11分子荧光分析法
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分子荧光分析法
分子荧光分析法的发展史和发展趋势分子荧光光谱的发展经历了很长的一段时间,由于荧光的短暂性使得他的发展与应用经历了较长的时间。
,第一次记录荧光现象是在1575年,西班牙内科医生、植物学家莫纳德斯(N. Monardes )提到:一种木头切片的水溶液呈“可爱的天蓝色”。
17世纪,波义尔(Boyle)和牛顿(Newton)等再次观察到荧光现象并给予了更详细的描述。
1852年,斯托克斯(G.G.Stokes)用分光光度计考察奎宁和叶绿素时发现:λ吸<λ荧(斯托克斯定则),所以判断荧光是先吸光再发光,即荧光是发射光。
并且根据发荧光的矿物“萤石”→荧光。
此外他还研究了荧光强度与浓度之间的关系;描述了高浓度时及有外来物质存在时的荧光猝灭现象。
他也是第一个提出应用荧光作分析手段的人。
1867年,瑞士,高贝尔斯莱德(F.Goppelsr?der)进行了首次的荧光分析工作,应用铝-桑色素配合物的荧光进行铝的测定。
1880年,莱伯曼(Liebeman)提出了最早关于荧光与化学结构关系的经验法则。
19世纪末,人们已经知道了600种以上的荧光化合物。
20世纪以来,荧光现象的研究就更多了: 1905年,伍德(Wood)发现共振荧光。
1914年,弗兰克(Frank)和赫兹(Hertz)利用电子冲击发光进行定量研究。
1922年,Wawillous 进行荧光产率的绝对测定。
1926年,盖维奥拉(Gaviola) 进行了荧光寿命的直接测定。
分子发光在很多领域都有广泛的的应用。
分子发光包括荧光,磷光,化学发光,生物发光和散射光。
而各种分子发光都有其重要的应用。
在这里主主要介绍的是分子荧光分析的应用。
分子荧光分析方法具有具有灵敏度高,选择性强,试样量少方法方便以及物理参数较多的特点。
采用直角检测的方法,其灵敏度要比紫外—可见分光光度法高2~4个数量级,它的测定下限在0.1~0.001μg·cm-3之间。
荧光强度计算是为If=2.3ΦI0εlc 由此可以看出提高I0能够提高灵敏度,另外荧光强度是一个绝对量,不像紫外-可见光谱是相对值,因此他就有更高的灵敏度。
2014第十一章荧光分析法解析
A. 苯 B. 联苯 C. 萘 D. 芴 E.蒽 （5）下列说法中正确的是（ ）
A. 长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。 B. 分子的刚性越强，荧光强度越小。 C. 给电子取代基可导致荧光增强。 D. 吸电子取代基可导致荧光增强。
Cx
Fx Fs
F0 F0
C s
31
第三节 荧光分光光度计和分析新技术
滤光片荧光计 滤光片－单色器荧光计 荧光分光光度计
32
一、荧光分光光度计
1. 主要部件
源发光源（氙灯）、激发单色器、样品池、发射单色器、检测系统
荧光分光光度计结构示意图 1.光源
2、4、7、9. 狭缝 3.激发单色器
5.样品池 6.表面吸光物质 8.发射单色器 10.检测器 11.放大器 12.指示器 13.记录器
内部能量转换
当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重 叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的 过程。
（振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）
5
术语
外部能量转换 激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形 式释放能量的过程。
体系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的 多重性发生变化的过程，如S1* T1*
率即为1/ f。
F t F 0 e Kt F 荧光强度
K 衰减常数
F f F0 / e F0e K f
1 / e e K f
K1 1
K 1 f
F 0 / F t e Kt e t / f ln F 0 t
Ft f
12
荧光效率
发射荧光的光子数
f 吸收激发光的光子数
物质的荧光效率在0～1之间，0.1～1时有分析价值。
A. 长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。 B. 分子的刚性越强，荧光强度越小。 C. 给电子取代基可导致荧光增强。 D. 吸电子取代基可导致荧光增强。
Cx
Fx Fs
F0 F0
C s
31
第三节 荧光分光光度计和分析新技术
滤光片荧光计 滤光片－单色器荧光计 荧光分光光度计
32
一、荧光分光光度计
1. 主要部件
源发光源（氙灯）、激发单色器、样品池、发射单色器、检测系统
荧光分光光度计结构示意图 1.光源
2、4、7、9. 狭缝 3.激发单色器
5.样品池 6.表面吸光物质 8.发射单色器 10.检测器 11.放大器 12.指示器 13.记录器
内部能量转换
