生物化学第一章 蛋白质12-1

• c、嗜热菌蛋白酶：水解疏水性强的氨基酸 的氨基形成的肽键。 （Leu,Ile,Phe,Trp,Val,Tyr,or Met) • Pro or Gly的氨基形成的肽键不被水解。 • d、溴化氰：水解由Met 的羧基形成的肽键。
消化道内几种蛋白酶的专一性
氨肽酶
（Phe.Tyr.Trp） （Arg.Lys）
的位置。
蛋白质顺序测定 基本方法路线
纯蛋白质 二硫键拆开
末端氨基酸测定 专一性裂解 将肽段分离并测出顺序
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意
所得资料：
氨基末端残基 H
羧基末端残基 S
第一套肽段
QNS PS
第二套肽段
SEQ WTQN
EQVE
RLA
VERL
APS
HQWT
HQ
借助重叠肽确定肽段次序：
末端残基 H
末端肽段 HQWT
S
APS
第一套肽段 HQWT QNS EQVE RLA PS
第二套肽段 HQ WTQN SEQ VERL APS 推断全顺序 HQWTQNSEQ VERLAPS
二、蛋白质的构象和维持构象的作 用力
• • • （一）构型与构象 构型（configuration）：立体异构体中 取代原子或基团在空间的取向； 一个碳原子和四个不同的基团相连时，只 可能有两种不同的空间排列，这两种不同 的空间排列叫做不同的构型。这两种构型 如果没有共价键的破裂是不能互变的。
第一章 蛋白质 （Protein）
主要内容：介绍蛋白质的构件单位氨基酸 的结构、分类、性质及肽的概念，重点讨论 蛋白质的结构、性质以及结构和功能的相互 关系。
第一节
蛋白质的组成、分类及生物学功能
蛋白质主要元素组成：C、H、O、N、S 微量元素：P、Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se 等。•
蛋白质平均含N量为16％,这是凯氏定 氮法测蛋白质含量的理论依据：
酰胺平面
α-碳原子
非键合原子 接触半径
侧链
酰胺平面
Φ=1800，ψ=1800
Φ=00，ψ=00
完全伸展的多肽主链构象
Φ=00，ψ=00的多肽主链构象
（二）蛋白质二级结构的构象单元
(１) α －螺旋（α －helix）
(２) β－折叠（β-pleated sheet）
(３) β－转角（β-turn）
(４) 无规则卷曲（nonregular coil）
α－螺旋（α－helix）
特征：1、 每隔3.6个AA残 基螺旋上升一圈，螺距 0.54nm; 相 邻 两 个 氨 基 酸 残 基平移距离为0.15nm。 2 、 螺旋体中所有氨基 酸残基R侧链都伸向外侧， 链中的全部>C=O 和>N-H几 乎都平行于螺旋轴; 3、每个氨基酸残基的 >N-H与前面第四个氨基酸残 基的>C=O形成氢键，肽链 上所有的肽键都参与氢键的 形成。
二氨基一羧基AA的 等电点计算：
pK´1+pK´2 pI= 2
pK´2+pK´3 pI= 2
（2）氨基酸光学活性
1、氨基酸的旋光性：除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不对
称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。
有的是左旋，有的是右旋。
2、紫外吸收光谱：
• 参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸 (Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R 基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外 光区显示特征的吸收谱带，最大光吸收 （max）分别为280、275、和257nm。 • 由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残 基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白 质含量。 • 蛋白质的最大吸收峰一般为:280nm .
