木聚糖酶研究进展

木聚糖酶研究进展刘亮伟河南农业大学生命科学学院郑州 450002 文化路 95 号llw321@科学技术的进步给21世纪的人类带来了便利,也给人类带来了前所未有的压力：人口膨胀、能源危机、环境污染、资源匮乏，所有这些问题的本源是能源危机。

与能源匮乏相矛盾，自然界通过光合作用赋予人类大量可再生资源：如纤维素和半纤维素，作为继纤维素后第一大生物资源的半纤维素在农业和木材工业中是常见的废弃物，它作为可再生资源的一个有利条件是它比纤维素更易于提取和水解。

秸秆中半纤维素含量占其总干重的25～50%，其化学结构较纤维素复杂得多，由D-木糖通过β-1,4-糖苷键相连成的主链和少量L-阿拉伯糖侧链所组成[1]，这种D-木糖单元在硬木和软木中平均聚合度分别是150－200和70－130，要得到能够利用的单糖必须通过以木聚糖酶为主的半纤维素酶系协同作用进行水解而完成[2]。

内切-1,4-β-木聚糖酶（E.C 3.2.1.8）是一种内切糖苷酶，能够水解木聚糖这类自然界中最丰富的半纤维素，同自然界中五碳糖的循环相联系，在能量循环中占有重要地位。

在古代人们就已经在生产过程中间接地利用各种酶进行生产：如酿酒、制作奶酪、烘焙面包、修饰淀粉等。

1986年，Viikarri发现了木聚糖酶在纸浆漂白和造纸工业中能够降低环境污染物品的用量[3]，伴随着人类对于可持续性发展和环境的重视，木聚糖酶在工业上的应用明显增加，在1997-2002年间的5年中，纸浆造纸业用酶由1.0亿美元增加到1.92亿元，增长率为16.2%，是所有酶制品行业中增长率最快的。

1木聚糖酶的应用1.1在纸浆造纸工业中应用木聚糖酶最重要的用途是在纸浆造纸工业中对于纸浆的漂白。

因为环境污染最大的来源是纸浆造纸工业中的废水。

根据资料显示仅仅美国每年用于纸浆漂白的氯化物或次生氯化物用量就有200多万吨[4]。

因为纸浆漂白污水中含有有毒物质，并且这些物质能在生态系统的生物和非生物组成中积累，如氯苯、氯二苯和其它氯化木质素次生物[5; 6]。

这些化学物质对环境危害很大，据有关研究显示既便是远离造纸厂10公里以外的鱼群都会受到纸浆漂白污水中有害物质的负面影响[7]，这种受到污染的鱼可以直接或间接地影响人类的身体健康。

木聚糖酶的作用就是对木聚糖进行水解从而加快了纸浆中木质素的释放，色素物质所以能够比较容易地从纤维素中释放出来。

经实验证实，木聚糖酶的漂白效果比木质素降解酶好得多，这是因为木质素大部分交联在半纤维素上，而半纤维素比木质素更容易解聚[8]。

利用木聚糖酶相应地比其它酶进行多聚物降解时，碳水化合物水解速度要快2-3倍[9]。

经木聚糖酶处理后的纸浆漂白可以降低20%-40%漂白剂用量 [10]。

木聚糖酶剂量和纸浆浓度之间的比例，酶剂量配比为2-5IU/g纸浆干重重量，而纸浆浓度在5%-10%之间效果比较好。

1.2 在动物饲料中的应用动物饲料中半纤维素对于非反刍类动物来说几乎没有营养价值，因为这类动物缺乏合适的降解酶类。

然而这些未消化的半纤维素会在动物肠道中增加食物的粘度，从而影响消化酶透过性，所以不利于纤维素降解，结果是影响食物的消化和吸收。

在大麦类动物饲料中，阿拉伯木聚糖是构成非淀粉多糖的主要成份，占谷粒中多糖成份的4-8%、占胚乳中多糖的25%、占糊粉层中多糖的75%，而这部分物质只是部分水溶性；所以会产生高度粘稠的水溶液从而造成动物饲料中谷物难以吸收利用[11]。

