RNAi抑制hTERT基因治疗乳腺癌的实验研究
RNA干扰技术的研究及进展
RNA干扰技术的研究及进展RNA干扰是近几年兴起的一种新技术，它是由双链核糖核酸引起的抑制基因表达的一种现象。
这种新技术在抗病毒、抗癌症和基因病等医学领域表现出了广阔的应用前景。
本文就RNA干扰的作用机制、研究进展进行综述。
标签：RNA干扰技术基因沉默研究进展RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是近年来发现的一种高效特异地阻断基因表达的新技术。
RNAi 是指一些小的双链RNA（dsRNA）在细胞内Dicer 内切酶的识别、结合、酶切下，产生有活性的长度为21～23nt 干扰性RNA（short interfering RNA ，siRNA），与互补的目的基因的mRNA 结合并使之降解，从而到达抑制目的基因表达的作用，是一种由双链RNA诱发的“基因沉默”现象。
本文旨在讲述RNA干扰的作用机制及研究进展。
1. RNA干扰技术的作用机制RNAi是指细胞中导入与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA （double—stranded RNA，dsRNA）片段，可致该mRNA发生特异性降解从而导致基因表达沉默的现象[1]。
其作用机制是：外源性（如病毒）或内源性的dsRNA 在细胞内与一种具有dsRNA特异性的RNA酶Ⅲ内切核酸酶（RNaseUIendnuclease）——Dicer结合为酶dsRNA复合物，随即被切割成21～23nt的RNA片段，即siRNA。
siRNA与Dicer形成RISC。
siRNA 作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RISC复合体结合mRNA.随后siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶Dicer将mRNA切割成21～23nt的片段，从而可以破坏特定目的基因转录产生的mRNA，使其功能沉默，即基因沉默（gene silencing）。
而新产生的siRNA片段可再次与Dicer酶形成RISC复合体，介导新一轮的同源mRNA降解，从而产生级联放大效应，显著增强了抑制基因表达的作用2. RNA干扰技术的临床应用与进展2.1抗肿瘤治疗2.1.1白血病的治疗化疗在恶性肿瘤的治疗中具有重要地位。
用RNA干扰技术以端粒酶hTERT亚基为靶点治疗肿瘤的研究进展
ｓｏｋｐ ｔｎ９） ２ 、ｄ ｓｅｉ，其 中只有 ｈ Ｅ Ｔ ｈｃ ｒ ｅ ０、ｐ３ ｙｋｒ ｏｉ ｎ Ｔ Ｒ 在
正常和癌组织中存在差异性表达 ， 其证据来 自Ｃ ａｇ Ｔ ｈｎ Ｊ
端粒酶是所有 的肿瘤细胞均高表达而正常细胞无
表达（ 生殖细胞 、造血 干细 胞等 除外 ） 。端粒序列 存 的酶
一
旦表达就和其它亚单位一起组装成高活性的端粒酶
全酶 。目前 已知 ，ｈ Ｅ Ｔ是 ｌ３ 个氨基酸残基组成的 ＴＲ 】２
周期检查点发出周期停止信号 ， 细胞 生长被阻止在死亡
２ 期导致细胞死亡。而在生殖细胞、造血千细胞、胚胎
细胞 、 大多数 肿瘤细 胞 、永生 化细胞 株 中 ， 绝 当端粒 序
长度且 越过死 亡 ２ 后 ， 期 便获 得永 生性成 为 无限增殖 细
只有完整的 ｈ Ｅ Ｔ转录产物才表达端粒酶活性Ｌ。 ＴＲ ２ Ｊ 目前肿瘤靶向治疗的方法主要有靶向基 因－ 病毒治 疗、 抗体治疗、 Ｎ Ｒ Ａ干扰（Ｎ ｔ ｆ ｅｃ， Ｎ ｉ Ｒ Ａｉ ｅ ｅ ｎｅＲ Ａ ） ｎ ｒｒ 技术、 细胞治疗、小分子靶 向药物和纳米技术等。其中 Ｒ Ａ Ｎ 干扰技术 由于长期高效的基因沉默效果、 特异性强、 快
一ห้องสมุดไป่ตู้
外切酶破坏 。正常细胞 Ｄ Ａ 复制时，其染色体末端 Ｎ Ｄ Ａ引物丢失 ， Ｎ 产生 ８ ２ｐ的短裂隙， Ｄ Ａ聚合 ～１ｂ 而 Ｎ
种 调节 亚 单位 ，对 端粒 酶 活 性 有 限速 效 应 ，ｈ Ｅ Ｔ Ｔ Ｒ
酶不能完全复制已产生的碱基裂隙， 故每条染色体末端
将缩短 ５ ＂２ ０ ０－ ０ 个核苷酸 ， － 当缩短至一定长度后， 细胞
作者 单位 ： 三 蛱 大学 医学 院 生物病 原 学部 （ 北 宜 昌 ４３ ０ ） １ 湖 ４ ０ ２
RNAi技术应用于妇科肿瘤治疗的研究进展
在蠕虫和植物中的机制在果蝇和哺乳动物中的机制有义链降解扩增靶mRNA靶mRNAmRNA 的降解mRNA 的降解dsRNAsiRNA RISC RISCDicer RdRP Dicer 图1RNAi 作用的可能机制2009年5月第16卷第5期Clinical Medical Engineering2009,16（5）1.2RNAi的特点RNAi具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。
总的来说, RNAi具有以下几个特点:①抗干扰性:RNAi是dsRNA介导的转录后沉默机制,各种翻译抑制剂对RNAi不产生影响;②特异性:RNAi只能特异地降解与之序列相对应的单个内源基因的mRNA,而其它mRNA的表达则不受影响[3],因此具有很高的特异性;③稳定性:siRNA在细胞内可稳定存在3~4天,其半衰期远长于反义寡聚核苷酸。
④催化性:RNAi可以通过催化放大的方式有效地引发基因沉默,也就是说,相对少量的dsRNA分子就能高效抑制相应基因的表达;⑤传递性:RNAi抑制基因表达的效应可以跨越细胞界限,在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持,并可传递给子代[4]。
2RNAi技术在宫颈癌治疗中的研究进展宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,在各类女性恶性肿瘤中其发病率仅次于乳腺癌。
研究证明,人乳头状病毒(HPV)和宫颈癌的发生有着密切的关系。
流行病学调查显示,90%以上宫颈癌肿瘤组织中存在HPV16或HPV18的核酸序列。
HPV16和HPV18的活性变化依赖于E6和E7病毒基因的功能,在宫颈癌的发生发展、维持肿瘤恶性表型中起重要作用。
E6和E7基因在HPV感染所致宫颈癌细胞中过表达,导致p53及Rb蛋白持续失活,严重干扰p53和Rb蛋白对细胞周期激活-停滞状态的调控,使p53蛋白介导的细胞凋亡降低,细胞进入S期并活跃增殖。
Sima 等[5]构建了以HPV16E7为靶点的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体,用其转染HPV16阳性的SiHa和CaSki 细胞后同时抑制了E6和E7基因的表达,并通过激活细胞p53, p21和Rb蛋白诱导肿瘤细胞凋亡。
siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
ｃ ｎｅ ｅｓ ＬＵＡ —ｉｇ Ｄ Ｎ ｕ ｎ， Ａ ｎ ｎ Ｚ Ｅ Ｇ Ｚ ｕｎ Ｈ Ｎ Ｊ ｎ ｕ ．Ｍｏ ｃｌｒ ａ ｃｒｃｌ Ｉ ｎｄｎ ． Ｏ Ｇ Ｘ ｅ ｕ Ｙ ＮＧＭｔｇ ｇ， Ｈ Ｎ ｈ ａ ，Ｃ Ｅ ｉ － ｎ ｌ ａｊ ｌｕ ｅ ａ
Ｍｅｉｎ ｅｔ Ｓ ａｘ ｇ Ｐ ｏｌ Ｈ ｓｉ ｌ ｔＡ ｌ ｔ ｏ ｉ ｌ Ｓ ａｘｎ ｎ ｅ ｉ ，Ｓａｘｎ ｄｃ ｅＣｎｒ ｉ ｅ ｈ ｏｉ ｅ ｅ ｏ ｔ Ｆ ｆ ｉｅ Ｈ ｓ ｔ ｈ ｏｉ Ｕ ｉ ￣ｔ ｎ ｐ ｐ ａｔ ｉ ａｄ ｐａ ｇ ｖ ｙ ｈｏｉｇ
３ ０ １２ ００． ｉａ ｎ
【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊ ｔ ｅ Ｔ ａ ａ ｅ ｆｃｏｔｇｔｇ Ｔ Ｒ ｎ ｅ ｒｉｒｉ ｄ ｐｐ ｓ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂ ｃ ｖ ｏ ｖｌ ｔｔ ｆ ｔｆ ｒ ｉ Ｅ Ｔ ｅｅ ｎｈ ｏｆａｏ ａ ｏｔ ｉ ｅ ｉ ｅ ｕ ｅｈ ｅｅ ｅｎ ｈ ａ ｇ ｏ ｔ ｐ ｌ ｔｎ ｎ ａ ｏ ｓ ｅ
（ １３± ． ） 、６ ． ６ ３ ％ 和（ ． ± ． ） ， ６ ． ４ ３ ％ （５ ６± ． ） ３ １ ４ ５ ％ 细胞克隆形成 能力下降 ， 亡率 明显增 加。结论 凋 体
外化学合成 的 ｈ Ｅ Ｔ ｓ Ｎ Ｔ Ｒ ｉ Ａ可 以有效地抑制 ＭＣ － Ｒ Ｆ７细胞 ｈ Ｅ Ｔ的表达 ， 而抑制细胞增 殖 ， 进细胞 ＴＲ 从 促
ｏ Ｆ一ｃｌ ． Ｍｅｈ ｄ Ｃ ｅ ｃｌ ｓｎｈ ｓｚｄ ｓ ｌ ｉｔｒ ｒｎ Ａ （ ｉ ｆＭＣ ７ ｅｌ ｓ ｔｏｓ ｈ ｍｉａｌ ｙ ｔｅｉｅ ｍａｌ ｎｅ ｅｉｇ ＲＮ ｙ ｆ ｓＲＮＡ） ｔｒｅｉｇ ｈ ＥＲ ａ ａｇｔ Ｔ Ｔ ｗ ｓ ｎ
RNAi对人乳腺癌MCF-7细胞E2F1、TS基因表达的抑制作用
