2014解剖学报--硫化氢对氧糖剥夺／复氧诱导小鼠脑皮层神经元损伤的体外观察

・３１６　・第４５卷　第３期２０１４年６月解　剖　学　报ＡＣＴＡＡＮＡＴＯＭＩＣＡＳＩＮＩＣＡＶｏｌ畅４５，Ｎｏ畅３Ｊｕｎ．２０１４硫化氢对氧糖剥夺／复氧诱导小鼠脑皮层神经元损伤的体外观察伍吉云　魏慈照　徐悦青　刘路宽　张洋萍　魏楚蓉　毛慕华　罗友根倡（井冈山大学神经退行性疾病与衰老研究中心，江西吉安　３４３００９） ［摘要］　目的　探讨硫化氢（Ｈ２Ｓ）对氧糖剥夺／复氧（ＯＧＤ／Ｒ）诱导神经元损伤的影响。

方法　小鼠皮层神经元用无糖厄尔氏平衡盐溶液（ＥＢＳＳ）于２％Ｏ２、５％ＣＯ２、９３％Ｎ２３７℃培养４ｈ，换用ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｂ２７培养基于３７℃５％ＣＯ２培养箱中继续培养１２ｈ，建立ＯＧＤ／Ｒ模型。

以硫氢化钠（ＮａＨＳ）作为Ｈ２Ｓ的供体，采用细胞计数试剂盒（ＣＣＫ－８）检测细胞存活率；用ｆｕｒａ－２／ＡＭ和显微荧光成像系统检测神经元胞质钙离子浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）；利用比色法检测乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）释放率；碘化丙啶（ＰＩ）染色检测细胞损伤。

结果　２００、３００与６００μｍｏｌ／ＬＮａＨＳ预处理３０ｍｉｎ再ＯＧＤ／Ｒ，神经元存活率显著提高（ｎ＝４）；３００μｍｏｌ／ＬＮａＨＳ预处理后再ＯＧＤ／Ｒ，［Ｃａ２＋］ｉ（ｎ＝５）、ＬＤＨ释放率（ｎ＝４）和细胞损伤率（ｎ＝６）均低于ＯＧＤ／Ｒ组，且使用１０μｍｏｌ／Ｌ钙螯合剂ＢＡＰＴＡ也降低ＯＧＤ／Ｒ诱导的ＬＤＨ释放率和细胞损伤率。

