狂犬病病毒核蛋白基因生物信息学分析

亡人 数 呈 上 升趋 势 ， 自 ２ ０ ０ ３年 以 来 ， 年 发 病 例 数 均 超 过
Ｔ Ｃ ＧＡ ＡＴＡ Ｃ Ｇ Ｔ ３ （ Ｎｏ ｔ Ｉ 酶切位 点） 。
１ ． ３ 病 毒 ＲＮ Ａ 的提 取
取狂犬病病 毒 Ｃ Ｖ Ｓ株 致 死 的 小 鼠 １只 ， 无 菌 解 剖 取 脑 组织少许 ， 加 适 量 含 抗 生 素 的溶 液 研 磨 ， 用Ｐ Ｂ Ｓ制 成 １ ： ５的 悬液， 反 复 冻 融 。然 后 以 ７ ５ ０ ０ ｒ ／ｍｉ ｎ于 ４℃ 离 心 １ ０ ｍｉ ｎ ， 取 上 清液 用 于 提 取 Ｒ ＮＡ。其 它 步 骤 按 Ｒ ＮＡ 提 取 试 剂 盒 说 明 书 进行 。获 得 的 Ｒ ＮＡ 于 一 ２ Ｏ℃ 保 存 或 直 接 本 研 究对 狂 犬病 病 毒 （ ｒ ａ ｂ ｉ ｅ ｓ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，Ｒ Ｖ） Ｃ ＶＳ株 核 蛋 白基 因进 行 了克 隆 与 测 序 ， 推 导 出相 应 的 氨 基 酸 序
列 。然 后 采 用 Ｇａ ｍｉ ｅ ｒ — Ｒｏ ｂ ｓ ｏ ｎ方 法 和 Ｃｈ ｏ ｕ — Ｆａ ｓ ｍａ ｎ方 法 预 测 了蛋 白 的 二 级 结 构 ， 用 Ｋｙ ｔ ｅ － Ｄｏ ｏ ｌ ｉ ｔ ｔ ｌ ｅ方 法 对 蛋 白 的 亲
水 性 进 行 了 分析 ， 用 Ｅ ｍｉ ｎ ｉ 方 法预 测 了蛋 白的 表 面 可 能 性 ， 以Ｊ ａ ｍｅ ｓ ｏ ｎ — Ｗｏ ｌ ｆ 方 法 预 测 了蛋 白的 抗 原 指 数 。 然 后 综 合
分 析 预 测蛋 白 的 Ｂ 细胞 抗 原 表 位 。结 果表 明 ， 核 蛋 白序 列 的 １ ４ ３ —１ ５ ２ 、 １ ６ ６ —１ ７ ２ 、 ２ ６ ３ —２ ７ ３ 、 ４ １ １ —４ ２ ７区域 或 其 附近 最有 可 能是 Ｂ 细胞 抗 原 表 位 的优 势 区 域 。 本 结 果 为 狂 犬 病 反 向疫 苗 学 的研 究提 供 了 一 定 的理 论依 据 。 关 键 词 ：狂 犬病 毒 ； 核 蛋 白； 二 级 结构 ；Ｂ细胞 表住
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《 上 海 畜牧 兽 医通讯 》 ２ ０ １ ３年 第 ２期
狂 犬 病病 毒核 蛋 白基 因生物 信 息学 分析
李江涛 胡 亮 张金卫 殷 相 平。 丁 农 鲁新 伟 吴明 良 郑 明 亮 潘颂 华
（ｉ湖 州 市 农 业 科 学 研 究 院 浙江 湖 州 ３ １ ３ ０ ０ ０ ２湖 州 市 吴 兴 区畜 牧 兽 医局 浙 江 吴兴 ３ １ ３ ０ ０ ２ 吴兴 吴兴 ３ １ ３ ０ ０ ２ ３ １ ３ ０ ０ ２） ３中 国农 业 科 学 院 兰州 兽 医研 究 所 甘 肃 兰 州 ７ ３ ０ ０ ４ ６ ４湖 州 东 林 镇 农 业 综 合 服务 中 心 浙 江 ５湖 州 织 里 镇 农 业 综 合 服 务 中心 浙 江 吴兴 ３ １ ３ ０ ０ ２ ６湖 州 埭 溪 镇 农 业 综 合 服 务 中 心 浙 江