Ｒ Ａ 对 人 乳腺 癌 ＭＣ 一 胞 Ｅ Ｆ 、 Ｓ Ｎ ｉ Ｆ７细 ２ １Ｔ 基 因表 达 的抑 制 作用
黄 慧敏 李 惠翔 张 ， ， 红 姜 国忠。赵 阿红。 ， ，
（ １河源 市人 民 医院 ， 东河 源 ５ ７０ ； 州大 学第一 附属 医院） 广 １００２郑
呤 酶素 ８ ｇＩ ） 约 １ ／１ ， Ｏｄ后 ， 染组 成 活 的细 胞 即 Ｉ １ 转
为转染成功的细胞 ， 渐有克隆形成。待长出抗性克 隆后 分选 大而健康 的克隆转 移 至另一 培养板 中扩 大
培养 。重组 质粒转 染 组和空 质 粒 转染 组 分别 挑选 ７ 个 和 １ 单 克隆 细 胞 扩 大培 养 ， 个 分别 命 名 为 ＳＲ１ Ｉ ． ７
日 ＾ — ｍ ， 点 凡 ｇ，ｚ ＾ Ｇ 舶 ， ⅣＧ Ｇ 一 ０ ， ＿ ｒ Ｚ Ｄ Ａ一 ０ ＾
（ ｅ ｅｐｅ 舶 印 Ｚ 厂 １ ０ｚ ｓ ｐ Ｑ
口 ， 眦 ｎ５ ７ ０ Ｐ Ｒ Ｃ 凡 ｌＯ ｏ， ． ． № ）
Ａｂｔａｔｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｅｃ ｔｅｉｈｂ ｉ ｆ Ｎ ｔ ｌｎ ｅｔ ｔｅ唧 ｒ ｓ ｎ０ ２ １ｅｅｉ ｂｅｓ 唧 ｃｒ ｅ ｓｒｃ ： ｊｃｉ ｌｄｅｔｈ ｎｉｉ０ ０ Ｒ ｅ ｌ （ ｈ ｖ ０ ｔｎ ｃｉ ０ ｅ ｉ ｆ Ｆ ｎ Ｉａｔ ｓｏ Ｅ ｇ ｎ ｅ Ｕ ｃ
［ 摘要 】 目的 观察 Ｒ Ａ干扰（ Ｎ ） Ｎ Ｒ 技术对乳腺癌细胞 Ｍ Ｆ ｃ － Ｅ Ｆ 、 苷酸合成 酶 （ Ｓ 基因表达 的靶 ７中 ２ １胸 Ｔ）
向抑制作用 。方法 受到抑制 结 论 设 计合成并构建 Ｎ ］ ， 呓Ｆ Ｆ７细胞。筛选稳定转 染的单克 Ｒ Ａ 技术 特异 、 Ｎｉ 高效抑 制靶基 因 磁 Ｆ 及 Ｔ ｌ Ｓ表达。
使用hTERT启动子联合RNAi靶向逆转乳腺癌的耐药性
Ｍ Ｉ比色法结果显示 ： Ｔ＂ 对阿霉素 的药物敏感性 明显提高。结论 ： 使用 ｈ Ｅ Ｔ启动子联合 Ｒ Ａ 成功靶 向沉默 Ｂ Ｒ ＴＲ Ｎ ｉ Ｃ Ｐ基 因， 乳腺 癌 ＭＣ 一／ Ｄ Ｆ ７Ａ Ｒ对 阿霉素的敏感性明显增加 ， 为进一步开发肿瘤 的特异性基 因沉默治疗奠定实验基础。
ｂｅｓ ｃ ｎ ｅ ｌ ａ ｄｔ ｏ ｓｒ ａ ｇ ｓ ｆ ｒａｔ ａ ｃｒ ｅ ｉ ａ ｃ ｒｔ ｎ（ Ｃ Ｐ ｍＲ Ａ， ｔ ｐｏｅ ｐｅ ｓ ｎａ ｄｃ ａ ｇ ｓ ｆ ｍｇ ｒａｔ ａ ｃ ｒ ｅ ， ｎ ｅｖ ｃ ｎ ｅ ｏ ｅ ｓ ｃｎ ｅ ｓ ｔ ｅ ｏ ｉ Ｂ Ｒ ） Ｎ ｉ ｒｔ ｎ ｘ ｒ ｉ ｎ ｎ ｅ ｃｌ ｏｂ ｅｈ ｂ ｒ ｓｎ ｐ ｅ ｓ ｉｅ ｓｏ ｈ ｏｄ
作者 介 绍 ： 黄金 向（ ９０ ， ， 院 医师 ， 士 ， １ ８ 一）男 住 硕
研 究方向： 乳腺 肿 瘤 。
ＲＴ－ ＰＣＲ ， ｄ ａｎ Ｗ ｅ ｔｒ －ｂ ｏ ｗｅ ｅ ｐ ｉｄ ｏ ｓｅ ｎ ｌｔ ｒ ａ ｐｌ ｔ ｄｅｅ ｔ ｅ ｔ ｃ ＲＮＡ ａ ｄ ｎ ｐ ｏｅｎ ｏ ｉ ｅ ｅ ｔｇｏ ｓ ｏ ｅｌ．ＭＴＦ Ｗａ ｐｐｉ ｄ ｏ ａ ｌｚ ｒ ｔｉ ｆｄｆ ｒ ｎ ｒｕｐ ｆｃ ｌｓ ｓ ａ ｌｅ ｔ ｎａｙ ｅ
【 ｂｔ ｃ］ ｂｅｔ ｅ Ｔ ｌ ｅｔｅ ｒ ｏｅ ｏ ｍ ｎｔｏ ｅａｅｒｖｒ ａｓｒ ｔ ｅ （Ｔ Ｒ ） ｎ ｖｓｇｔ ｉ ｌ ｔ ｅ ｆ ｃｏ Ａ ｓ ａｔＯ ｊｃｉ ： ｏｃ ｎ ｏ ｔ ｆ ｕ ａ ｌ ｒｓ ｅｓ ｔ ｎｅ ｐ ｓ ｈ Ｅ Ｔ ａｄｉ ｅｔ ａ ｓ ｅｅ ｉ ｅｔ ｎ ｒ ｖ ｏ ｈｐｍ ｒ ｈ ｅｍ ｅ ｅｒ ｉａ ｎ ｉ ｅ ｔｓ ｃ ｖ ｅ
小干扰RNA抑制乳腺癌T47D细胞端粒酶活性的研究的开题报告
小干扰RNA抑制乳腺癌T47D细胞端粒酶活性的研
究的开题报告
题目：小干扰RNA抑制乳腺癌T47D细胞端粒酶活性的研究
研究背景与意义：
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病机制复杂，包括遗传、
环境等多种因素。
一些研究表明，端粒酶在乳腺癌细胞中的活性水平比
正常细胞高，维持着乳腺癌细胞的不死状态，并促进肿瘤的生长和转移。
因此，抑制端粒酶的活性可能成为治疗乳腺癌的新策略之一。
研究方法：
本实验将通过体外细胞实验，探究小干扰RNA（short interfering RNA, siRNA）对乳腺癌T47D细胞中端粒酶活性的影响。
首先，选取与端粒酶基因（TERT）序列匹配的siRNA，将其转染至T47D细胞中。
接下来，利用实时荧光定量PCR和Western blot等方法验证siRNA抑制了TERT的表达水平。
随后，对转染和未转染细胞的端粒长度及端粒酶活性进行测定，分析siRNA对T47D细胞中端粒酶活性的影响。
预期结果：
本实验预计，通过siRNA靶向抑制TERT基因表达，能够显著降低
T47D细胞中的端粒酶活性，从而阻断其维持细胞不死状态的功能。
此外，我们还将探究在siRNA抑制TERT基因表达的同时，T47D细胞的增殖、
凋亡和转移等生物学行为是否会发生改变。
研究意义：
本研究将揭示siRNA抑制TERT基因表达对乳腺癌端粒酶活性的影响，为乳腺癌治疗提供新策略。
同时，本研究还有望为探究端粒酶在乳
腺癌细胞中的生物学功能提供参考。
RNA干扰技术在乳腺癌治疗中的研究进展
ｍ Ｒ Ｎ Ａ降解 ， 诱 使 细 胞 目的 基 因 功 能 丧 失 或 表 现 出特定 基 因缺 乏 的表 型 ， 达 到转 录后 水 平 的基 因 沉默 （ ｐ ｏ ｓ ｔ — ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｃ ｒ ｉ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｌ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ， Ｐ Ｔ Ｇ Ｓ ） 的 过程 。这 一 自然 科 学 界 的 重 要 发 现 ， 目前 已广 泛 用 于基 因功 能及基 因 治疗 的研究 ¨ 。乳 腺 癌 的发
依赖 的方 式逐 步切 割 ｄ ｓ Ｒ Ｎ Ａ成 长约 ２ １ — ２ ３ ｂ ｐ具 有 特 定结 构 由正 反 义链 组 成 的双 链 小 分 子 干 扰
Ｒ Ｎ Ａ（ ｓ ｍａ ｌ ｌ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ Ｒ Ｎ Ａ， ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ） ， 小 片 ｉ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｌ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ， Ｔ Ｇ Ｓ ） ［ ５ － ９ ］ 。
或Ｐ Ｔ Ｇ Ｓ 。１ ９ ９ ０年 ， Ｎ ａ ｐ ｏ ｌ ｉ 等 在植 物 中 “ 偶然 ” 发现 基 因 沉 默 现 象 ； １ ９ ９ ８ 年 ，Ｆ ｉ ｒ ｅ等 发 现 ｄ ｓ Ｒ Ｎ Ａ能在 秀 丽 隐杆 线 虫 中高 效抑 制基 因表 达 ， 并第一 次命 名 为 Ｐ Ｔ Ｇ Ｓ ； 现 已证 实几 乎 所有 多细 胞 真核 生 物 中都 广 泛 存 在 Ｒ Ｎ Ａ ｉ 现象。Ｒ Ｎ Ａ ｉ 在 生 物学 的各个 领 域 取 得 了令 人 瞩 目的成 就 ， 在 医 学 上被用 来 作为 研究 基 因功能 和基 因治 疗 的最 具 潜 力 的工 具 之一 。 Ｒ Ｎ Ａ ｉ 是 抵 御 转 基 因 或外 来 病 毒 侵 犯 的 防 御 机制 ， 是真 核 生物 一 种 高 度 保 守并 具 有 特 异 序列 的Ｒ Ｎ Ａ降解 系统 ， 由２ １～ ２ ３ ｂ ｐ的 内源 或外 源性 双链 Ｒ Ｎ Ａ在细 胞 内特 异 性诱 导 降 解 其 互 补 序列 ｍＲ Ｎ Ａ， 从而 特 异 性 致 使 靶 基 因转 录 后 沉 默 的 过 程 ｊ 。Ｒ Ｎ Ａ ｉ 的 作 用 机 制 尚不 十 分 清楚 ， 但 其 可
RNA干扰及其在乳腺癌研究中进展
２２８陕西医学杂志２０１０年２月第３９卷第２期也可诱导口腔上皮细胞的恶性增殖，引发肿瘤，因此我们可以推测，上述的各种因子的异常表达使ＯＬＰ发生癌变的危险性显著增加，在研究ＯＬＦ病变机制中应引起关注。