多肽N、C-末端氨基酸的测定
N端 Sanger法（二硝基氟苯反应） DNS法（丹磺酰氯反应） Edman法（苯异硫氰酸脂反应） 氨肽酶法 C端 肼解法 还原法 羧肽酶法
（4）专一性部分裂解多肽链成较小的片段；
每种样品至少用两种方法裂解，产生两套
以上的片段。
• a、胰蛋白酶：水解由Lys or Arg的羧基形 成的肽键。 • b、胰凝乳蛋白酶：水解由芳香族氨基酸 （Phe,Trp or Tyr)的羧基形成的肽键。 Leu,Met,His的羧基形成的肽键水解较慢。 • Pro的氨基形成的肽键不被水解。
Try、 Tyr、 Phe 的 紫外 吸收 光谱
摩 尔 吸 收 系 数
波长
（3）氨基酸的重要化学反应
氨基酸与茚三酮反应
NH3
+
茚三酮(无色)
加热 (弱酸) 还原性茚三酮
+
CO2
RCHO
+ 2NH3 +
3H20
紫色化合物
还原性茚三酮
还原性茚三酮
氨基酸与2,Hale Waihona Puke Baidu一二硝基氟苯(DNFB)的反应
（Sanger反应）
（一）肽单元
参与肽键的6个原子C1 、
C、O、N、H、C2位于同一平
面，C1 和C2 在平面上所处的 位置为反式(trans)构型，此同
一平面上的6个原子构成了所谓
的肽单元 (peptide unit) 。
酰胺平面与α-碳原子的二面角（ φ和ψ ）
二面角
两相邻酰胺平面之间，能以共同的Cα为定点而旋转， 绕Cα-N键旋转的角度称φ角，绕C-Cα键旋转的角度称ψ角 。φ和ψ称作二面角，亦称构象角。 当φ或ψ旋转使旋转健两侧的主链原子处于顺式构型时， 规定φ=0，或ψ=0。 从Cα沿健轴的方向观察，顺时针旋转的φ和ψ角度为（+ ），逆时针时旋转的为（-）。
短杆菌肽S
促甲状腺素释放因子（TRH）
谷胱甘肽
谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还
原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。
短杆菌肽S
Orn: 鸟氨酸
由下丘脑分泌，其功能是促进腺垂体释放促甲状腺 素(调节糖代谢)。
第四节 蛋白质的分子结构
蛋 白 质 结 构 的 主 要 层 次
• 形成因素：与ＡＡ组成和排列顺序直接相 关。由于脯氨酸的亚氨基参与形成肽键后， 氮原子上已没有氢原子，无法充当氢键供 体，致使α－螺旋中断，产生一个“结节”。
• 如果肽段内带有相同电荷的残基过于密集，彼此 由于同性电荷的排斥，妨碍链内氢键的形成。也 会导致α－螺旋中断。
β －折叠（β -pleated sheet）
• 构象（conformation）：是指取代基团当 单键旋转时可能形成的不同的立体结构。 这种空间位置的改变并不涉及共价键的破 裂。
（二）维持蛋白质构象的作用力
多肽链
R基团间的相互作用及稳定蛋白质三维构象的作用力
a.盐键 b.氢键 c.疏水键 d.范得华力 e.二硫键
三、蛋白质的二级结构
• 蛋白质的二级结构（secondary structure） 指肽链主链不同区段通过自身的相互作用， 形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的 局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元。
特征：两条或多 条伸展的多肽链 侧向集聚，通过 相邻肽链主链上
的N-H与C=O之间
有规则的氢键， 形成锯齿状片层
结构，即β －折
叠片。
• • • • •
类别： 平行：N端在同一方向。 Φ=-119°，ψ=+113° 反平行：N端一顺一反交替排列。 Φ=-139°，ψ=+135°
特征：多肽
链中氨基酸 残基n的羰基 上的氧与残 基（n+3）的
甘 氨 酸 滴 定 曲 线
甘氨酸盐酸盐（A+）
等电点甘氨酸（A）
甘氨酸钠（A-）
一氨基一羧基AA的 等电点计算：
pK´1+pK´2 pI= 2
谷氨酸（A）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算
B A
pK3 pH
pK3
pH pK2 pK1
pK2
pI
pI
pK1 加入的OH-mL数
加入的OH-mL数
一氨基二羧基AA的 等电点计算：
第三节 肽
一、肽及其命名
• 肽(peptide)是氨基酸的α-羧基与另一 个氨基酸的α-氨基脱水形成的聚合物。 • 肽的命名是根据肽中所含氨基酸的数 目来进行的,由两个氨基酸形成的肽称为二 肽,由三个氨基酸形成的肽称三肽,如此类推。 • 由多个氨基酸组成的肽称为多肽，多肽一 般形成链状，常称为肽链( peptide chain) 。
一级结构
primary structure
二级结构
secondary structure 超二级结构 supersecondary structure 结构域 Structure doman Tertiary structure
