表皮生长因子对口腔溃疡愈合的促进作用及机理探讨

表皮生长因子对口腔溃疡愈合的促进作用及机理探讨*
杨海玲 孙 正 刘晓勇 王凤光 汪育苗
摘 要 目的:观察表皮生长因子对口腔溃疡的促愈合作用及其受体在溃疡愈合过程中的表达变化 方法:金黄地鼠125只随机分成3组,实验组采用EGF,对照组采用生理盐水局部喷涂,以正常动物组作为基线对照。

观察溃疡愈合天数、溃疡面积变化及局部组织EGFR 的表达改变。

结果:实验组EGF 可有效促进溃疡愈合,创面愈合率显著高于对照组;并且局部新生组织EG FR 表达显著高于对照组,至溃疡愈合时恢复至正常动物水平 结论:EGF 可通过刺激局部组织EGFR 的表达从而促进口腔溃疡愈合。

关键词 表皮生长因子; 口腔溃疡; 药物治疗
中图号 R781.51 文献标识码 A 文章编号 1006 673X(2004)02 0070 03
THE MECHANISM OF ORAL ULC ER HEALING AC CELERATION BY EPIDERMAL GROWTH FAC TOR YA NG Hai ling et al.Faculty o f Stomatology ,Capital U niversity of M edical Sciences,Beijing 100050
ABSTRAC T Objective:T he purpose o f t he study was to observe the effect of EGF for treatment of or al ulcer and the expression of EGFR in the duration of ulcer healing.Methods:One hundred and twenty seven golden hamster w er e div ided into three groups:EGF group (EGF applied for local treatment);N S group (N S applied);control group (animals without treatment).T he ulcer heal ing time,chang es of ulcer area and the ex pression o f EGFR in healing tissues were investigated.Results:EGF tr eatment effectively ac celer ated the oral ulcer healing time.T he healing rate o f the EGF g roup w as hig her than that of N S g roup.T he expression of EGFR in ulcer tissue of EGF group show ed significantly more intense than in N S group dur ing t he healing process and returned to t he lev el of normal animals in t he end of healing.Conclusion:EGF can accelerate oral ulcer healing by stimulating EGF R ex pr ession.
KEY WORDS Epidermal grow th factor (EGF); Or al ulcer ; T reatment
*北京市中医局资助项目
作者单位:(100050)首都医科大学口腔医学院 牙周黏膜科 病理科
联系作者:孙 正,T el:(010)67012781
表皮生长因子(Epidermal Grow th Factor,EGF)是最早报道的一类多肽生长因子,对多种细胞都具有促增殖作用。

目前,EGF 已广泛应用于多种创伤的治疗以促进创面愈合。

EGF 喷雾剂也已应用于口腔粘膜糜烂病损治疗,并取得良好的治疗效果,但EGF 在促进口腔粘膜愈合方面的机制却未见报道。

特别是口腔粘膜有其自身生理特点,了解口腔粘膜在应用EGF 时局部组织表皮生长因子受体(Epider mal Grow th Factor Receptor,EGFR)表达的变化规律,可为临床应用提供理论依据。

材 料 与 方 法
1 实验动物:叙利亚金黄地鼠(北京生物制品研究所提供)125只,6~8周龄,雌雄各半,体重80
~100g 。

随机分为3组,实验组60只,生理盐水对照组60只,健康对照组5只。

2 材料:EGF(河北华大生物制品有限公司,批号990420);S P 超敏试剂盒(华生原试剂公司)。

3 实验方法
3 1 溃疡模型制造:在各组金黄地鼠的舌背部剪去直径约6mm 的上皮组织,造成创伤性溃疡,深约1mm 。

第2天创面有黄白色伪膜覆盖,形成溃疡面,周围粘膜充血水肿。

正常动物不予处理。

3 2 药物治疗:实验组应用1 g/ml EGF 生理盐水治疗,140 l/喷,每天3次;对照组给与生理盐水;正常动物组不予药物处理。

3 3 临床观察:致创次日起,每日观察地鼠舌背创面愈合情况;捏住地鼠颈部使其舌体自然前伸,用透明玻璃纸轻压溃疡表面,描记溃疡面积;记录溃疡深度、水肿、充血、伪膜等情况。