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Ｃｌｉｎｉｃａｌｆｉｎｄｉｎｇｓｗｉｔｈｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｔｅｓｔｉｎｇｉｎｆａｍｉｌｉｅｓｗｉｔｈｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，１９９８，３３９：５１１－５１８．［４］ＰｉｍｅｎｔａＦＪ，ＰｉｎｅｉｒｏＭＤ，ＧｏｍｅｚＲＳ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈＭＳＨ２ｐｒｏｔｅｉｎｏｆｔｈｅｈｕｍａｎＤＮＡｍｉｓｍａｔｃｈｒｅｐａｉｒｓｙｓｔｅｍｉｎｏｒａｌｌｉｃｈｅｎｐｌａｎｕｓ［－Ｊ］．ＩｎｔＪＭｅｄＳｃｉ，２００４，１（３）：１４６—１５１．［５３ＤｏｍｅＪＳ，ＢｏｃｋｈｏｌｄＣＡ，ＬｉＳＭ，ｅｔａ１．ＨｉｇｈｔｅｌｏｍｅｒａｓｅＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｓａｎａｄｖｅｒｓｅｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｆａｃｔｏｒｆｏｒｆａｖｏｒａｂｌｅｈｉｓｔｏｌｏｇｙＷｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒＩ－Ｊ］．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ，２００５，２３（３６）：９１３８—９１４５．［６］ＣａｉｒｎｅｙＣＪ，ＨｏａｒｅＳＦ，ＤａｉｄｏｎｅＭＧ，ｅｔａ１．ＨｉｇｈｌｅｖｅｌｏｆｔｅｌｏｍｅｒａｓｅＲＮＡｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃｈｒｏｍａｔｉｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅＡＬＴｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｐｏｏｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓｉｎｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ［Ｊ］．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ，Ｚ００８，９８（８）：１４６７—１４７４．［７］ＦｌａｔｈａｒｔａＣＯ，ＦｌｉｎｔＳ，ＴｏｎｅｒＭ，ｅｔａ１．ｈＴＲＲＮＡｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｓａｍａｒｋｅｒｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｏｒａｌｌｉｃｈｅｎｐｌａｎｕｓ［Ｊ］．ＡｓｉａｎＰａｃＪＣａｎｃｅｒＰｒｅｖ，２００８，９（２）：２８７—２９０．［８］ＮａｋａｍｕｒａＴＭ，ＭｏｒｉｎＧＢ，ＣｈａｐｍａｎＫＢ，ｅｔａ１．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｃａｔａｌｙｙｉｃｓｕｂｕｎｉｔｈｏｍｏｌｏｇｓｆｒｏｍｆｉｓｓｉｏｎｙｅａｓｔａｎｄｈｕｍａｎ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７７：９５５—９５９．［９］ＧｈａｒｉｚａｄｅｈＢ，ＫａｌａｎｔａｒｉＭ，ＧａｒｃｉａＣＡ，ｅｔａ１．ＴｙｐｉｎｇｏｆｈｕｍａｎＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｂｙｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．ＬａｂＩｎｖｅｓｔ，２００１，８１（５）：６７３—６７９。
RNA干扰技术抑制乳腺癌表皮生长因子受体的表达
RNA干扰技术抑制乳腺癌表皮生长因子受体的表达吴伟东;方驰华;杨正心;包佳巾【期刊名称】《国际医药卫生导报》【年(卷),期】2010(16)16【摘要】目的探讨采用化学合成小干扰RNA(siRNA)介导的RNA干扰(RNAi)技术是否能有效抑制乳腺癌细胞株MDA-MB231、MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞表皮生长因子受体(EGFR)表达,以及抑制EGFR基因表达后乳腺癌细胞生物学特性的改变,以期为肿瘤治疗提供新的思路和实验依据.方法 (1)建立检测EGFR数量的方法,测定MDA-MB231、MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞株EGFR的表达.(2)观察dsRNA-EGFR/Lipofectamine 2000对EGFR表达的抑制作用.(3)采用流式细胞仪测定细胞周期,采用ELISA法观察抑制EGFR表达后,MDA-MB231,MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞生物学特性的改变.结果 MDA-MB231、MDA-MB-453S、ZR-75-30、ZR-75细胞株存在EGFR高表达.转染dsRNA-EGFR后可将MDA-MB231、MDA-MB-453S细胞对5-Fu的敏感性提高约4倍.细胞周期分析结果表明dsRNA-EGFR组G0-G1期细胞百分数较对照组增加了17.48%,进入S期的细胞百分数较对照组减少了19.20%.转染dsRNA-EGFR后可将ZR-75-30、ZR-75细胞对5-Fu的敏感性提高约7倍.结论(1)乳腺癌细胞株存在EGFR高表达.(2)dsRNA-EGFR可序列特异性下调乳腺癌细胞EGFR基因水平,显著降低EGFR蛋白表达.(3)dsRNA-EGFR通过抑制EGFR表达可显著抑制细胞增生和细胞迁移,降低配体EGF的含量,将更多的细胞阻滞在G0-G1期,增加细胞对5-Fu的敏感性,有效逆转乳腺癌细胞的恶性表型,从而为乳腺癌基因治疗提供了新策略.%Objective To investigate whether RNA interference(RNAi) produced by small inter- ference RNA (siRNA) could induce gene silencing in breast cancer cells and to assess the degree of epidermal growth factor (EGF) receptor gene silencing and its effect on functional outcome. Methods Overexpression of EGF receptor gene was determined in breast cancer cells and a variety of other types of cancer cells. Then breast cancer cell lines MDA-MB231, MDA-MB-453S, ZR-75-30, and ZR-75 were transfected with target se- quence-specific dsRNA as well as various controls. Immune fluorescent labeling, flowcytometry and Western blot were used to monitor the reduction in production of the EGF receptor protein. Quantitative reverse- transcriptase PCR was used to detect the silencing of EGF receptor gene levels. Cell count, colony assay, scratch assay, MTT assay, cell cycle analysis, and ELISA were used to assess the functional effects of RNAi. Results EGF receptor gene was overexpressed in breast cancer cells. In cell line MDA-MB231 and MDA-MB-453S, we displayed sequence specific silencing of the EGF receptor with 71.31% of downregulation of EGF receptor protein production and 37.04% of silencing of EGF receptor gene. The reduction in EGF receptor caused growth