结论　Ｈ２Ｓ减轻ＯＧＤ／Ｒ所致皮层神经元损伤，其机制与Ｈ２Ｓ抑制ＯＧＤ／Ｒ诱导神经元钙超载有关。

［关键词］　氧糖剥夺／复氧；硫化氢；细胞损伤；钙超载；显微荧光成像；小鼠［中图分类号］　Ｑ４２１　［文献标志码］　Ａ　［ＤＯＩ］　１０畅３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－１３５６畅２０１４畅０３畅００４Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｉｄｅｏｎｍｏｕｓｅｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎａｌｉｎｊｕｒｉｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｏｘｙｇｅｎｇｌｏｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏＷＵＪｉ－ｙｕｎ，ＷＥＩＣｉ－ｚｈａｏ，ＸＵＹｕｅ－ｑｉｎｇ，ＬＩＵＬｕ－ｋｕａｎ，ＺＨＡＮＧＹａｎｇ－ｐｉｎｇ，ＷＥＩＣｈｕ－ｒｏｎｇ，ＭＡＯＭｕ－ｈｕａ，ＬＵＯＹｏｕ－ｇｅｎ倡（ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＮｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄＡｇｉｎｇ，ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＪｉｎｇｇａｎｇｓｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＪｉａｎｇｘｉＪｉ’ａｎ　３４３００９，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＨ２Ｓｏｎｎｅｕｒｏｎａｌｉｎｊｕｒｉｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｏｘｙｇｅｎｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ（ＯＧＤ／Ｒ）ｉｎｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＦｏｒＯＧＤ，ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｄｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈｇｌｕｃｏｓｅ－ｆｒｅｅＥＢＳＳｍｅｄｉａｆｏｒ４ｈｉｎＮ２／ＣＯ２／Ｏ２（９３％／５％／２％）ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ．Ｔｈｅｒｅａｆｔｅｒ，ｔｈｅｍｅｄｉａｗｅｒｅｒｅｐｌａｃｅｄｂｙＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａａｎｄｔｈｅｎｅｕｒｏｎｓｗｅｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄｆｏｒ１２ｈｉｎａ５％ＣＯ２ｉｎｃｕｂａｔｏｒａｔ３７℃．ＮａＨＳｗａｓｕｓｅｄａｓａＨ２Ｓｄｏｎｏｒａｎｄｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ８（ＣＣｋ－８）．［Ｃａ２＋］ｉｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｕｓｉｎｇｆｕｒａ－２／ＡＭａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｉｍａｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓ．Ｔｈｅｒｅｌｅａｓｅｒａｔｅｏｆｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）ｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｓｓａｙｋｉｔ，ａｎｄｃｅｌｌｄａｍａｇｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｆｔｅｒｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ２００，３００ａｎｄ６００μｍｏｌ／Ｌｓｏｄｉｕｍｈｙｄｒｏｓｕｌｆｉｄｅ（ＮａＨＳ）ｆｏｒ３０ｍｉｎｂｅｆｏｒｅＯＧＤ／Ｒ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｎｅｕｒｏｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ（ｎ＝４）．［Ｃａ２＋］Ｉ（ｎ＝５），ＬＤＨｒｅｌｅａｓｅｒａｔｅ（ｎ＝４）ａｎｄｃｅｌｌｄａｍａｇｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ（ｎ＝６）ｉｎｔｈｅｎｅｕｒｏｎｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ３００μＭＮａＨＳｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎＯＤＧ／Ｒｃｅｌｌｓ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ１０μｍｏｌ／ＬｃａｌｃｉｕｍｃｈｅｌａｔｏｒＢＡＰＴＡａｌｓｏｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅＬＤＨｒｅｌｅａｓｅｒａｔｅａｎｄｃｅｌｌｄａｍａｇｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＯＤＧ／Ｒｉｎｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔＨ２ＳｍａｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅＯＧＤ／Ｒｉｎｄｕｃｅｄｄａｍａｇｅｉｎｃｏｒｔｉｃａｌｎｅｕｒｏｎｓｖｉａｒｅｄｕｃｉｎｇｃａｌｃｉｕｍｏｖｅｒｌｏａｄｏｆｎｅｕｒｏｎｓ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｏｘｙｇｅｎ－ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ；Ｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｉｄｅ；Ｃｅｌｌｉｎｊｕｒｙ；Ｃａｌｃｉｕｍｏｖｅｒｌｏａｄ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｉｍａｇｉｎｇ；Ｍｏｕｓｅ［收稿日期］　２０１３－０５－０２　［修回日期］　２０１３－０６－１３［基金项目］　国家自然科学基金资助项目（３１３６０２３８）；江西省自然科学基金资助项目（２０１３２ＢＡＢ２０５０２０）；江西省对外科技合作计划资助项目（２０１３ＺＢＡＢ２０５００８）；吉安市科技局科技计划资助项目［吉市科计字（２０１２）３２，编号１０］；井冈山大学校级课题资助项目（ＪＺ１２１０）［作者简介］　伍吉云（１９５４—），女（汉族），江西省吉安市人，学士，教授。

倡通讯作者（Ｔｏｗｈｏｍｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｓｈｏｕｌｄｂｅａｄｄｒｅｓｓｅｄ）Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｙｏｕｇｅｎ＠１６３．ｃｏｍ　Ｔｅｌ：（０７９６）８１１７８９３Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．３伍吉云等．硫化氢对氧糖剥夺／复氧诱导小鼠脑皮层神经元损伤的体外观察・３１７　・ 脑组织缺氧复氧时，由于微循环障碍致细胞供能失衡，引起谷氨酸释放，产生兴奋性毒性作用［１］，继发钙超载，引起神经元死亡。

大量研究显示，钙超载在缺氧复氧诱导的神经元死亡中起关键作用［２～４］。

新型气体信号分子硫化氢（ｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｉｄｅ，Ｈ２Ｓ）能显著抑制化学性缺氧剂ＣｏＣｌ２所致细胞活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）增多，通过抗氧化起神经保护作用［５］。

脑缺血缺氧性损伤能显著增加阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）的发病率［６］，研究发现ＡＤ患者脑中的Ｈ２Ｓ含量显著低于对照组，且与ＡＤ病情的严重程度呈负相关［７，８］。

