微生物无菌操作技术
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③安全柜内不放与本次实验无关的物品。柜内物品摆放应做到清洁区、 半污染区与污染区基本分开，操作过程中物品取用方便，且三区之间无 交叉。物品应尽量靠后放置，但不得挡住气道口，以免干扰气流正常流 动。
④操作时应按照从清洁区到污染区进行，以避免交叉污染。为防可能溅 出的液滴，可在台面上铺一用消毒剂浸泡过的毛巾或纱布，但不能覆盖 住安全柜格栅。
⑧柜内使用的物品应在消毒后再取出，以防止将病原微生物带出而污染 环境。
⑨工作完全后，关闭玻璃窗，保持风机继续运转10～15分钟，同时打开 紫外灯，照射30分钟。
⑩安全柜应定期进行清洁消毒，柜内台面污染物可在工作完成且紫外灯 消毒后用2%的84消毒液擦拭。柜体外表面则应每天用1%的84消毒液擦拭 。
2021/3/11
微生物实验无菌操作
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微生物接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物 体内的过程。微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作 技能。
无菌技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其 干扰的一系列操作方法和有关措施。无菌操作是微生物接种技术的关键。
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超净工作台的使用及注意事项 ①使用前30到60分钟用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面 ，打开紫外灯照射30min；
②使用前10分钟将风机启动，调整风量，工作时关闭杀菌灯；
③使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布 檫拭；
④请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物，禁止存放无关的物品，以 保持工作区的洁净气流不受干扰；
部环境提供某些程度的保护以防污染，是一种安全的微生物专用洁净
工作台。
原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，通过风机将空气
吸入预过滤器，经由静压箱进入高效过滤器过滤，将过滤后的空气
以垂直或水平气流的状态送出，洁净空气(进滤空气)按
设定的方向流动而形成的。使操作区域达到
所需的洁净度。
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注意事项：
①堆放灭菌物品时，严பைடு நூலகம்堵塞安全阀和放气阀的出气孔，必须留出空位
保证其空气畅通，否则安全阀和放气阀因出气堵塞不能工作，造成事故 。
②灭菌液体时，应将液体灌装在硬制的耐热玻璃瓶中，以不超过3/4体积 为好，瓶口选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞。
③灭菌液体结束时，不准立即释放蒸汽，必须待压力表指针回零位方可 放余汽。 ④对不同类型、不同灭菌物要求的物品，切勿放在一起灭菌，以免造成 损失。 ⑤灭菌终了时，若压力表指针已回复零位，而盖不易开启时，则可将放 气阀摘子置于放气方汽。使外界空气进入灭菌器内，真空消除后，盖即 可开启。
⑤柜内操作期间，严禁使用酒精灯等明火，以避免产生的热量产生
气流，干扰柜内气流稳定；且明火可能损坏HEPA滤器。
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⑥工作时尽量减少身后人员走动以及开关房门，以防止安全柜内气流不 稳定。
⑦在实验操作时，不可打开玻璃视窗，应保证操作者脸部在工作窗口之 上。在柜内操作时动作应轻柔、舒缓，防止影响柜内气流。
⑤禁止在工作台面上记录书写，工作时应尽量避免作明显干扰气流的动 作；
⑥禁止在预过滤器进风口部位放置物品，以免挡住进风口造成进风
量减少，降低净化能力；
⑦使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭送风机，重
新开启紫外灯照射15min，最后关闭电源；
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②生物安全柜
生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性 的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其 避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的 。
无菌操作主要目的： （1）保证实验操作中不被环境中微生物污染； （2）防止微生物在操作中污染环境或感染操作人员。
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微生物接种流程
一、实验材料的准备工作 （1）培养基的配制和相关器具的准备 （2）灭菌和消毒 二、无菌操作 （1）接种前的准备工作 （2）接种
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一、实验材料的准备工作
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超净工作台（clean bench）与生物安全柜（Biosafety Cabinet）不同 。超净工作台只能保护在工作台内操作的试剂等不受污染，并不保护工 作人员，而生物安全柜是负压系统，能有效保护工作人员。
⑥高压灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，高压灭菌锅内
冷空气排除不干净，将达不到灭菌所需的温度。
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二、无菌操作
（1）接种前的准备工作
1、仪器
①超净工作台
超净工作台是能将工作区已被污染的空气
通过专门的过滤通道人为地控制排放，为
实验室工作提供无菌操作环境的设施，以
保护实验免受外部环境的影响，同时为外
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生物安全柜使用规程
①操作前应将本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免双臂频繁穿过 气幕破坏气流；并且在移入前用70%酒精擦拭表面消毒，以去除污染。
②打开风机5～10分钟，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作。 将双臂缓缓伸入安全柜内，至少静止1分钟，使柜内气流稳定后再进行操 作。
（1）培养基的配制和相关器具的准备 1、培养基的配置 2、接种工具的准备： 常用的接种工具有接种环、接种针和涂布棒。其中最常用的接种工具或 移植工具是接种环。
3、其他器具的准备
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（2）灭菌和消毒
消毒：用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物的措施， 实际上是部分灭菌。例如，酒精擦拭。
灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外所有微生物永远丧失其生长 繁殖能力的措施。
干热灭菌
湿热灭菌
灭 菌
过滤除菌
紫外线杀菌
化学药剂杀菌
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其中高压蒸汽灭菌是微生物学研究和教学中应用最广泛、效果最好的湿 热灭菌方法。
灭菌原理： 将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内 。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱 尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上 升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到良好的 灭菌效果，一般要求温度应达到121℃（压力为0.1MPa） 时间维持15到30分钟。也可以采用在较低的温度（115℃ ，压力为0.075MPa）下维持35分钟的方法。