inhibition of the cells, reducing the total cell numbers by 85.0% and colony number by 63.3%. This also retarded the migration of MDA-MB231 and MDA-MB-453S by more than 80% at 24h and 48h, enhanced the chemosensitivity to cisplatin by four-fold. Cell cycle analysis showed that dsRNA-EGFR induced accumulation of cells in Go-Gi phase by 12.67% with a decrease in the percentage of cells in S-phase by 6.56% relative to control. The results from ELISA showed EGF level was reduced by 27.74%and 11.07% in medium and cell extraction respectively. In cell line ZR-75-30 and ZR-75, we displayed sequence specific silencing of the EGF receptor with 71.78% of downregulation of EGF receptor protein production and 50.00% of silencing of EGF receptor gene. The reduction in EGF receptor caused growth inhibition of the cells, reducing the total cell numbers by 78.3% and colony number by 66.8%. This also retarded the migration of ZR-75-30 and ZR-75 by more than 80% at 24h and 48h, enhanced the chemosensitivity to cisplatin by seven-fold. Cell cycle analysis showed that dsRNA-EGFR induced accumulation of cells in G0-G1 phase by 17.48% with a significant decrease in the percentage of cells in S-phase by 19.20% relative to control. ELISA showed EGF level was reduced by 45.65% and 22.45% in medium and cell extraction, respectively. Conclusions These sequence specific siRNAs showed a blockbuster effect in downregulation of EGF receptor gene expression, inhibition of the cellular proliferation and motility, arrest of the cell cycle, and enhancement of the cellular chemosensitization. The successful application of dsRN A-EGFR to reverse the neoplastic phenotype of EGF receptor overexpressing cells extends the list of available therapeutic modalities in the treatment of human cancer.【总页数】5页(P1934-1938)【作者】吴伟东;方驰华;杨正心;包佳巾【作者单位】510220,广州市红十字会医院胸外科;510282,广州,南方医科大学珠江医院外科;510220,广州市红十字会医院胸外科;510220,广州市红十字会医院胸外科【正文语种】中文【相关文献】1.RNA干扰技术抑制Galectin-3表达对三阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-231增殖和凋亡的影响 [J], 魏杨辉;张宗明;杨莉涛;黄耀;刘娟;张卫星;吴爱国2.RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达 [J], 郑秋红;龚福生;谢云青;陈蓉明;汪相如3.RNA干扰技术抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231中SATB1的表达 [J], 张瑞;曹以诚;张珍武;杜淑敏;徐爱群4.RNA干扰技术抑制乳腺癌细胞HER2的表达 [J], 陆婷;龚福生;郑秋红;郑天荣5.RNA干扰技术对Hep-2细胞表皮生长因子受体表达的抑制作用及诱导凋亡 [J], 张世文;何晓光;李晓江;王苑伶;武要洪;奚艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
文献检索综述 RNAi在乳腺癌治疗中的应用 (1)
现代分子生物学综述RNA干扰在乳腺癌治疗研究的应用（乳腺癌基因治疗进展）摘要：RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA (double-stranded RNA，dsRNA)分子在基因转录水平上关闭相应序列基因转录所致的细胞内有效的、特异性的基因封闭。
RNAi提出时间并不长，但这项技术已应用于多个领域，并取得了突飞猛进的发展。
随着研究的不断深入，RNAi在基因功能研究尤其是肿瘤相关基因研究及肿瘤治疗中的应用方面将有着巨大应用价值。
乳腺癌是是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤，是一种涉及多基因异常突变的全身性疾病。
本文就RNA干扰用于乳腺癌治疗研究中的究现状与进展作一综述。
关键字：RNA干扰，乳腺癌，基因治疗，乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的7％～10％，其发病率逐年增高，严重威胁女性健康。
人们对乳腺癌的认识也在不断的深入，从病理解剖学的认知到内分泌、分子生物学、肿瘤免疫学，乃至遗传、社会心理学多方面的认知，从发病和进展的角度来说，认为乳腺癌是一个全身性疾病是已被公认的事实。
乳腺癌的常用治疗手段主要是以传统的手术治疗为主，术后辅以局部或全身的放射治疗、化疗及内分泌治疗。
随着分子生物学技术及免疫学技术的迅猛发展，基因治疗逐渐成为肿瘤生物学治疗中的重要组成部分，1998年RNAi现象被发现，由于其能高效性、特异性等特点和优势，为基因功能的研究提供了强大的武器，也为乳腺癌基因治疗增添了新的活力。
1RNAi概述1.1RNAi的作用机制RNAi的机理包括起始阶段和效应阶段[1]。
起始阶段：在RNAi的起始阶段，加入的dsRNA首先进入细胞，在其胞质中的RNase Ⅲ家族中一种特异识别dsRNA 的RNA特异性核酸内切酶——Dicer酶，依赖ATP作用下被切割成19—23 核苷酸长度的具有双链结构的小干扰RNA small interfering RNAs，siRNAs)。
体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达