3 4 组织学检查:治疗开始后第1、3、5、7、10、14天随机处死实验组和对照组各10只,第1天处死对照组5只,切取标本,4%多聚甲醛固定72h,常规切片、H E 染色,EGFR 免疫组化染色:微波修复抗
原92 ,10min,以PBS代替一抗作为阴性对照,按S P超敏试剂使用说明进行染色。

3 5 EGFR阳性细胞评价标准:在实验组与对照组动物的创缘上皮和溃疡底部各随机选取5个高倍视野( 400),在正常动物的上皮层和结缔组织层也各随机选取5个高倍视野( 400),均以胞膜和胞浆呈棕黄色者为阳性细胞,应用彩色病理图像分析系统计数阳性细胞百分率。

3 6 结果计算
3 6 1 临床观察结果: 以肉眼观察上皮完全覆盖创面为愈合标准,计算两组愈合时间进行t检验。

对两组在第1、3、5、7、10、14天创面愈合率统计分析。

创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积。

3 6 2 对正常组、对照组与实验组第1、3、5、7、10、14天溃疡组织上皮层、结蒂组织层的EGFR 表达阳性细胞百分率作单因素方差分析。

结 果
1 实验组平均愈合时间显著低于对照组(8 67 9 38,P<0 05),并且创面愈合率在第5天即达到55%,至第7天愈合面积达87%,而对照组在第5天时创面愈合率仅有38%,说明EGF可促进创伤性溃疡早期愈合(见表1)。

2 免疫组化染色显示,在创伤早期实验组邻近创面的上皮细胞内可见EGFR强染棕黄色颗粒;对照组创面上皮细胞内仅有弱阳性或少量阳性颗粒,两组的溃疡底部和周缘的结缔组织内的成纤维细胞EGFR开始表达阳性。

至愈合中期可见上皮细胞和成纤维细胞胞浆、胞膜EGFR强阳性表达,肉芽组织形成。

至后期时,上皮全层细胞EGFR强阳性表达,创面再上皮化达到最高峰。

随后开始组织重塑阶段,仅有部分基底细胞呈局灶性表达EGFR。

3 表2可见,首先两组动物在创面局部的EGFR表达规律基本相似,均在创伤早期低于正常健康动物,随后EGFR表达逐渐增强,至第10天达峰值,第14天恢复至正常水平。

实验组上皮层在第5天时即高于对照组并持续至第10天(P<0 05);但结缔组织层两组EGFR表达无差异。

讨 论
众所周知,口腔粘膜软组织较皮肤组织更新代谢速率快,这与唾液中含有大量的EGF有重要关系。

对口腔上皮细胞培养发现,生理浓度的EGF(1 10ng/ml)不仅可促进细胞DNA合成还可通过不同的信号转导途径促进细胞趋化迁移[1],Greory等[2]
表1 治疗前后溃疡愈合率变化( x s)
第1天第3天第5天第7天第10天
动物数(只)6050403020
实验组-0 10 0 230 21 0 180 55 0 130 87 0 101 00 0 01对照组-0 25 0 88-0 05 0 640 38 0 490 79 0 210 99 0 04 t值1 212 74*2 16*2 16*1 45
*P<0 05
表2 EGFR在创伤性溃疡上皮层与结缔组织层表达比较( x s)
D1D3D5D7D10D14 EP CT EP CT EP CT EP CT EP CT EP CT
实验组0 24
0 02
0 22
0 13
0 32
0 10
0 16
0 08
0 44
0 05*
0 24
0 09
0 51
0 09*#
0 38
0 16*
0 69
0 09*#
0 36
0 14*
0 36
0 08
0 17
0 07
对照组0 33
0 10
0 09
0 04
0 32
0 08
0 24
0 11
0 35
0 09
0 23
0 10
0 42
0 08
0 29
0 13
0 54
0 17#
0 29
0 08#
0 35
0 15
0 15
0 10
正常组0 34
0 09
0 14
0 08
F值1 8751 9940 8692 2253 5481 8374 5674 8349 4415 9500 1170 131 经单因素方差分析和组间比较,*示与N S组相比P<0 05;#示与正常动物相比P<0 05
报道当拔除阻生齿及口腔或口周术后,唾液中可有EGF的爆发性释放,这可能是口内及口周外伤后促进创伤愈合的一种自然反应。

