一段时间后，就可以关掉电源啦。

这时候，DNA 们也都跑到各自的位置上啦。

最后呢，就是观察结果啦。

把凝胶拿出来，用专门的仪器或者染料去观察，就能看到 DNA 们形成的条带啦。

这就像是比赛结束后，看谁是冠军谁是亚军一样。

你说这 DNA 凝胶电泳是不是很神奇呀？就像一场小小的比赛，DNA 们在里面各显神通呢。

咱通过这个实验，就能了解很多关于 DNA 的信息啦。

所以呀，做这个实验的时候，可一定要认真仔细哦，不然可就看不到精彩的结果啦！你想想，如果因为自己的不小心，错过了重要的信息，那多可惜呀！所以呀，每一步都要好好做，就像对待宝贝一样对待这个实验，这样才能得到准确又有趣的结果呢！你说是不是呀？。

单细胞凝胶电泳技术的试验步骤.

单细胞凝胶电泳技术的试验步骤
关键词：电泳技术
试剂及材料：
1)PBS
2)0.8%正常熔点凝胶(PBS配制)
3)0.6%低熔点凝胶(PBS配制)
4)毛玻璃片
5)盖玻片
6)碱性裂解液(2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠)，临用前加10%DNMSO，1%Triton X-100
7)电泳缓冲液(1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH;Tris.Cl，pH7.5)
8)EB(2ug/ml)
步骤：
1.制备第一层胶：100ml 0.8%正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min;
2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含
1×10000个细胞的0.6%低熔点胶(cell与凝胶比例为1：5)，加盖盖玻片，4℃固化10min;
4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液(没过玻片2～3min)，放置20min(黑闭)。

3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内(临用前加10% DMAO，1%Triton X-100)，4℃裂解1h;
5.电泳：电压20V，300mA，30min
6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH
7.5漂洗3次，每次3min;
7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。

或者4℃，潮湿，闭光的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。

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