【摘要】目的: 筛选能高效抑制乳腺癌细胞株MCF 7和MDA MB 453端粒逆转录酶（hTERT）基因表达的RNA干扰靶点，为乳腺癌的基因治疗提供依据. 方法: 构建针对hTERT基因的三种siRNA(siRNA hTERT1, siRNA hTERT2和siRNA hTERT3)，分别转导入乳腺癌细胞株MCF 7和MDA MB 453，同时以无同源性的siRNA hTERT4作阴性对照，含GFP基因的载体作阳性对照. 应用实时聚合酶链反应（real time PCR）和Western Blot技术检测siRNA处理前后hTERT基因表达变化；MTT法检测细胞生长率；流式细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响. 结果: 与阴性对照组相比，siRNA hTERT1，siRNA hTERT2和siRNA hTERT3三个实验组siRNA转染细胞后，hTERT 的mRNA表达量下调至21%~40%，蛋白表达下降至50%，而三个实验组间差异无统计学意义（P>0.05）. 转染48 h 后，MCF 7细胞抑制率分别为(57±4.3)%，（61±4.3）%，（65±6.0）%；MDA MB 453细胞抑制率分别为（45±5.1）%，（45±4.1）%，（50±4.0）%. 流式细胞仪检测结果显示，细胞凋亡率有所增加，MCF 7细胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；MDA MB 453细胞为(12.25±0.17)%，（17.80±0.19）%，（20.60±0.21）%. 结论：经siRNA hTERT1，siRNA hTERT2，siRNA hTERT3处理均可明显抑制MCF 7和MDA MB 453乳腺癌细胞的增殖及hTERT基因的表达，能够明显促进细胞的凋亡.【关键词】乳腺肿瘤；端粒酶逆转录酶；RNA干扰0引言端粒逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是端粒酶组成的亚单位，与肿瘤的发生、发展密切相关［1-2］. 新近的研究［3-4］表明，应用小片段干扰RNA（siRNA）沉默或下调hTERT表达，可降低端粒酶的活性，缩短端粒，从而使肿瘤细胞的生长受到抑制［5-6］. 不同siRNA转染效率的不同以及靶向hTERT的不同，siRNA对端粒酶活性抑制的程度也有所不同［7］. 本研究拟通过设计多对靶向hTERT基因的siRNA，转导入不同的乳腺癌细胞株，筛选出具有特异性下调hTERT基因表达的siRNA，旨在为乳腺癌的基因治疗提供依据.1材料和方法1.1材料乳腺癌MCF 7和MDA MB 453细胞株(上海细胞生物研究所)；LipofectamineTM2000转染试剂，总RNA提取试剂Trizol，real time PCR试剂盒（大连TakaRa公司）；兔抗hTERT多克隆抗体，辣根酶标记羊抗兔IgG（美国Sigma公司）；CO2孵育箱（HEPA CLASS 100, 德国Thermo公司）；实时荧光定量(real time) PCR仪（Light Cycle，美国Roche公司）；流式细胞仪（EPICS XL，美国Coulter Beckma公司）；蛋白电泳和电转仪（VE 186，中国上海天能科技有限公司）.1.2方法1.2.1siRNA设计根据hTERT基因的DNA序列（GenBank accession NO.NM_198255.1）设计出互补的3对（siRNA hTERT1，siRNA hTERT2和siRNA hTERT3）siRNA序列［8］，siRNA hTERT4为无同源性的阴性对照序列. siRNA片段由广州锐博生物科技有限公司合成，其序列为：siRNA hTERT1正义链：5′ GGAGCAGCUGCGGCCCUCCdTdT 3′,反义链：5′ dTdTCCUCGUCGACGCCGGGAGG 3′；siRNA hTERT2正义链：5′ AAGAGGGCCGAGCGUCUCAdTdT 3′,反义链：5′ dTdTUUCUCC CGGCUCGCAGAGU 3′；siRNA hTERT3正义链：5′ UGAUUUCUUGUUGGUGACAdTdT 3′,反义链：5′ dTdTACUAAAGAACAACCACUGU 3′；siRNA hTERT4正义链：5′ GGCCTAGCTGCGCGAGU 3′,反义链：5′ GGCCTCAGCTGCGCGACGA 3′.1.2.2siRNA转染转染前1 d，换取新鲜培养液后调整密度为2×108个/L，待细胞生长至60%～80%融合时，将siRNA 脂质体混合物（100 μg/5 L）转染至细胞中，在37℃，50 mL/L CO2无血清、无抗素培养液培养16～18 h，换新鲜100 mL/L胎牛血清培养基，继续培养2～5 d后检测各指标. 实验分为空白对照组（不含转染试剂和siRNA）；阴性对照组（siRNA hTERT4处理）；阳性对照组（含GFP基因的载体处理）和三个实验组（siRNA hTERT1，siRNA hTERT2和siRNA hTERT3处理）.1.2.3siRNA hTERT转染乳腺癌细胞株后hTERT表达变化的检测1.2.3.1实时聚合酶链反应（real time PCR）分别收集各组转染后48 h的细胞，提取细胞总RNA，逆转录成cDNA. 取RT产物作为模板，进行real time PCR，检测hTERT 引物为：正义5′ CCGTCTGCGTGAGGAGA TC 3′, 反义5′ TCCGGTAGAAAAAGAGCCTGTT 3′；hTERT Taqman探针：5′（FAM） GGCCAAGTTCCTGCACTGGCTGACT （TAMARA）3′；GAPDH引物：正义5′ CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT 3′，反义5′ GTTGCTGTAGCCAAA TTCGTTGT 3′；GAPDH Taqman探针：5′（FAM） AACAGCGACACCCACTCCTCCACC（Eclipse） 3′. Real time PCR反应体系为20 μL，包括：2×Premix EX TagTM缓冲液10 μL,10 μmol/L上下游引物各0.4 μL,探针0.8 μL, cDNA 2 μL,加双蒸水补足至20 μL. 反应条件：95℃10 s预变性后，95℃ 5 s，60℃20 s，共40个循环，每个样本设三个平行反应. GAPDH作为内参对照校正上样量. 以2 (ΔΔCT) 方法计算hTERT mRNA的相对表达量.1.2.3.2免疫印迹（Western Blot）检测分别收集转染48 h后的各组细胞，用预冷的PBS 进行洗涤，加入蛋白裂解液进行裂解，提取总蛋白. 分别取50 μg蛋白，变性后经100 mL/L SDS PAGE分离，将凝胶置转移缓冲液中平衡15 min，再80 V 1.5 h湿转印蛋白到PVDF 上，100 mL/L FBS/TBST 4℃封闭过夜，加一抗，37℃震荡温育1 h, TBST漂洗3次，每次15 min，加HRP标记二抗，37℃震荡温育1 h, TBST漂洗3次，每次15 min. 取等量的ECL 发光试剂A，B液混匀后孵育硝酸纤维素膜，压曝光，以β actin为内参.1.2.4MTT法检测取对数生长期细胞，经2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含100 mL/L新生牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔3×103个细胞接种96孔培养板中，加入培养液200 μL，37℃，50 mL/L CO2培养箱培养. 次日进行瞬时转染，分别在转染后24,48,72,96 h进行检测. 检测时每孔中加入5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h，到达检测点时弃去培养液，再加入DMSO 200 μL，震荡10 min，于自动酶标仪492 nm波长处测定各孔吸光度（A）值. 按照公式计算细胞生长抑制率. 抑制率(%)=［(对照组A492 nm-实验组A492 nm) /对照组A492 nm］×100%.1.2.5细胞调亡的流式细胞术检测收集转染后48 h各组细胞，预冷PBS洗涤2次，用预冷的1×结合缓冲液重悬细胞，调整终密度为5×109个/L，将试管置于冰上，加5 μL的Annexin V FITC溶液和2.5 μL的碘化丙啶（propidium iodide, PI ）至100 μL的细胞悬液中，避光孵育10 min后，加入400 μL冰预冷的1×结合缓冲液，30 min内用流式细胞仪进行检测，分析各组细胞的凋亡情况.统计学处理：采用SPSS11.0统计分析软件，细胞增殖实验中各处理组与对照组进行配对t检验，各实验组间进行F检验. P<0.05为差异具有统计学意义.2结果2.1siRNA转染后绿荧光蛋白的表达倒置显微镜明视野下，阴性对照组和阳性对照组细胞生长正常，形态无明显变化；倒置荧光显微镜暗视野下，阳性对照组的部分细胞胞内呈现绿色（图1）.A,C: 转染含GFP基因的载体后MCF 7和MDA MB 453细胞表达绿荧光蛋白; B,D: 明视野下MCF 7和MDA MB 453细胞的生长形态.图1倒置荧光显微镜下MCF 7和MDA MB 453细胞的绿荧光蛋白表达×4002.2转染后细胞hTERT表达的变化以阴性对照组原始模板的相对浓度为标准，经siRNA hTERT1，2和3转染后，hTERT mRNA的相对表达量，MCF 7细胞分别为：35%，30%，31%；MDA MB 453细胞分别为36%，33%，21%，siRNA hTERT1，2和3三个实验组间进行H检验，组间差异无统计学意义（P=0.368，P>0.05）. Western Blot检测结果显示，siRNA hTERT1，2和3三个实验组蛋白表达明显降低(P=0.00)，与阴性对照组相比较，三组间差异无统计学意义（P=0.223，P>0.05，图2）. 