当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重 叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的 过程。
（振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）
5
术语
外部能量转换 激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形 式释放能量的过程。
体系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的 多重性发生变化的过程，如S1* T1*
率即为1/ f。
F t F 0 e Kt F 荧光强度
K 衰减常数
F f F0 / e F0e K f
1 / e e K f
K1 1
K 1 f
F 0 / F t e Kt e t / f ln F 0 t
Ft f
12
荧光效率
发射荧光的光子数
f 吸收激发光的光子数
物质的荧光效率在0～1之间，0.1～1时有分析价值。
荧光分析法
关系：
E h
式中:
hc
p
h
h——普朗克常数，等于6.626×10-34 J· s; c——光速，等于2.998× 1010cm/s.
在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自选状态，
常用电子自旋状态的多重性来描述。 一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用S表示， 基态为单重态的分子具有最低电子能，用S0 表示如果电子在跃 迁过程中改变了自旋方向，使分子具有两个自旋平行的电子， 这样的电子态称为三重态，用T表示
3.温度的影响
荧光强度对温度较敏感，因此荧光分析一定要严格控制温度。
温度升高，绝大多数荧光物质的荧光效率降低，荧光强度减低。 因为温度升高，激发态分子与溶剂分子的碰撞频率增大，增加 了外转移的非辐射过程，导致溶液荧光强度降低，因此，可通 过降低温度的方法提高荧光效率和荧光强度。
4.溶液pH的影响
荧光分析法可采用足够强的光源和高灵敏度的检测放大系统，从而 获得比可见光吸光度法高的多的灵敏度。
影响荧光强度的因素
1.溶剂的影响
而增强。
• 荧光峰的波长随溶剂的介电常数增大而增大，强度随极性的增大
• 2.溶液粘度的影响
• 荧光强度随着介质粘度的升高而增强，这是由于介质粘度增强，
减少了分子碰撞，从而减少了能量损失的结果
激发单色器 光源 样品池 垂直
指示器· 放大器 记录器
发 射 单 色 器 检测器
国产970CRT型荧光分光光度计
1.激发光源
荧光测量中所用的光源一般比紫外-可见分光光度计所使用的光
源发光强度大，激发光源通常采用发射强度高的汞弧灯、氢灯
或氙弧灯。氙弧灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在
E h
式中:
hc
p
h
h——普朗克常数，等于6.626×10-34 J· s; c——光速，等于2.998× 1010cm/s.
在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自选状态，
常用电子自旋状态的多重性来描述。 一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用S表示， 基态为单重态的分子具有最低电子能，用S0 表示如果电子在跃 迁过程中改变了自旋方向，使分子具有两个自旋平行的电子， 这样的电子态称为三重态，用T表示
3.温度的影响
荧光强度对温度较敏感，因此荧光分析一定要严格控制温度。
温度升高，绝大多数荧光物质的荧光效率降低，荧光强度减低。 因为温度升高，激发态分子与溶剂分子的碰撞频率增大，增加 了外转移的非辐射过程，导致溶液荧光强度降低，因此，可通 过降低温度的方法提高荧光效率和荧光强度。
4.溶液pH的影响
荧光分析法可采用足够强的光源和高灵敏度的检测放大系统，从而 获得比可见光吸光度法高的多的灵敏度。
影响荧光强度的因素
1.溶剂的影响
而增强。
• 荧光峰的波长随溶剂的介电常数增大而增大，强度随极性的增大
• 2.溶液粘度的影响
• 荧光强度随着介质粘度的升高而增强，这是由于介质粘度增强，
减少了分子碰撞，从而减少了能量损失的结果
激发单色器 光源 样品池 垂直
指示器· 放大器 记录器
发 射 单 色 器 检测器
国产970CRT型荧光分光光度计
1.激发光源
荧光测量中所用的光源一般比紫外-可见分光光度计所使用的光
源发光强度大，激发光源通常采用发射强度高的汞弧灯、氢灯
或氙弧灯。氙弧灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在
分析化学第11章--荧光分析法
2.荧光光谱： 固定激发光波长 (λex)，改变荧光 波长(λem) ，测 定F,以 λem 为横 坐标，F为纵坐标 作图，得荧光光 谱.