如果在动物饲料中加入木聚糖酶，那么就可以降解这类物质，利于可利用多糖的降解，从而增加饲料利用率。

1.3 在食品工业中的应用木聚糖酶可用于生产咖啡过程中对于咖啡胶进行液化，以及提取风味物质和色素物质、植物油和淀粉[12]。

由于在制备饮料和酒类过程中所用原料中含有非淀粉多糖类物质，而这类物质水溶性较差，所以会在饮料和酒类中呈现不透明的混浊状态。

木聚糖酶用来水解这类多糖物质，从而达到澄清饮料和酒类目的[13]。

现在市场上已经有用在啤酒生产工艺中粉碎过程的商品化木聚糖酶，从而保证这类物质彻底降解，这样可以避免在啤酒发酵过程中遇到的过滤困难和混浊问题。

1.4 在烘焙食品中的应用由于在面粉类原材料中含有大量半纤维素类物质，如果木聚糖酶水解面团这类麸质部分物质，就可以在烘焙食品中使面包中的水分分布均匀[14]，从而有效地增加面包的质地、体积和货架流通时间。

提高面包质量的效果可以从面包体积的显著增加看到，如果同淀粉酶合用这种效果会更加明显[15]。

进一步研究发现，对于面包体积增加的因素主要取决于木聚糖酶溶解和降解面团中物质的比例[16]。

实验证实木聚糖酶在生产麦子面粉的分离过程中也有显著效果，因为对于可溶性阿拉伯-木聚糖有很高活性，明显地降低了面粉浆粘度[17]。

1.5 在制备功能性低聚糖中的应用功能性低聚糖是一种益生元，也叫双歧因子，是由2-10个单糖分子构成的短链糖聚合物。

哺乳动物消化道不能吸收这种糖，然而这种低聚糖在大肠中可以促进双歧杆菌等益生菌的增殖、调整菌群平衡、改善肠道功能、抑制肠道腐败、降低血脂胆固醇、增强机体的免疫功能等等。

低聚木糖是最有效的双歧因子，每日摄取0.7g即可发挥作用。

全世界这类低聚糖的产量约10万吨：日本约2万吨、我国约3万吨。

而在生产低聚木糖中必须使用木聚糖酶。

低聚木糖还可用作食品工业中的粘稠剂和脂肪替代品，或者用在食品添加剂中作为抗冻剂、低热量甜味剂等[18]。

2 木聚糖酶的分类和结构由于木聚糖酶在工业应用方面的重要作用，人们克隆表达了大量木聚糖酶，并研究了相关酶学性质。

仅在Swiss-Prot数据库中就有67条木聚糖酶序列（2004年7月7日，发放号43.5），在Tremble数据库中有447条木聚糖酶序列（2004年7月7日，发放号43.5）[19]。

对于这样大量的数据进行分析极为不便，人们希望找到木聚糖酶的相似性而加以分类。

在1988年，Wong等人根据真菌和细菌木聚糖酶的物理化学特性，结合它们分子量和等电点之间的相互关系。

建议将木聚糖酶大致分为两类：一类是分子量小于30,000道尔顿略呈碱性的木聚糖酶；另一类是分子量大于30,000道尔顿略呈酸性的木聚糖酶[13]。

1989年，Henrissat 首先采用疏水性聚类方法来比较氨基酸序列相似性，来对水解酶进行分析，从而获取结构、功能和和进化方面的信息。

根据疏水性聚类分析方法将木聚糖酶分为二个家族：Ｆ家族和Ｇ家族，其中也包括其它多聚糖水解酶类：如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖酶。

字母分类中的Ｆ家族和Ｇ家族相当于数字分类中水解酶10和11家族，分别包含高分子量和低分子量木聚糖酶。

随着分子生物学和蛋白质晶体结构技术的进步，木聚糖酶的结构慢慢测定出来，从而显示出结构保守性要比蛋白质序列保守性好得多；明显看出F/10木聚糖酶家族和G/11木聚糖酶家族在空间结构上属于两种不同折叠类型。