经siRNA hTERT1，2，3和4处理后，hTERT蛋白条带灰度MCF 7细胞分别为35%，25%，24%，76%；MDA MB 453细胞分别29%，23%，29%，70%.2.3转染后细胞增殖的变化48 h后siRNA hTERT1，2和3三个实验组和阴性对照组对MCF 7细胞的抑制率分别为(57±4.3)%,（61±4.3）%,（65±6.0）%,（5.3±3.5）%；对MDA MB 453细胞的抑制率分别为（45±5.1）%,（45±4.1）%,（50±4.0）%,(6.7±3.6)%. 配对t检验分析果显示，siRNA hTERT1，2和3三个实验组对MCF 7细胞的生长抑制明显高于阴性对照组（P=0.023，0.016，0.028）；对MDA MB 453细胞的生长抑制也明显高于阴性对照组（P=0.024，0.018，0.027），但三个实验组间的变化不明显（P=0.075, 0.085）.2.4基因沉默对细胞凋亡的影响siRNA hTERT1，2和3转染MCF 7和MDA MB 453细胞48 h后，流式双标记检测结果显示，与阴性对照组相比较，Annexin 单染和Annexin V/PI双染阳性细胞明显增加（F=124，P=0.00，图3）. 其中，siRNA hTERT1，2和3三个实验组Annexin 单染的细胞凋亡率MCF 7细胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；MDA MB 453细胞为(12.25±0.17)%,（17.80±0.19）%,（20.60±0.21）%.3讨论目前用针对疾病相关基因的siRNA进行基因治疗已取得了一定的进展，已有几种RNA 技术新药进入临床实验，但尚未应用于肿瘤治疗. 有研究［9］发现hTERT基因在乳腺癌发生发展中起重要作用，目前有关抑制hTERT表达的研究多采用一种siRNA作用于某一种肿瘤细胞. 本实验设计三种靶向乳腺癌细胞株hTERT基因的siRNA，研究目的基因下调对细A,B: MCF 7细胞的阴性对照组和siRNA hTERT1组; C,D: MDA MB 453细胞的阴性对照组和siRNA hTERT1组. siRNA hTERT2和3组与siRNA hTERT1组相似. 图中左上象限: Annexin V/PI双染区; 右下象限为Annexin单染区. PI: 碘化丙啶; Annexin V: 磷脂结合蛋白V.胞生长的影响，结果显示，三种siRNA都可下调hTERT基因表达，使MCF 7和MDA MB 453两种乳腺癌细胞株的生长受到抑制. 但不同的siRNA对同一基因的沉默效果存在差异，因此，在靶向基因hTERT的siRNA选择和设计时，我们选择hTERT基因外显子不同区域、不同碱基含量的3对长度为19 bp的siRNA片段，探讨不同靶点RNA干扰效果的差异，转染结果表明，siRNA hTERT1，2和3三个实验组和对照组hTERT基因表达几乎无变化，siRNA hTERT1，2和3三种siRNA hTERT处理后hTERT的mRNA和蛋白表达均明显下调. 同时，采用siRNA转染来源不同的乳腺癌细胞株后，无论是MCF 7还是MDA MB 453细胞株，经siRNA hTERT1，2和3三种siRNA处理后，细胞增殖均受抑制，48 h后出现不同程度的调亡，这提示siRNA hTERT1，2和3三种siRNA可较好的作用于不同来源的乳腺癌细胞，为RNA干扰药物应用于乳腺癌治疗奠定了基础.综上所述，本研究利用RNAi技术筛选出3对siRNA，均可特异性下调乳腺癌细胞株hTERT基因的表达；导入MCF 7和MDA MB 453两种乳腺癌细胞株后，可明显抑制肿瘤细胞的增殖，使部分细胞发生调亡，这为乳腺癌基因治疗的临床研究提供了依据.参考文献：1 金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮158例疗效观察[J];广东医学;1997年10期2 董新亭,李卫莉,马秀华;自拟粉刺消治疗痤疮126例[J];中国中医药科技;1999年06期3 查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会[J];江西中医药;/xyfm/class/.2002年05期4 张怀亮,谭正辉,孙叶梅,李梅,俞玉芳,韩峰;3003例痤疮患者特征分析与控制对策[J];中华医学美学美容杂志;/xyfm/class/.2002年06期5 刘勇,王冬梅;痤疮的药物治疗[J];临床医药实践杂志;2003年09期6 高宜云;痤疮从肝论治[J];中医药临床杂志;2004年03期7 欧其平,林维山;中西医结合治疗痤疮[J];中华皮肤科杂志;2004年09期8 陈五一;;痤疮辨治体会[J];世界中医药;/yisheng/main/index.php.2007年03期9 雷放;中药热敷治疗痤疮有效[J];新中医;/book/main/index.php.1992年09期10 李东华;异维生素A酸治疗痤疮[J]; /新医学;1993年10期11 黄灿奇;针刺联合中药内服外敷治疗青少年痤疮临床观察[D];南方医科大学;2011年12 陈志彬;中医综合疗法对女性痤疮患者皮肤生理指标影响研究[D];广州中医药大学;2011年13 陈传伟;针刺干预慢性疲劳综合征的临床及作用机理研究[D];广州中医药大学;2010年14 Hamid Abdi;针刺对伊朗肥胖者的体重及抗热休克蛋白27、60、65、70的影响[D];北京中医药大学;/book/main/index.php.2010年15 陈玉骐;背俞穴刺络放血治疗痤疮的临床研究[D];广州中医药大学;2009年16 张俊海;电针镇痛的脑功能磁共振初步研究[D];复旦大学;2005年17 庞莹;痤疮的流行病学及与雄激素受体基因多态性的相关研究[D];中国医科大学;2008年18 申鹏飞;“醒脑开窍”针刺方法治疗卒中后抑郁症基础与临床疗效及治疗机制研究[D];天津中医学院;/qikan/class/?150.html.2004年19 姜文;针刺干预脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经细胞[Ca～（2+）]i变化的信号传导机制的实验研究[D];天津中医学院;2005年20 李秀玉;赵冠英教授治疗痤疮研究及学术思想概述[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年[6]佚名.杨明峰体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达.中医药期刊学会/jiaoan/html/?951.html。
ADR的耐药性的开题报告
使用hTERT启动子联合RNAi靶向逆转乳腺癌MCF-7/ADR的耐药性的开题报告一、背景及研究目的乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一，化疗是其主要治疗方式之一。
然而，乳腺癌患者中耐药性的存在给化疗带来了极大的挑战。
因此，研究如何解决耐药性的问题是非常重要的。
在一系列的体内外研究中，Telomerase reverse transcriptase (hTERT)启动子的增强活性已被证明在癌细胞中高表达。
同时，hTERT启动子也是一个适合于癌症治疗的潜在经典和新兴的靶标。
因此，我们选择利用hTERT启动子联合RNAi靶向逆转乳腺癌MCF-7/ADR的耐药性。
本研究的目的是通过hTERT启动子联合RNAi技术调控耐药性相关基因的表达，增强化疗对MCF-7/ADR细胞的敏感性，为进一步研究乳腺癌耐药性的克服提供理论和实验基础。
二、研究方法1. 构建hTERT启动子联合RNAi质粒设计具有目的性的hTERT启动子相关siRNA，克隆到质粒中，转染到MCF-7/ADR细胞中。
检测表达的RNA干扰效果。
2. 检测获得细胞的hTERT启动子的高表达和RNAi技术的效果通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测获得细胞的hTERT 启动子的高表达和RNAi技术对耐药相关基因的干扰效果。
3. 药物敏感性测定MTT法检测MCF-7/ADR细胞对多种抗肿瘤药物的敏感性变化，评估hTERT启动子联合RNAi技术对其敏感性的影响。
4. 流式细胞术使用荧光型Annexin-v / PI双染色液进行细胞凋亡分析，探讨hTERT启动子联合RNAi技术对MCF-7/ADR细胞凋亡的影响。