F
a
b
300 图
400
500 nm
硫酸奎宁的激发光谱(a) 和荧光光谱(b)
两个光谱的作用： 1）可用来鉴别荧光物质； 2）进行荧光测定时选择适当测定 波长的依据。
λ磷光>λ荧光
(二)荧光的激发光谱和发射光谱 荧光物质的两个特征光谱 1.激发光谱(excitation spectrum): 表示不同激发波长的辐射引起的物质 发射某一波长荧光的相对效率。 固定荧光波长(λem) ，改变激发光波 长(λex) ，测定F荧光强度，以激发 光波长(λex)为横坐标，荧光强度为 纵坐标作图，得激发光谱。
2)电子能态的多重性： M=2S+1 S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0 M=2S+1=1 对应基线单重态； 对于激发态 s1=1/2,s2=1/2, S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍 低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： hv 基态分子 激发单重态(s1*,s2*) 激发三重态
第11章 荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
仪器分析课件12荧光分析法
f = 0.29
ex = 356nm em = 404nm
f = 0.36
16
2. 分子的刚性
• 同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性分子 增加了共平面性， 越大， 长移。
f = 0.2
-O
O
COO-
C H2
f = 1.0
-O
O
O
COO- 荧光素钠
17
原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉
消除干扰，提高选择性、灵敏度
脉冲激光
样品
干扰 组分
44
3. 同步荧光分析
固定，同时扫描激光光谱和发射光谱 若： = em - ex
Fsp = KcFem Fex 提高灵敏度和选择性
混合物的同步荧光光谱（ =3nm）
45
4. 胶束增敏荧光
CH3(CH2)11OSO3-Na+ 非极性疏水基团 极性亲水基团 增加溶解度 增加荧光效率 增加荧光的稳定性
• 荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F=Kc
紫外法 A lg T lg I
I0
36
二、定量分析方法
1. 工作曲线法
用空白溶液调零 用标准溶液调满刻度
F cx
c1
c2 c3 c4 c5
20 40 60 80 100%
16 32 48 64 80%
37
2. 比例法（对比法）
光
强
荧光光谱 横坐标em， 度
纵坐标 发射光强度
400
500
(nm)
8
溶液荧光光谱通常具有如下特征
斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
ex = 356nm em = 404nm
f = 0.36
16
2. 分子的刚性
• 同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性分子 增加了共平面性， 越大， 长移。
f = 0.2
-O
O
COO-
C H2
f = 1.0
-O
O
O
COO- 荧光素钠
17
原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉
消除干扰，提高选择性、灵敏度
脉冲激光
样品
干扰 组分
44
3. 同步荧光分析
固定，同时扫描激光光谱和发射光谱 若： = em - ex
Fsp = KcFem Fex 提高灵敏度和选择性
混合物的同步荧光光谱（ =3nm）
45
4. 胶束增敏荧光
CH3(CH2)11OSO3-Na+ 非极性疏水基团 极性亲水基团 增加溶解度 增加荧光效率 增加荧光的稳定性
• 荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F=Kc
紫外法 A lg T lg I
I0
36
二、定量分析方法
1. 工作曲线法
用空白溶液调零 用标准溶液调满刻度
F cx
c1
c2 c3 c4 c5
20 40 60 80 100%
16 32 48 64 80%
37
2. 比例法（对比法）
光
强
荧光光谱 横坐标em， 度
纵坐标 发射光强度
400
500
(nm)
8
溶液荧光光谱通常具有如下特征
斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
第十一章荧光分析法.ppt
散射光干扰及消除
散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分 被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的 光。
散射光包括瑞利散射光和拉曼光
瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发
拉曼光： 有能量转移， λ散射> <λ激发
干扰的消除
1）改变激发光的波长；
单色器1
样品池
单色器2
垂直方向
放大 与
记录
检测器