三级结构
四级结构
quariernary structure
一、蛋白质的一级结构
+
DNFB（dinitrofluorobenzene）
弱碱中
氨基酸
+
DNP-AA(黄色)
HF
氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应 （Edman反应）
+
PITC（phenylisothiocyanate） 弱硷中 (40℃)
(硝基甲烷 40℃) H+
苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）
羧肽酶 羧肽酶
（Phe. Trp）
（脂肪族）
胃蛋白酶
胰凝乳 蛋白酶
弹性蛋白酶
胰蛋白酶
（5）肽片段的分离纯化
（6）测定各肽段的氨基酸顺序；
氨基酸序列测定
基本方法：
Sanger法
Edman降解法
DNS-Edman测序法 蛋白质顺序仪测序
（7）片段重叠法重建完整多肽链一级结构；
（8）确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥
多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白 质的一级结构(primary structure)。
这是蛋白质最基本的结构，它决定蛋白质高级结构和生物
功能。
例：牛胰岛素的一级结构
世界三大DNA序列和蛋白质序列的 查询资料库：
• GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.govl 全称 为：the National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine at the National Institutes of Health. govl是指U.S government的一个分支机构。 • EMBL http://www.cbi.ac.uk/ 它位于英国剑桥 欧洲生物信息研究所（EBI）。 • DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp the DNA Data Bank of Japan. 由日本国立遗传学研究所承 办。
二、肽链的结构
肽键
肽单位
多肽链结构示意图
肽单位
肽基的C、O和N原子间的共振相互作用
sp3
sp2 sp2
sp2
共振杂化体
共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转 形成酰胺平面 产生键的平均化 肽键呈反式构型
三、重要的天然活性肽
类别：激素、抗菌素、辅助因子 实例：谷胱甘肽(glutathione)
β －转角（β -turn）
氮原上的氢
之间形成氢 键，肽键回 折 1800 。 形 成 10 个 原 子
组成的环。
无 规 则 卷 曲 示 意 图
细胞色素C的三级结构
蛋白质一级结构测定
基本策略： 片段重叠法＋氨基酸顺序直测法
基本步骤：
(1) 蛋白质样品预处理：纯化、测分子量、断开二硫 键、断开非共价键。
胰岛素
二 硫 键 的 断 裂
-巯基乙醇
碘乙酸
• （2）分析每一条多肽链的氨基酸组成：蛋 白质水解+氨基酸自动分析仪使用。 • (3)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸 残基； •
R R +
+
OHH+
CH NH3 COOH
+
CH NH3+ COO
+ OH+ H+ (pK´2)
R CH NH2 COO
(pK´1)
pH< pI
净电荷为正
pH = pI
净电荷=0
pH > pI
净电荷为负
当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负 电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动， 此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelctric point)。
（一）氨基酸的分类
1. 非极性疏水性氨基酸 2. 极性中性氨基酸 3. 酸性氨基酸 4. 碱性氨基酸
* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:
非极性R基团氨基酸
不带电荷极性R基团氨基酸
带电荷R基团氨基酸
三、氨基酸的性质
(1)两性解离性质和等电点(PI)
氨基酸的两性解离性质及等电点（pI）
蛋白质含量＝蛋白质含N量×6.25
蛋白质的分类
• 根据分子形状分类：
• 根据化学组成分类：
蛋白质主要功能：
催化功能；
调节功能；
结构功能；
防御功能；
运动功能；
信息功能；
运输功能；
储藏功能
第二节 蛋白质的基本构件单位─氨基酸
一、氨基酸的结构通式
-氨基酸的通式

二、氨基酸的分类