三、预期结果及意义我们预计hTERT启动子联合RNAi技术可以调控耐药性相关基因的表达，促进化疗对MCF-7/ADR细胞的敏感性，并且可以诱导细胞凋亡。
此外，本研究结果为进一步研究乳腺癌耐药性的克服提供了新思路和实验基础。
RNAi沉默hTERT对HeLa细胞生长的影响的开题报告
RNAi沉默hTERT对HeLa细胞生长的影响的开题报告1. 研究背景和意义：Telomerase是一种包含TERT和TR（telomerase RNA）的重要酶，它能够延长染色体末端的端粒，维持染色体的稳定性。
在正常的情况下，大多数细胞在分裂后会逐渐缩短端粒，导致染色体的不稳定性和细胞死亡。
然而，在癌细胞中，TERT基因的活化机制使得它一直保持高水平的表达，从而使得该细胞的端粒不会缩短，从而保持其无限增殖的能力。
RNAi（RNA interference）技术是一种可以选择性地靶向TERT mRNA降解并沉默其表达的技术，因此被广泛应用于抗癌治疗。
因为RNAi技术可以靶向高表达的TERT，从而抑制癌细胞的生长和增殖。
因此，本文旨在通过沉默人类hTERT基因，探索RNAi技术对HeLa细胞生长的影响，为开发新型的癌症治疗方法提供理论基础。
2. 研究内容和方法：本研究将使用RNAi技术沉默hTERT基因，并通过比较实验组（靶向hTERT基因的siRNA）和对照组（未处理的HeLa细胞）之间的生长曲线和细胞增殖能力，评估RNAi 技术对HeLa细胞生长的影响。
实验将使用以下步骤进行：（1）设计靶向hTERT mRNA的siRNA；（2）转染HeLa细胞，使其表达siRNA；（3）使用Western Blot等方法检测细胞中的hTERT表达；（4）检测实验组和对照组之间的生长曲线和增殖能力差异。
3. 预期结果和意义：预计我们的实验可以证明RNAi技术可以靶向hTERT mRNA，可以成功地沉默hTERT 基因，并抑制HeLa细胞的生长和增殖能力。
这一结果有助于为开发新型的靶向癌症治疗药物提供理论基础，并为癌症治疗的个性化治疗提供参考。
RNAi沉默NRP-1基因对乳腺癌细胞生物学行为影响的实验研究的开题报告
RNAi沉默NRP-1基因对乳腺癌细胞生物学行为影响的实验研究的开题报告一、研究背景乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围不断增高。
近年来，随着分子生物学和基因技术的发展，人们逐渐认识到乳腺癌发生的分子机制和细胞信号转导途径上的调节因子，如NRP-1基因在乳腺癌细胞系中表达明显增强并与肿瘤细胞的侵袭性密切相关，这表明NRP-1在乳腺癌的发生和发展中可能具有重要作用。
RNA干扰技术已被广泛应用于抑制基因表达及研究基因功能，因此，利用RNAi技术靶向干扰NRP-1基因的表达水平，可以进一步探究其对乳腺癌细胞生物学行为的影响。
二、研究目的本研究旨在利用RNAi技术抑制乳腺癌细胞中NRP-1基因的表达水平，探究其对肿瘤细胞增殖、移动和侵袭等生物学行为的影响，进一步揭示NRP-1在乳腺癌发生和发展中的作用机制，为乳腺癌的防治提供新的治疗靶点。
三、研究方案1. 细胞培养及RNAi干扰选取乳腺癌细胞系MCF7进行实验，将细胞培养于无血清DMEM培养基中，并分为实验组和对照组，实验组进行NRP-1基因的RNAi干扰，对照组进行非靶向的RNAi干扰。
2. 检测NRP-1基因表达水平利用PCR和Western blotting技术分别检测干扰后MCF7细胞中NRP-1 mRNA和蛋白表达水平的变化。
3. 细胞增殖实验采用MTT法检测NRP-1靶向干扰对MCF7细胞增殖的影响。
4. 细胞迁移实验通过Transwell小室实验测定NRP-1靶向干扰对MCF7细胞迁移的影响。
5. 细胞侵袭实验通过Boyden小室实验测定NRP-1靶向干扰对MCF7细胞侵袭的影响。
四、研究意义该研究系统地探究了NRP-1对乳腺癌细胞生物学行为的影响，为进一步深入研究乳腺癌的发生和发展机制提供了重要的实验资料和理论基础，并为开发乳腺癌的靶向治疗提供新思路和理论基础。
RNAi沉默HAS2基因对乳腺癌细胞生物学活性的影响及机制研究的开题报告
RNAi沉默HAS2基因对乳腺癌细胞生物学活性的影响及机制研究的开题报告一、研究背景和意义乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，而HAS2基因编码的加硫酸化酶是合成乳腺基质中透明质酸（hyaluronan）的关键酶，透明质酸可以促进乳腺肿瘤的生长和转移，因此HAS2基因作为乳腺癌治疗的靶点备受关注。
RNA干扰（RNAi）是一种常用的研究基因功能的方法，该方法可以通过介导siRNA靶向切割mRNA来降低目标基因的表达。
研究沉默HAS2基因对乳腺癌细胞生物学活性的影响及其机制，有助于深入探究HAS2基因在乳腺癌发生发展中的作用，为乳腺癌的治疗提供新的思路和策略。
二、研究目的本研究旨在构建HAS2-siRNA质粒，转染到乳腺癌MDA-MB-231细胞中，观察HAS2基因沉默对肿瘤细胞生长、增殖、迁移和侵袭能力的影响，同时探讨沉默HAS2基因对细胞周期、凋亡、胶原分解酶（MMPs）表达和透明质酸合成的影响，并进一步阐述其机制。
三、研究内容和方法1.构建HAS2-siRNA质粒：根据HAS2基因序列设计寡核苷酸siRNA，利用PCR扩增HAS2-siRNA序列，然后克隆进入靶向表达载体pSilencer 4.1-CMV-puro中，通过测序确认HAS2-siRNA质粒的正确性。
2.细胞培养及转染：MDA-MB-231细胞株在RPMI1640培养基中培养，达到80%的密度后，使用脂质体介导法将HAS2-siRNA质粒转染至细胞中，设立空白对照组和质粒转染对照组。
3.细胞增殖实验：采用MTT法检测细胞增殖能力。
4.细胞周期实验：利用PI流式细胞仪分析HAS2基因沉默对细胞周期的影响。
5.细胞凋亡实验：采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。
6.Matrigel侵袭实验：设立一个24孔Transwell器皿，滤器上配有一层Matrigel，观察细胞的侵袭能力。
7.胶原分解酶表达实验：Western blot法检测MMPs的表达。
RNA干涉抑制hTERT对人脑胶质瘤细胞生长影响及机制研究的开题报告
RNA干涉抑制hTERT对人脑胶质瘤细胞生长影响及机制
研究的开题报告
一、选题背景与意义：
人脑胶质瘤是一种恶性肿瘤，治疗难度大，并且容易复发。
目前，对于脑胶质瘤的治
疗手段主要是手术切除、放疗和化疗，但有效的治疗方法依然尚未找到。
研究表明，hTERT是绝大多数人类肿瘤细胞中都存在的酶，它与肿瘤的形成、生长以及转移等过
程密切相关，因此将其作为肿瘤治疗的靶点之一，已成为一个热点研究领域。
RNA干
涉技术是针对hTERT进行沉默的一种有效手段，已有许多研究报告显示，通过RNA干涉技术来抑制hTERT的表达可以显著抑制肿瘤细胞的生长，因此，本文旨在探究RNA 干涉技术对hTERT在人脑胶质瘤细胞生长中的调节作用及其机制。
二、研究内容及方法：
1. 体外实验：选取人脑胶质瘤细胞系（如U87、U251等）进行实验，采用RNA干涉
技术，将shRNA-hTERT转染到细胞中，通过CCK-8法检测干涉后细胞的增殖情况，
流式细胞术检测细胞周期的变化情况，Western blot或RT-PCR法检测hTERT的表达
情况。
2. 体内实验：选取同种细胞系，将转染后的细胞注射到裸鼠体内，观察肿瘤生长情况，比较裸鼠肿瘤生长量的差异。
三、预期结果和意义：
通过RNA干涉技术抑制hTERT在人脑胶质瘤细胞中的表达，可以显著抑制细胞的增殖和肿瘤的生长。
同时，在体内实验中，RNA干涉技术也可以减少肿瘤的生长量。
这为
我们探索hTERT在脑胶质瘤中的作用机制提供了一定的依据，为开发脑胶质瘤的治疗手段提供了理论基础。
RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达
RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达【摘要】构建含表皮生长因子受体2基因(HER2)的短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒,体外观察对人乳腺癌细胞SKBr3的HER2 mRNA及蛋白表达的影响。
方法利用分子克隆技术,将含HER2的双链DNA,与经双酶切后的载体pSilencer连接,构建重组质粒,在脂质体的介导下转染高表达HER2的乳腺癌细胞系SKBr3。
分析HER2 mRNA的表达,Western blot检测蛋白的表达,MTT法测定细胞增殖情况。
结果酶切鉴定证实重组质粒构建成功,转染后能明显抑制HER2 mRNA及蛋白的表达,抑制细胞的增殖。