荧光仪特点
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，
常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器
闪耀光栅
3 检测器 光电倍增管
5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成 强荧光衍生物以提高测量灵敏度。
故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可 用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚 广。
思考题
• 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？
• 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？
• 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。
6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。
7. 荧光光谱的特征？
1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射 出比入射光( )。
A. 波长长的光线
B. 波长短的光线
C. 能量大的光线
D. 频率高的光线
2. 下列说法正确的是(
)
A 荧光发射波长永远大于激发波长
B 荧光发射波长永远小于激发波长
分子荧光分析法
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1.分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
1.激发光源：能发出强度较大，连续稳定的光 源。
主要有：溴钨灯、氢灯、高压汞灯、氙弧灯 2.分光系统： 第一单色器（激发单色器）：位于光源与液槽
间，滤去非选择波长的激发光。 第二单色器（发射单色器）：位于液槽与检测器
之间，滤去反色光，散色光和杂质产生的荧 光。
第五章 分子荧光分析法
3.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm 以下紫外光。
4.检测器：荧光弱，检测器灵敏度要高。 光二极管阵列检测器。
二、仪器的类型 1.光电荧光计：滤光片荧光计。
溴钨灯，滤光片，光电管。 2.荧光分光光度计：氙灯，光栅，狭缝，
光电倍增管。
第五章 分子荧光分析法
第三节 定性定量分析
第五章 分子荧光分析法
第一节 第二节 第三节 第四节
基本原理 仪器 定性定量分析 荧光新技术和应用实例
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程 分子的激发态 荧光的产生 激发光谱和荧光光谱 激发光谱和荧光光谱的关系 二、分子结构与荧光关系 荧光效率 分子结构与荧光的关系 影响荧光强度的外界因素 荧光强度与荧光物质浓度的关系
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
h
30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
h
32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
分析化学第11章--荧光分析法
第11章 荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
分子荧光分析法实验
1.1 荧光的产生
S2
2 1
V=0
2
S1
1 V=0
VR
ic
VR
A1
A2
F
发生激发 态反应
isc
T1
2
1
V=0
P
3
S0
2 1
V=0
分子内的激发和衰变过程
激发态能量的跃迁与转 化的形式和速率：
A1,A2 吸收: 10-15 s VR 振动松弛： 10-12 s ic 内转化： 10-11 s isc 系间窜越：
10-6 ~ 10-2 s
F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s
P 磷光： 10-6 ~ 100 s
1.2 荧光光谱
当固定激发光波长和强度不变，而记录荧光 强度随波长变化的曲线，称为荧光光谱。若 固定荧光最强处的荧光波长不变而改变激发 光波长，记录荧光强度随激发光波长变化的 曲线，称为激发光谱。
1.2 荧光光谱
5.空白溶液测试：
设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样架 内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计 算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近零 时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
7.未知试样的测定：
将已配制处理好的未知试样装入样品池置于试样架内，用测定标 准溶液相同的条件，测其相对荧光强度。