引起 的 高 致 死 性 人 兽 共 患 传 染 病 ， 广泛 分布 于亚 、 非、 欧、 美 等各大洲 ， 一旦 发病 即引起 １ ０ ０ 死亡 ， 严 重 威 胁 人 畜 的 健 康。 。全 球 每 年 约 有 ５ ５ ０ ０ ０人 死 于 狂 犬 病 ， 约 ９ Ｏ 发 生 在 亚洲 、 非 洲 等 发 展 中 国 家 。近 年 来 ， 我 国 人 狂 犬 病 发 病 和 死
２ ０ ０ ０ 例 。Ｒ Ｖ基因组 为单股 不分 节段 的 负链 Ｒ ＮＡ， 含 ５个 大 的 开 放 阅读 框 ， 编 码 ５种 结 构 蛋 白 ， 即核蛋 白（ Ｎ） 、 基 质 蛋 白（ Ｍ） 、 磷 酸 化 蛋 白（ Ｐ ） 、 糖 蛋 白（ Ｇ）和 转 录 酶 蛋 白 （ Ｌ ） 。 核 蛋 白是 除糖 蛋 白 以 外 具 有 免 疫 原 性 的 另 一 种 重 要 的 内 部
狂犬病 （ ｒ ａ ｂ ｉ ｅ ｓ ） 是 由狂 犬 病 病 毒 （ ｒ ａ ｂ ｉ ｅ ｓ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ， ＲＶ） 感 染 Ｃ Ａ ＡＧＡ Ｔ 一 ３ （ Ｂ ａ ｍＨ Ｉ酶 切 位 点 ） ；
下 游 引 物 Ｎ２ ：５ 一 ＡＧＣ ＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＧＡＧＴＣＡＴ—
结构蛋 白 ， 也是毒粒 中最保 守 的蛋 白， 在 不 同 毒 株 之 间 有 高
１ ． ４ 目的 基 因 的 扩 增 、 克 隆及 序 列 分 析
使用合 成 的引物 Ｎ ２ ， 用 ＡＭＶ 反 转 录 酶 和 Ｐ ｒ ｅ ｍｉ ｘ Ｔａ ｑ Ｄ ＮＡ 聚 合 酶 进 行 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ反 应 ， 扩 增 目的 基 因 ， 用 １ ０ ｇ ／ Ｌ 的琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 扩 增 结 果 。将 Ｐ Ｃ Ｒ产 物纯 化 回收 ， 并与 ｐ ＭＤ １ ８ 一 Ｔ载体连接 ， 转化 Ｊ Ｍｌ Ｏ ９感 受 态 细 胞 ， 用 Ａ ｍｐ
度 的保 守 性 ， 其在刺 激细 胞免疫 方 面发挥 主要作 用 ， 已被 国 外学 者 用 于 不 同 系 统 的 表 达 和 免 疫 研 究 。 。 反 向疫 苗 学 是 通 过 分 析 病 毒 的 基 因 组 序 列 来 预 测 病 原 体 的抗 原 信 息 ， 然后 筛选 出合适 的候 选抗 原 ， 进 而 研 制 出 有 效 的疫 苗 ” 。 本研 究 在 测 定 基 因 序 列 的 基 础 上 ， 应 用 生 物 信 息学技术对 Ｒ Ｖ ｃ ＶＳ株 糖 蛋 白 、 核 蛋 白二 级 结 构 和 Ｂ细 胞 表 位进行分析和预测 ， 为Ｒ Ｖ 反 向遗 传 学 及 基 因 工 程 疫 苗 的 研