结论构建的重组质粒能有效地降低人乳腺癌细胞HER2的表达,抑制细胞的增殖,为HER2高表达预后不良的乳腺癌基因治疗提供新策略。
【关键词】 RNA干扰受体表皮生长因子乳腺肿瘤瘤细胞培养的基因表达表皮生长因子受体2(HER2)在包括乳腺癌在内的多种上皮源性肿瘤中过度表达,与乳腺癌的发生、发展、预后等关系密切[1],是极具发展前途的基因治疗靶位。
约有30％乳腺癌患者伴随有HER2及其基因产物的过表达,HER2过表达是乳腺癌病人不良预后的重要标记物。
RNA干扰是近年来发展起来的基因阻断技术,它通过将双链NA)导入细胞后,在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),与该段RNA同源mRNA产生特异性降解,从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象。
笔者采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人乳腺癌细胞株SKBr3细胞HER2的表达,探讨利用质粒表达载体体内合成siRNA的方法能否有效介导肿瘤细胞出现RNAi，从而为乳腺癌的基因治疗提供新策略。
1材料和方法材料细胞株SKBr3细胞(人乳腺癌细胞株，湖南远泰生物技术有限公司)。
主要试剂逆转录酶、TaqDNA聚合酶(立陶宛MBI公司);质粒美国Ambion公司);限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ和T4DNA连接酶、100 bp DNA ladder(大连宝生物技术公司);RMPI 1640培养基、Trizol 和Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);MTT(美国Sigma公司);鼠抗人HER2单克隆抗体(美国R&D公司);TMB Western Blot 试剂盒(美国KPL公司)。
RNA干扰治疗策略对乳腺癌激素受体阳性的抑制效果
RNA干扰治疗策略对乳腺癌激素受体阳性的抑制效果乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，对女性健康造成了严重威胁。
激素受体阳性乳腺癌占据乳腺癌的一大比例，其治疗相对复杂且具有一定的挑战性。
幸运的是，近年来，RNA干扰治疗策略被广泛应用于乳腺癌的研究和治疗中，并显示出了与传统治疗相比优越的效果。
本文将探讨RNA干扰治疗策略对乳腺癌激素受体阳性的抑制效果，以及其在临床上的潜在应用前景。
乳腺癌的发生与多种因素相关，其中激素受体阳性乳腺癌是最常见的亚型。
这类乳腺癌具有激素受体（雌激素受体和/或孕激素受体）的高表达水平，从而依赖于激素的信号传导通路来促进癌细胞增殖。
传统的治疗方法包括内分泌治疗、化疗和手术切除等，但这些治疗方法存在一定的副作用，且患者对这些治疗方法的响应也存在差异。
因此，研究人员开始寻找新的治疗策略，以提高患者的治疗效果和生存率。
RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种具有高度特异性的基因沉默技术，可以精确地抑制靶基因的表达。
在RNAi中，通过引入小分子RNA（siRNA或miRNA）来诱导RNA介导的靶向降解或翻译抑制，从而实现对靶基因的抑制。
近年来，RNA干扰治疗在乳腺癌中得到了广泛的关注和研究。
对于激素受体阳性乳腺癌，研究人员已经发现多个与其相关的靶基因，并通过RNA干扰技术对这些基因进行了抑制。
其中，ER（雌激素受体）是激素受体阳性乳腺癌中最重要的靶基因之一。
ER的高表达促进了乳腺癌细胞的增殖和转移，并与乳腺癌的预后密切相关。
通过RNA干扰抑制ER的表达，可以明显降低癌细胞的增殖率、促进细胞凋亡，并抑制肿瘤在体内的生长。
此外，ER阳性乳腺癌通常会伴随着细胞周期调节因子的异常表达。
细胞周期调节因子是控制细胞周期进行的一系列蛋白质，如Cyclin D1、CDK4和p21等。
RNA干扰技术已经成功地应用于这些靶基因的抑制。
研究结果表明，RNA干扰抑制细胞周期调节因子的表达会导致乳腺癌细胞的周期阻滞，从而抑制癌细胞的增殖和转移。
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中华乳腺病杂志（ 电子版 ）２０ 年 １ 第 １ 试刊 Ｃ ｉ Ｂｅｓ Ｄｓ Ｅｅｔ ｎｃ ｅ ｉ ）Ｊｎａｙ （７ Ｎ ． Ｏ７ 月 期 ｈｎＪ ｒａｔ ｉ ｌ ｒ ｉ Ｖ ｒｏ ， ｕｒ ２ ，Ｏ １ （ ｃｏ ｓ ｎ ａ Ｄ
・ ９・ ３
实 验 研 究
Ｒ Ａ 抑 制 ｈ Ｅ Ｔ基 因 Ｎ ｉ Ｔ Ｒ
曾晓华 刘 长安 邓 建Ｊ
腺 癌 的 实 验 研 究
【 摘要 】 目的 利用 ｓ Ｎ ｉ Ａ在乳腺癌细胞 内诱导 Ｒ Ａ ， Ｒ Ｎ ｉ抑制 ｈ Ｅ Ｔ基 因表 达 ， ＴＲ 在体外细胞水平
探讨 Ｒ Ａ 对乳腺癌治疗 的可行性 。方 法 Ｎｉ 构建 靶 向 ｈ Ｅ Ｔ基 因 的 ｓ Ｎ ｈ Ｅ Ｔｓ Ｎ ， 导入 ＴＲ ｉ Ａ（ Ｔ Ｒ －Ｒ Ａ） 转 Ｒ ｉ ｈＥ Ｔｓ Ｎ Ｔ Ｒ —ｉ Ａ对乳腺 癌细胞 生长 Ｒ
ｐ ｅ ｓ ｎ ａ ｔｒ ｔ ｎ ｎ ｕ ｒｃ ｌ ｐ ｏｉ ｒｔ ｎ ｉ ｏ ｈ ｈ Ｅ － ｉ ｒ ｓ ｉ ｌ ａｉ ｓａ ｄ ｔ ｍｏ ｅｌ ｒ ｌ ｅ ａｉ ｎ ｂ ｔ Ｔ ＲＴ ｓＲＮＡ ｔ ａｍｅ ｔ ｒ ｕ ｓａ ｄ ｃ ｎ ｒ ｌ ｏ ｐ ｙ ｏ ｅ ｏ ｆ ｏ ｒ ｔ ｎ ｏ ｐ ｎ ｏ ｔ ｕ ｓｂ ｅ ｇ ｏｇ ｒ Ｍ１ｒ ａ ｓ ｙ Ｔ ｓａ ．ＲＴ Ｐ Ｒ ｎ ｅ ｔｒ ｌ ｔ — Ｃ ａ ｄ Ｗ ｓｅ ｎ ｂ ｏ ．Ｒｅ ｕ ｔ Ｔ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆ Ｔ ｓ ｌｓ ｈ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｏ ＥＲＴ ｈ ｄ ｂ ｅ ｂ ｉｕ ｌ ｈｂ ｔｄ ｂ ｈ ａ ｅ ｎ ｏ ｖｏ ｓｙ ｉ ｉ ｉ ｙ ｎ ｅ ｓＲＮ ｉ Ａ．Ｔ ｅ ｉ ｈｂ ｔ ｎ ｒ ｔ ｆｃ ｌ ｐ ｏ ｉ ｒ ｔ ｎ ｗａ ３ ． Ｔ ｅ ｍＲ ｅ ｅ ｆ ｈ ＥＲ ｓ ｏ ｖｏ ｓｙ ｄ — ｈ ｎ ｉ ｉ ｏ ａｅ ｏ ｅ ｌ ｒｌ ｅａ ｉ ｓ ４ ％ ｉ ｆ ｏ ｈ ＮＡ ｌｖ ｌｏ Ｔ Ｔ ｗａ ｂ ｉｕ ｌ ｅ ｃ ｅ ｓ ｄ．ａ ｄ ｉ ｒ ｔｉ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｒ ｄ ｃ ｄ ｂ ９ ８ ．Ｃｏ ｃ ｕ ｉ ｎ ｓＲＮＡ— Ｔ Ｔ ｅｆｃ ｉｅｙ ｉ ｈｂ ｔ ｄ ｒａ ｅ ｎ ｔ ｐ ｏｅ ｎ ｅ ｐ ｅ ｓ ｅ ｕ ｅ ｙ ３ ． ％ ｓ ｏ ｎ ｌ ｓｏ ｓ ｉ ｈ ＥＲ ｆ ｔ ｌ ｎ ｉ ｉ ｅ ｖ ｅ
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乳 腺 癌 ＭＣ 一 Ｆ７细胞 ， 瘤 细 胞 内诱 导 Ｒ Ａ ， 用 细 胞 增 殖 抑 制 实 验 、 ＴＰ Ｒ 法 、 ｓ ｒ ｌ 等 技 术 在 Ｎ ｉ采 Ｒ —Ｃ Ｗｅｔ ｎｂｏ ｅ ｔ
检测 ｓ Ｎ ｉ Ａ处理前后瘤 细胞增殖及 ｈ Ｅ Ｔ基 因表达 变化 。结 果 Ｒ ＴＲ 外 明显抑制 了乳腺癌细胞 中 ｈ Ｅ Ｔ基因 的表达和瘤细胞增殖 。 ＴＲ
ｗｅ ｕ ｉ ｚ ｄ ＲＮＡｉ ｏ ｉ ｈ ｂｔｈ Ｅ ｅ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｎ ＭＣ － ｅｌ ｏ ｒａ ｔ ａ ｃ ｒ ｔ ｉｅ ｌ ｉ ｉ Ｔ ＲＴ ｇ ｎ ｘ ｒ ｓｉ ｎ ｉ Ｆ ７ ｃ ｌ ｆ ｅ ｓ ｎ ｅ ．Ｍ ｅｈ ｄ Ｓ ｌ ｉ ｔｒ ｔ ｎ ｓ ｂ ｃ ｔｏ ｓ ｍａｌ ｎ ｅ —
Hale Waihona Puke 抑制率达 ４ ％ ；Ｔ Ｒ ３ ｈ Ｅ Ｔ基 因的 ｍＲ Ａ表达 明显 降低 ， 白表达平 均下调 了 ３ ． ％。结论 ｓ Ｎ Ｎ 蛋 ９８ ｉ Ａ在 体 Ｒ
【 关键词 】 Ｒ Ａ ； Ｎ ｉ 乳腺癌 ；ｈ Ｅ Ｔ ＴＲ 【 中图法分类号 】 Ｒ ３ ． ７７９
Ｅｘ ｒｍ ｅ ａ ｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ａｒ ｔｎｇ ｈＴＥＲＴ ｅ ｎｈｉ ｔ ｄ ｉ ｅ ｔｃ ｎｃ ｒ ｔ ｒ ｐｙ ｐｅ ｉ ｎｔ ｌｒ ｓ ａ ｃ ｆｔ ｇｅ ｉ ｇ ｎｅ ｉ ｂｉｅ ｎ ｂｒ ａｓ ａ ｅ ｈｅ ａ ｂｙ ＲＮ Ａ ｎｔ ｒ ｅ － ｉ ｅ ｆ ｒ
治 疗 而 孑
【 文献标识码 】 Ａ
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