1.5 分子荧光分析法的应用简介
常规分析应用：
定性分析：φf；λex；λem；峰形等
其它（略）
分子相互作用研究；
显微成像（物理迁移与化学衍化的原位 “显迹”）
定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C 高端生化研究： 代谢动力学跟踪；
分子荧光分析法
分子荧光分析法标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]分子荧光分析法用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X射线范围内的荧光。
2. 原子荧光分析法：待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。
荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。
荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。
3. 分子荧光分析法：有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理一. 分子荧光的发生过程（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=+(-)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”；图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即S=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。
但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的 10-6~10-7。
（二）分子去活化过程及荧光的发生：（一个分子的外层电子能级包括 S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
第十一章 荧光分析法
４
（3）系间跨跃（isc） 单线态的较低振动能级（s1）与三重态 T1 的较高振动能 级有重叠，电子有可能发生自旋状态改变而发生系间跨跃。 如含有碘溴等分子系间跨越最常见。 （4）荧光发射： 通过内转换和振动驰豫，较高能级的电子均跃回到第一 电子激发态（S1）的最低振动能级（V0=0）上。处于激发单 重态的最低振动能级的分子，若以 10-9~10-7S 左右时间发射 光子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生，称为 荧光发射。 （5）磷光发射（P）： 分子经系间跨跃迁后，接着就发生快速振动驰豫而达到 三重激发态 T1 的最低振动能级（V=0）上，再跃迁到基态的 各振动能级就能发磷光。 （T：10-4~10S） （6）激发分子与溶剂分了或其它溶质分子间相互作用， 发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失，这一现象 称为“淬灭”。 二、激发光谱和发射光谱
波长相同，也可以不同，这一现象我们称为光致发光。最常
见 两 种 光 致 发 光 现 象 是 荧 光 （ Fluorometry ） 和 磷 光
（Phosphorscence）。
这两种过程的机理不同。
10-15s M+hr → M*
hr1→M hr→M
物质分子吸收光子能量而被激发，然后从第一激发态最
低振动能级返回到基态时各振动能级所发射出的光称为荧
１０
位阻使共平面下降则荧光减弱。例 P89 顺反异构体分子，顺式分子的两个荃团在同一侧，由于 位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。 1-2 一二苯乙烯的反式结构有强烈荧光，而顺式异构体 （b）无荧光。
3.苯环取代基的类型： 芳香化合物的芳香环上，不同取代基对论化合物的荧光 强度和荧光光谱将有很大影响。规律如下： 给电子基团使荧光效率增强：如-OH,-NH2,-NHR,NR2,-OR 等； 吸电子基团：-COOH，-C=0，-NO2，-NO，-N=N-及卤素会 减弱甚至破坏荧光，且卤素随原子序数的增大，会使下 T1 体系的磷光增强，荧光减弱了解物质分子结构和荧光的关系， 可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，或将 荧光强度不大或选择性不多的荧光物质转化为荧光强度大及 选择性高的荧光物质，以提高分析的效果。对 T1 电子共轭体 系作用小：-R，NH3+，-SO31-1
（3）系间跨跃（isc） 单线态的较低振动能级（s1）与三重态 T1 的较高振动能 级有重叠，电子有可能发生自旋状态改变而发生系间跨跃。 如含有碘溴等分子系间跨越最常见。 （4）荧光发射： 通过内转换和振动驰豫，较高能级的电子均跃回到第一 电子激发态（S1）的最低振动能级（V0=0）上。处于激发单 重态的最低振动能级的分子，若以 10-9~10-7S 左右时间发射 光子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生，称为 荧光发射。 （5）磷光发射（P）： 分子经系间跨跃迁后，接着就发生快速振动驰豫而达到 三重激发态 T1 的最低振动能级（V=0）上，再跃迁到基态的 各振动能级就能发磷光。 （T：10-4~10S） （6）激发分子与溶剂分了或其它溶质分子间相互作用， 发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失，这一现象 称为“淬灭”。 二、激发光谱和发射光谱