④操作时应按照从清洁区到污染区进行，以避免交叉污染。为防可能溅 出的液滴，可在台面上铺一用消毒剂浸泡过的毛巾或纱布，但不能覆盖 住安全柜格栅。
⑧柜内使用的物品应在消毒后再取出，以防止将病原微生物带出而污染 环境。
⑨工作完全后，关闭玻璃窗，保持风机继续运转10～15分钟，同时打开 紫外灯，照射30分钟。
⑩安全柜应定期进行清洁消毒，柜内台面污染物可在工作完成且紫外灯 消毒后用2%的84消毒液擦拭。柜体外表面则应每天用1%的84消毒液擦拭 。
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微生物实验无菌操作
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微生物接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物 体内的过程。微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作 技能。
无菌技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其 干扰的一系列操作方法和有关措施。无菌操作是微生物接种技术的关键。
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超净工作台的使用及注意事项 ①使用前30到60分钟用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面 ，打开紫外灯照射30min；
②使用前10分钟将风机启动，调整风量，工作时关闭杀菌灯；
③使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布 檫拭；
④请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物，禁止存放无关的物品，以 保持工作区的洁净气流不受干扰；
部环境提供某些程度的保护以防污染，是一种安全的微生物专用洁净
工作台。
原理：超净工作台的洁净环境是在特定的空间内，通过风机将空气
吸入预过滤器，经由静压箱进入高效过滤器过滤，将过滤后的空气
以垂直或水平气流的状态送出，洁净空气(进滤空气)按
设定的方向流动而形成的。使操作区域达到
所需的洁净度。
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注意事项：
①堆放灭菌物品时，严பைடு நூலகம்堵塞安全阀和放气阀的出气孔，必须留出空位
保证其空气畅通，否则安全阀和放气阀因出气堵塞不能工作，造成事故 。
②灭菌液体时，应将液体灌装在硬制的耐热玻璃瓶中，以不超过3/4体积 为好，瓶口选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞。
③灭菌液体结束时，不准立即释放蒸汽，必须待压力表指针回零位方可 放余汽。 ④对不同类型、不同灭菌物要求的物品，切勿放在一起灭菌，以免造成 损失。 ⑤灭菌终了时，若压力表指针已回复零位，而盖不易开启时，则可将放 气阀摘子置于放气方汽。使外界空气进入灭菌器内，真空消除后，盖即 可开启。
⑤柜内操作期间，严禁使用酒精灯等明火，以避免产生的热量产生
气流，干扰柜内气流稳定；且明火可能损坏HEPA滤器。
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⑥工作时尽量减少身后人员走动以及开关房门，以防止安全柜内气流不 稳定。
⑦在实验操作时，不可打开玻璃视窗，应保证操作者脸部在工作窗口之 上。在柜内操作时动作应轻柔、舒缓，防止影响柜内气流。
⑤禁止在工作台面上记录书写，工作时应尽量避免作明显干扰气流的动 作；
⑥禁止在预过滤器进风口部位放置物品，以免挡住进风口造成进风
量减少，降低净化能力；
⑦使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭送风机，重
新开启紫外灯照射15min，最后关闭电源；
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②生物安全柜
生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性 的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其 避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的 。
无菌操作主要目的： （1）保证实验操作中不被环境中微生物污染； （2）防止微生物在操作中污染环境或感染操作人员。
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微生物接种流程
一、实验材料的准备工作 （1）培养基的配制和相关器具的准备 （2）灭菌和消毒 二、无菌操作 （1）接种前的准备工作 （2）接种
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一、实验材料的准备工作
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超净工作台（clean bench）与生物安全柜（Biosafety Cabinet）不同 。超净工作台只能保护在工作台内操作的试剂等不受污染，并不保护工 作人员，而生物安全柜是负压系统，能有效保护工作人员。
⑥高压灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，高压灭菌锅内
冷空气排除不干净，将达不到灭菌所需的温度。
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二、无菌操作
（1）接种前的准备工作
1、仪器
①超净工作台
超净工作台是能将工作区已被污染的空气
通过专门的过滤通道人为地控制排放，为
实验室工作提供无菌操作环境的设施，以
保护实验免受外部环境的影响，同时为外
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生物安全柜使用规程
①操作前应将本次操作所需的全部物品移入安全柜，避免双臂频繁穿过 气幕破坏气流；并且在移入前用70%酒精擦拭表面消毒，以去除污染。
②打开风机5～10分钟，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作。 将双臂缓缓伸入安全柜内，至少静止1分钟，使柜内气流稳定后再进行操 作。
（1）培养基的配制和相关器具的准备 1、培养基的配置 2、接种工具的准备： 常用的接种工具有接种环、接种针和涂布棒。其中最常用的接种工具或 移植工具是接种环。
3、其他器具的准备
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（2）灭菌和消毒
消毒：用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大多数微生物的措施， 实际上是部分灭菌。例如，酒精擦拭。
灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外所有微生物永远丧失其生长 繁殖能力的措施。
干热灭菌
湿热灭菌
灭 菌
过滤除菌
紫外线杀菌
化学药剂杀菌
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其中高压蒸汽灭菌是微生物学研究和教学中应用最广泛、效果最好的湿 热灭菌方法。
灭菌原理： 将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内 。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱 尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上 升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到良好的 灭菌效果，一般要求温度应达到121℃（压力为0.1MPa） 时间维持15到30分钟。也可以采用在较低的温度（115℃ ，压力为0.075MPa）下维持35分钟的方法。