硫化氢对脑缺血缺氧性损伤诱导的ＡＤ样病变的作用，目前尚不明确。

本研究基于钙信号调控，探讨Ｈ２Ｓ对缺氧复氧诱导皮层神经元损伤的影响。

材料和方法１．小鼠皮层神经元原代培养与纯度鉴定神经元原代培养方法参照本课题组先前的报道［９］，ＢＡＬＢ／ｃ小鼠购自中山大学医学院动物中心。

神经元培养７ｄ后，依次４％多聚甲醛室温固定３０ｍｉｎ，０畅３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００透膜１５ｍｉｎ，１０％ＢＳＡ室温封闭６０ｍｉｎ，加鼠抗β３－微管蛋白（β３－ｔｕｂｕｌｉｎ）单克隆抗体（１∶２００，ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司）４℃过夜，加ＦＩＴＣ标记的羊抗小鼠ＩｇＧ二抗（１∶５０）室温孵育６０ｍｉｎ，２０ｍｇ／ＬＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２复染细胞核３ｍｉｎ，所有步骤前均用ＰＢＳ清洗３次，每次５ｍｉｎ，激光扫描共焦显微镜（ＳＰ５，Ｌｅｉｃａ公司）摄片。

以绿色荧光为神经元个数，蓝色核为细胞总数，计算神经元纯度的百分比。

２．建立神经元氧糖剥夺／复氧（ｏｘｙｇｅｎ－ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，ＯＧＤ／Ｒ）模型参照文献［１０］，神经元培养７ｄ后，吸去培养基，加无糖厄尔氏平衡盐溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＥＢＳＳ）（使用前用Ｎ２饱和３０ｍｉｎ），于２％Ｏ２、５％ＣＯ２、９３％Ｎ２３７℃培养箱中培养４ｈ，换用ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｂ２７培养基于３７℃、５％ＣＯ２、９５％空气培养箱中继续培养１２ｈ，建立ＯＧＤ／Ｒ模型。

３．检测指标３畅１　细胞存活率：将神经元以１×１０４个／孔种于９６孔板，培养７ｄ后进行细胞存活率检测。

各组细胞分别给予细胞计数试剂（ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ８，ＣＣＫ－８；上海碧云天生物技术有限公司；每孔１００μｌ体积加１０μｌＣＣＫ－８）孵育１畅５ｈ，随后采用酶标仪测定各孔的吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ，Ａ）值（４５０ｎｍ波长）。

以含相当体积培养基和ＣＣＫ－８溶液但无细胞的孔作为空白对照。

按公式：存活率（％）＝（实验组Ａ值－空白Ａ值）／（对照组Ａ值－空白Ａ值）×１００％，求各组存活率。

３畅２　神经元［Ｃａ２＋］ｉ：神经元处理后，用１μｍｏｌ／Ｌｆｕｒａ－２／ＡＭ于３７℃避光孵育４０ｍｉｎ，用ＥＢＳＳ（含１ｇ／Ｌ葡萄糖）清洗３次，将共焦皿固定于荧光倒置显微镜（ＩＸ７１，Ｏｌｙｍｐｕｓ公司）载物台上，［Ｃａ２＋］ｉ由显微荧光成像系统进行检测（ＣｅｌｌＲ－ＭＴ２０，Ｏｌｙｍｐｕｓ公司），［Ｃａ２＋］ｉ以３４０／３８０比值表示。

３畅３　乳酸脱氢酶（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ）释放率：按照试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）说明书，收集培养液０畅１ｍｌ，加人１ｍｌ含７０％乳酸钠基质液和０畅２ｍｇ的辅酶Ｉ充分反应，在碱性条件下用２，４－二硝基苯肼显色，在４４０ｎｍ读取吸光度。

用同样方法测定相应细胞裂解液中总ＬＤＨ活性，用培养液中ＬＤＨ活性与相应细胞ＬＤＨ总活性的比值来表示ＬＤＨ释放率。

３畅４　神经元损伤率：神经元处理后用５μｍｏｌ／Ｌ碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ；激发波长５３５ｎｍ，发射波长６１５ｎｍ）室温避光孵育３０ｍｉｎ，再用２０ｍｇ／ＬＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色液３ｍｉｎ，共焦显微镜下观察，摄片。