波长相同，也可以不同，这一现象我们称为光致发光。最常
见 两 种 光 致 发 光 现 象 是 荧 光 （ Fluorometry ） 和 磷 光
（Phosphorscence）。
这两种过程的机理不同。
10-15s M+hr → M*
hr1→M hr→M
物质分子吸收光子能量而被激发，然后从第一激发态最
低振动能级返回到基态时各振动能级所发射出的光称为荧
１０
位阻使共平面下降则荧光减弱。例 P89 顺反异构体分子，顺式分子的两个荃团在同一侧，由于 位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。 1-2 一二苯乙烯的反式结构有强烈荧光，而顺式异构体 （b）无荧光。
3.苯环取代基的类型： 芳香化合物的芳香环上，不同取代基对论化合物的荧光 强度和荧光光谱将有很大影响。规律如下： 给电子基团使荧光效率增强：如-OH,-NH2,-NHR,NR2,-OR 等； 吸电子基团：-COOH，-C=0，-NO2，-NO，-N=N-及卤素会 减弱甚至破坏荧光，且卤素随原子序数的增大，会使下 T1 体系的磷光增强，荧光减弱了解物质分子结构和荧光的关系， 可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，或将 荧光强度不大或选择性不多的荧光物质转化为荧光强度大及 选择性高的荧光物质，以提高分析的效果。对 T1 电子共轭体 系作用小：-R，NH3+，-SO31-1
荧光分析法
基态时分子中的电子对填充在能量最低的轨道，
且自旋相反，即总自旋量子数s为0
电子能级多重性：M＝2s+1 单重态S M＝1 自旋相反 三重态T M＝3 自旋相同
4
基态
被激发跃迁过程中：
通常电子不发生自旋方向的改变,电子对自旋相反， 电子发生自旋方向的改变,电子对自旋相同，总自旋
总自旋量子数s为0,处于激发单重态。
第十一章 荧光分析法
（Fluorescence）
1
分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。
hγ
概述
M+ 能量 →M＊
M
2
分类
原子荧光 荧光 分子荧光 光致发光（PL） 紫外可见荧光 磷光 化学发光（CL） 红外荧光 X射线荧光 电致发光（EL） 生物发光（BL）
19
3）荧光光谱与激发光谱镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱
形状一样）成镜像对称关系
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振 动能级分布类似；
20
镜像关系?
固定em=620nm 固定ex=290nm (MAX)
IF
4 3 2 1
4800 4400
1→ 4 1→ 3
S1
4000
44
4.胶束增敏荧光分析 当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度，
会缔合为球状胶束， 利用胶束溶液对荧光物质有
增溶、增敏和增稳的作用，对荧光物质进行保护
45
荧光分析法的应用 1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 2.生物与有机化合物的分析
分子荧光光谱法(原理和方法)
Molecular fluorescence spectroscopy
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
化合物
C6H5OH C6H5O— C6H5NH2
+ C6H5NH3
相对荧光 强度 18 10 20
0
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱
。荧光分光光度计既可用于定 量分析，也可用于测绘激发光谱 和荧光光谱。第一单色器选择激 发光波长（＞250nm的 紫外光）故称为激发单色器 第二单色器（荧光单色器） 与激发光入射方向垂直， 并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
化合物
C6H5OH C6H5O— C6H5NH2
+ C6H5NH3
相对荧光 强度 18 10 20
0
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱
。荧光分光光度计既可用于定 量分析，也可用于测绘激发光谱 和荧光光谱。第一单色器选择激 发光波长（＞250nm的 紫外光）故称为激发单色器 第二单色器（荧光单色器） 与激发光入射方向垂直， 并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
第十三章-荧光分析法PPT课件
内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
