蛋白质泛素化与人类疾病发生的关系及其研究进展

泛素化修饰与人类疾病

泛素-蛋白酶体途径由泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes，E2s)、泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligases，E3s)、26S蛋白酶体和泛素解离酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)等组成，其对靶蛋白的降解是一种级联反应过程。泛素首先在El催化下，其C 末端甘氨酸残基与El的半胱氨酸残基间形成高能硫酯键而获得活性。El-泛素结合的中间体再将泛素转移给E2，形成E2-泛素中间体。最后靶蛋白的泛素化还需要另一个特异的泛素蛋白连接酶E3s。E3s可以直接或间接与底物结合，促使泛素从与E2s形成的硫酯中间产物转移到靶蛋白赖氨酸残基的ε氨基基团上，形成异肽键(isopeptide bond)。当第一个泛素分子连接到靶蛋白上后，另外一些泛素分子在E3s的催化下相继与底物相连的泛素分子的第48位赖氨酸残基相连，形成一条多聚泛素链，作为底物被蛋白酶体识别和降解的靶向性信号。完成泛素化的蛋白质结构被展平进入26S蛋白酶体，在20S催化中心中被降解，泛素分子可被DUBs从底物上水解下来，重复利用。

一、泛素(Ub)

泛素是1975年由Goldstein首先发现的一种在真核生物细胞高度

保守的多肽，单个泛素分子由76个氨基酸组成，分子量约8.5kD。在不同生物体间组成泛素的氨基酸序列差别很小，如酵母和人的泛素仅有3个氨基酸序列的差别。泛素分子紧密折叠成球形，5股混合的β片层形成一个腔样结构，部对角线位置有1个α螺旋，这个结构称为泛素

折叠。这个小蛋白含有一个明显的疏水核心和大量的氢键，表现出特殊的稳定性，能够防止在结合和靶向性降解循环中变性失活，从而保证泛素循环的运行。从泛素折叠中突出来的是具有一定变形性的C末端延伸部分，这个末端第76位含有一个必须的甘氨酸。泛素与其它蛋白都是通过C-末端第76位甘氨酸来连接的。

二、泛素活化酶(E1)

El是泛素与底物蛋白结合所需要的第一个酶，但是对靶蛋白的特异性却几乎没有影响。El是一种广泛表达的多肽，大约1100个氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸残基。El有2个亚型，是由同一个mRNA在不同的起始位点翻译而成的，存在于细胞浆和细胞核中。酵母的El基因失活后是致命的，说明这个蛋白对于细胞的生存是至关重要的(Stephen等．1996)。El可以水解ATP，与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素。在真核生物这个激活反应由两步构成：起始形成泛素-腺苷酸中间物，接下来这个中间物与El半胱氨酸残基发生反应形成E1-Ub硫酯键。通常一个泛素分子有一个单独的E1。E1具有高度的催化效能，在低浓度的情况下就能够激活泛素，满足下游的级联反应过程(Pickart．2001)。

三、泛素结合酶(E2s)

级联反应的第二步是泛素分子经过转硫醇反应从E1半胱氨酸残基转移给E2s活化的半胱氨酸位点。E2s在哺乳动物中至少有25个基因，所有的E2s都含有一个保守的大约150个氨基酸的核心结构域，在结构域的中央是决定E2s活性的半胱氨酸残基，位于蛋白表面浅的裂隙

(Hamilton等．2001)。E2s家族中的一小部分成员只含有这个核心结构，但是其它的大部分成员还有N-或C-末端的延伸，这种结构可能与E3s 的识别、E2s自身的活性以及底物识别有关。E1和E3s通过相同的基序与E2s连接，这说明在反应循环过程中，E2s必须在E1和E3s之间穿梭往返运行。因此为了保证在激活的泛素与数量巨大的E3s之间得到平衡的分布，需要多个E2s异构体。E2s／Ub非共价结合的亲和力非常低，说明其在转移泛素分子到靶蛋白上起着重要的作用。

四、泛素-蛋白连接酶(E3s)

泛素化途径最重要的特征就是底物的多样性和选择性，这一功能由E3s直接决定。目前主要有3种类型的E3s，即含有HECT(homologous to E6-associated protein carboxyl terminus)结构域的E3s、含有环指状(RING finger)结构域的E3s和含有U-box结构域的E3s[2]。在高等生物E3的总数从几百到一千以上，新的E3亚家族仍不断被发现。正是由于这些复杂多变的E3s家族成员可以对不同的底物进行特异性的识别，才呈现出蛋白降解的高度选择性。

(一)含有HECT结构域的E3s

HECT E3s的命名是因为其C-末端含有一段大约350个氨基酸的区域与E6-AP(E6-associated protein)的C-末端同源。HECT E3s催化转硫醇反应将E2s中的泛素转移给HECT结构域的保守的半胱氨酸残基。

E6AP-HECT／UbcH7复合体的晶体结构显示HECT结构域呈L形，活性位点位于L形的拐弯处(Huang等．1999)。游离的HECT结构域与E2s有较强的相互作用，E2s结合位点位于L形基底部的末端。HECT结构域

的缺失不影响底物的结合，高度可变的N末端结构域负责对特异底物的识别和结合。

(二)含有环指状结构域的E3s

其特征是含有一个保守的组氨酸和半胱氨酸残基复合体，在其中心有2个Zn+ 离子。RING E3s没有直接催化蛋白泛素化的作用，其作为一个停靠位点将靶蛋白和E2s聚集在一起，然后介导泛素的转移而不是与泛素形成硫酯键。含有环指状结构域的E3s可被分成2种类型，一种是单个蛋白，其代表是作为P53的E3s的MDM2(mouse double minute 2)癌蛋白(Honda等．2000)以及作为受体酪氨酸激酶如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和血小板衍生因子受体(p l a t e l e t-d e r i v e d g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r)E3s的c-Cbl(Tsygankov等．2001)。另一种是多蛋白组成的复合体，包括SCF(Skpl-Cullin／Cdc53-F-box-Rbx1)、有丝分裂后期促进复合物(aftaphasepromoting complex，APC)和VBC-Cul2复合体(the v o n-H i p p e l-L i n d a u-e l o n g i n s B a n d C-C u l2 complex)。SCF E3s是至少有4种多肽组成的复合体。被命名为SCF是因为其中的三个核心亚基(Skpl、Cullin／CDC53和一个F-Box蛋白)。后来第四个亚基Rbxl(RING box 1 protein)被发现，其含有一个RING H2-型结构域。在SCF E3s中的Rbxl能够集合E2，Cullins蛋白作为Rbxl 与蛋白之间的支架参与底物的选择性。底物的识别由底物特异性的F-box蛋白所介导，F-box本身被SCF E3s复合体中的Skpl接头因子所识别和聚集。Skpl与Cullins结合，因此将底物和泛素并列排开。F-box