并且唾液中的EGF 还可调控口腔创伤愈合过程中其他生长因子如T GF 的释放[3],提示EGF在促进口腔上皮愈合方面具有重要作用。

国内外学者都发现复发性阿弗他溃疡(recurrent aphthous ulcer,RAU)患者在溃疡发作期唾液中EGF浓度低于正常水平[4]。

在放疗患者口腔中溃疡数目也随EGF降低而增加,且影响溃疡愈合[5]。

鉴于EGF的上述生理作用以及RAU 患者口腔唾液EGF浓度的改变,人们开始应用EGF治疗RAU、疱疹性口炎、创伤性溃疡都取得了良好的治疗效果[6]。

有人使用硫酸铝混悬液作为漱口液治疗Behcet s患者的口腔和生殖器溃疡也取得了显著疗效,推测与其促进EGFR的表达和EGF与受体的结合有关[7]。

并且,与其他生长因子相比,EGF在促进创面在上皮化方面具有优势[8]。

对人烧伤自然愈合过程中EGFR表达的研究显示EGFR呈规律性表达[9],据此提示:如果外源性给与EGF促进局部细胞EGFR的表达,启动EGF EGFR信号通路,就可满足细胞增殖和肉芽组织发育的最大需要,从而促进创面愈合。

在本试验中,实验组平均愈合天数低于对照组,显示了EGF 的促愈作用。

同时在伤后早期在实验组创缘上皮内及成纤维细胞即可见强阳性颗粒,反映了EGF对EGFR的诱导合成作用,以后表达逐渐增强至第10天时达到高峰,至14天时恢复至正常动物基线水平。

通过对两组动物在溃疡愈合过程中EGFR表达的比较可知,实验组由于诱导EGFR的表达,从而促进细胞增殖创面愈合。

在本研究中发现实验组创面局部EGFR表达规律与对照组相似,既在创伤中期达到最大值,以后恢复至正常水平。

口腔粘膜是癌前病变的好发部位,文献报道口腔癌的发生与EGFR表达升高有关。

本研究结果显示,外源性应用EGF虽然可以通过促进创面局部EGFR的早期表达来促进组织愈合,但EGFR的表达仍然是处于机体自身调控机制下,未发现过度表达引起组织异常增生。

说明组织修复是一个复杂而有序的生物过程,每一个修复阶段都受到机体精细的调节,生长因子由于受到剂量以及应用时间的限制,在其中仅起一个 促进 作用,并不能决定组织修复的最后方向。

因此,使用本研究浓度的表皮生长因子治疗口腔粘膜溃疡病损是安全的。

本研究有效地证明了EGF可通过诱导局部组织表达其受体从而促进口腔粘膜溃疡愈合,为临床应用EGF提供了理论依据。

虽然EGF可以促进组织愈合,但并不能因此而认为EGF是万能的,在临床应用中仍需要注意适应症的选择,特别是对于某些增殖活跃的口腔粘膜病变应谨慎。

总之,EGF在口腔粘膜病变中的应用还有待于进一步的临床观察。

参 考 文 献
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2 G reory E,Jonsso n R,Olofsson J et al.Elevated lev els of hu
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3 Y ang J,T yler L W,Donoff RB et al.Salivary EGF regulates
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4 王海宁,马迎春.唾液表皮生长因子及其临床意义的初步
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7 A lpsoy E,Er H,Durusoy C et al.T he use of sucralfate sus
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8 付小兵,孙同柱.表皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生
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9 付小兵,王亚平,常国友等.创面肉芽组织中内源性表皮
生长因子含量的动态变化及与组织修复的关系.解放军医学情报.1995;9(2):81
(2003年12月12日收稿)。