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回至基态。如果通过碰撞以热能或动能的
形式释放能量回到基态，称为无辐射跃迁；
如果是以辐射(发射光子)的形式回到基态，
此种现象称为光致发光。常见的光致发光
包括荧光和磷光。
3
荧光分析法
定义：根据物质的荧光谱线位置及其
强度进行物质鉴定和含量测定的方法。 分类：
待测物质 原子荧光 紫外-可见荧光 激发光的波长范围 分子荧光
化学分析（Ⅱ）
第十一章
荧光分析法
1
基本要求
掌握分子荧光的发生过程，激发光谱和发射光 谱，荧光光谱的特征，分子结构与荧光的关系； 影响荧光强度的因素，荧光定量分析方法。 熟悉分子从激发态返回基态的各种途径，荧光 寿命与荧光效率。 了解荧光分光光度计与其他荧光分析技术。
2
概念 处于基态的分子吸收能量被激发至激 发态，然后从不稳定的激发态释放能量返
UV/Vis 吸收
MFS 发射
10-5～10-6mol· -1 L
10-7～10-9 mol· -1 L
I0 F
6
1575年，西班牙医生N.Monardes发现。
1852年，Sir George Stokes对荧光产生的机理
作了解释，并提出了“荧光”。
1867年，首次用于分析测定。
1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。
43
长共轭结构示例
比较：λ ex (nm)/λ em (nm)/ f
苯 205/278/0.11
萘 286/321/0.29
蒽 356/404/0.36
CH2OCOCH3
维生素A λex＝327nm；λem＝510nm
44
刚性和共平面结构示例
联苯f＝0.2
芴f＝1.0
形成络合物后，如果分子的刚性和共平面性增强， 可使荧光增强。
OH N
O Mg N
8-羟基喹啉
8-羟基喹啉镁
45
空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na H3C N CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 f＝0.75
②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐 f＝0.03
顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没 有荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反 式有强烈荧光，而顺式无荧光。
磷 光
10－9～10－7 s 磷光寿命:
基态 振动驰豫 图11-2 荧光和磷光产生示意图
10－4～10 s
26
（二）荧光的激发光谱和发射光谱
荧光物质分子都具有两个 特征光谱：激发光谱和发 射光谱（荧光光谱）。 激发光谱：不同激发波长 的辐射引起物质发射某一 波长荧光的相对效率。 荧光光谱：在所发射的荧 光中各种波长组分的相对 强度。
芳香族化合物、五元杂环上取代苯基.
共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大.
─(CH=CH)2─
φ=0.28
─(CH=CH)3─
φ=0.68
32
2. 刚性结构和共平面效应
-O O -O O C O
C
COO-
COO-
酚酞(无荧光)
荧光黄
O
N Mg N O
N O-
8－羟基喹啉(弱荧光)
红色荧光
33
联二苯 φ= 0.2
红外荧光
X射线荧光
4
荧光分析法的特点
灵敏度高：检测限0.0001 µg/mL,
比分光光度法高2～4个数量级。
（在黑背景下检测；光源的强度大）
选择性高：
适当选择激发光的波长和荧光测定的波长； 应用荧光寿命的差别 –时间分辨技术。
5
MFS与UV/Vis 法比较：
原理
灵敏度, 选择性
测定方法
I0 F It
11
辐射跃迁－发光失活
• 荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低 振动能级回到基态S0所发出的辐射。 • 磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低 振动能级回到基态S0所发出的辐射。 • 波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
12
无辐射失活
a.振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的 较高振动能级转至较低振动能级的过程，其 效率较高 b.内转换：当两个电子能级非常接近以致其振 动能级有重叠时，电子由高能级回到低能级 的过程。
13
无辐射失活
c.外转换：激发态分子与溶剂、溶质分子之间 发生相互碰撞而失去能量的过程。
d.系间跨越：激发态分子的电子自旋发生倒转 而使分子的多重态发生变化的过程。
14
激发单重态 内转换 振动驰豫
激发三重态 系间跨跃
吸 收
荧 光
外 转 换
荧光寿命:
磷 光
10－9～10－7 s 磷光寿命:
基态 振动驰豫 图11-2 荧光和磷光产生示意图
S0 l2 l1
24
复习
分子荧光的发生过程
基态分子
概念：基态、激发态（激发单重态S*、激发
三重态T*）