F/10木聚糖酶的典型结构，整体结构象碗状，主要由α-螺旋和β-折叠片重复出现而构成上面略大下面较小的形状。

G/11木聚糖酶有典型的折叠结构：由β-折叠片为主所构成的单个结构域，这个结构域由两个β-折叠片层扭曲成将近90︒角，从而构成一个深而且狭长的沟缝状结构。

3 酶的作用机理对于木聚糖酶催化作用机理的研究起始于1990年，Bray等研究者对氨基酸进行修饰后发现酸性氨基酸在木聚糖酶的催化反应中起重要作用。

同时显示1个酸性氨基酸的pKa值升高，所以提示同溶菌酶中的Glu35这个酸性催化剂的催化作用相似[20]。

这种反应类似于其它糖苷水解酶的催化机理，同样显示出它们产物中保留了底物的异头构象。

在这个反应中包括两个氨基酸残基：第一个氨基酸作为一般的催化剂来对糖苷键上的氧原子进行质子化；第二个氨基酸则作为亲核中心，同含氧带正电荷的碳原子中间产物进行反应（发生在保留构象反应中）；或者对从水分子来的OH—质子化（发生在构象反转反应中）。

4 木聚糖酶工程木聚糖酶在生物工程中有重要的应用价值，但是生物工程的作用环境往往比较苛刻，所以要求木聚糖酶的物理化学特性比较稳定。

如在纸浆和造纸工业中，要生产纸浆需要对木材在高温和较碱性的环境进行处理，纸浆处理的温度大约在60°C [21]，而处理纸浆所采用pH值在10-11之间[22]；然而很多木聚糖酶最适作用温度在50-60°C，在55°C作用半寿期是1个小时[23]。

一般情况下，真菌来源的木聚糖酶在pH4-6酸性范围内起作用[24]；放线菌来源的木聚糖酶和细菌来源的木聚糖酶在pH5-9较广范围内起作用[25]。

由此看来，在高温和较碱性pH值有较高活性的木聚糖酶需要比较强烈。

4.1蛋白质工程在木聚糖酶pH值方面的研究由于G/11木聚糖酶结构较小，所以对这个家族的酶学性质研究也较多。

1995年，根据T. reeseii两个木聚糖酶晶体结构的差异，推测同活性位点在空间位置上较近的氨基酸对于酶最适pH值有影响，从而造成了这两个酶最适pH值的不同[26]。

1998年，对A. kawachii木聚糖酶C进行定点突变将Asp100替换为Asn，使酶的催化反应从最适pH 2显著提高到5；但是酶催化活性下降到野生型酶的15%，同时发现在酶表面有大量酸性氨基酸存在。

2000年，研究者又将 B. circulans木聚糖酶A的Asn100突变为Asp，从而将其最适pH值5.7向下移到4.6。

实验证实在T. reesei木聚糖酶II “Ser/Thr”表面引入Arg，这个突变将催化反应pH向碱性方向偏移了~0.5-1.0个单位[27]。

4.2蛋白质工程在木聚糖酶热稳定性方面的研究1993年，运用随机突变方法提高了B. pumilus木聚糖酶A的热稳定性，并且分离出4个突变酶。

由分析结果可以看出这些热稳定性突变发生在木聚糖酶序列氮端，同时结果表明Gly突变为Asp或Ser从而可能形成了氢键[28]。

1996年对于A. niger木聚糖酶A的结构分析，发现二硫键存在于Cys92和Cys111之间，从而将“弦”同蛋白结构中大的β-折叠片连接起来[29]。

1998年，通过对嗜热性Thermomyces lanuginoseus G/11木聚糖酶A三维结构的分析，认为它的热稳定性是由于二硫键存在于Cys100和Cys154之间；同时在整个蛋白中显示出带电荷氨基酸密度有增加现象[30]。

对于嗜热性蛋白质结构的研究，发现其螺旋区域的结构要比温性蛋白的螺旋区域更加稳定[31]。

2000年，在T. fusca嗜热性木聚糖酶和S. lividans嗜温性木聚糖酶基因之间，采用随机基因重组方法产生了嵌合酶。

嵌合酶最适温度比嗜温性野生型木聚糖酶高出20°C，同时保留了野生型木聚糖酶较高催化活性。