能量传递过程： 1、无辐射跃迁（振动弛豫、内转换、外转换、 系间跨越） 2、辐射跃迁（荧光、磷光）
25
激发单重态 内转换 振动驰豫
激发三重态 系间跨跃
吸 收
荧 光
外 转 换
荧光寿命:
芴 φ= 1.0 C H 2
3,4-苯并芘
( 强荧光物质)
34
N(CH3)2 O3S
SO3
N(CH3)2
Ff＝0.75
Ff＝0.03
扭转离开了平面构型，影响了p-共轭作用
35
C H
C H
C C H
H
顺式二苯乙烯 无荧光
反式二苯乙烯 强荧光
36
3. 取代基的作用
给电子基增强荧光： －OH,－OR,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N 吸电子基减弱荧光： －COOH,－C=O,－NO2,－N＝N,－Cl,－Br,－I 与体系作用小的取代基影响不明显： －SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。
O O H O 黄酮醇(Zr,Sn等)
茜素紫酱R(Al,F-等) SO3Na O OH C C H 安息香(B,Zn,Ge,Si等)
41
三、影响荧光强度的主要因素
内部因素：分子结构对荧光效率的影响 外部因素：外界条件对荧光效率的影响
42
1.内部因素
内部因素：分子结构对荧光效率的影响。物质分子 有强的紫外吸收和一定的荧光产率是发射荧光的两 个必备条件。分子结构中有π→π﹡跃迁（K带强吸收） 或n→π﹡跃迁（R带弱吸收）。 ⑴ 长共轭结构：分子中必须具有大的共轭π键结构。 共轭度越大，发射波长长移，发光强度增加。 ⑵ 分子的刚性和共平面性：具有刚性平面性结构的分 子荧光量子产率高。 ⑶ 取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而 吸电子取代基则使荧光强度降低。
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2. 荧光的产生
光吸收过程 失活过程 荧光 发光失活
分子间能量转移失活
磷光
振动驰豫
非辐射失活 内转换
外转换 系间跨跃
10
激发单重态 内转换 振动驰豫
激发三重态 系间跨跃
吸 收
荧 光
外 转 换
荧光寿命:
磷 光
10－9～10－7 s 磷光寿命:
基态 振动驰豫 图11-2 荧光和磷光产生示意图
10－4～10 s
c3 c2 c1 c0
图11-3 蒽的激发光谱和荧光光谱
激发光谱:Excitation Spectrum, 激发波长:lex
发射光谱 Emission Spectrum, 发射波长:lem
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二、荧光与分子结构
（一）荧光寿命和荧光效率
荧光寿命(τf)：
除去激发光源后，分子的荧光强度降低 到激发时最大荧光强度的 1/e 所需的时间称 为荧光寿命(10-8∼10-10s)。荧光物质受到一 个极短时间的脉冲光激发后，荧光强度从激 发态到基态的变化，可用指数衰减定律表示
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取代基作用 第一类取代基是给电子基团，能增加分子的电子共 轭程度，使荧光效率提高，荧光波长长移。如：－ NH2、－OH、－OCH3 、－NHR、－CN等。 第二类取代基是吸电子基团，会妨碍分子的电子共 轭性，使荧光减弱甚至熄灭。如：－COOH、－ NO2、－CO、－NO、－SH、－NHCOCH3、－X( 卤素原子序数↑，荧光效率↓)等。 第三类取代基对电子共轭体系作用较小，对荧光的 影响不明显。如：－R、－SO3H、－NH3＋等。
分子的吸收情况
T1
S1
S0 l2 l1
18
振动弛豫快 （10-14～10-12 s内完成）
S0
l2
l1
19
内转移（internal conversion) ：相同多 重性的两个电子能级之间的非辐射跃迁 S2 T1 S1
S0
l2
l1
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1952年，商品荧光分光光度计出现。
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第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
二、荧光与分子结构 三、影响荧光强度的外部因素
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一、分子荧光
（一）分子荧光的产生
1、分子的电子能级与激发过程
分子的多重性M: M=2s+1， s表示总自旋量子数， s=0时分子所处的电 子能态为单重态，用 S来表示； s=1时分子所处的电 子能态为三重态，用 T来表示；
NH2 OH
比
NO2
I
荧光强50倍
COOH
无荧光
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取代基之间若发生氢键，增强分子平面性 和刚性会加强荧光:
COOH COOH
水杨酸
O C OH OH 中性、碱性 均有荧光
OH OH 无荧光 碱性 有荧光
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（三）荧光试剂