激光扫描共聚焦显微镜_图文讲解
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课件一-激光共聚焦扫描显微镜原理功能
研究生细胞生物学技术
--基本原理及实例应用
李真 西7-103 2015-10
一种观察工具，需要前面的实验做基础
免疫组化、细胞化学、原位杂交、细胞转染……
什么是LSCM 用来做什么
它和荧光显微镜的关系？ 它和电子显微分
显微镜（Microscope）
泛指将微小(分辨率0.2μM)不可见或难见物 品之影像放大 ,而能被观察的工具。
XYZ扫描 XYT扫描
胚胎的结构
切片分层叠加
单层面扫描
多层叠加
耳蜗基底膜
三 维 图 像 重 建
三 维 图 像 重 建
激光共聚焦显微镜的功能
✓ 使用能量稳定的激光作为光源，且各种参数可调。 ✓ 荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标
记蛋白的表达量成正相关。 ✓ 同一个光学条件下，应用相同的荧光探针，通过
优势
局限
高垂直分辨率
沿Z轴逐层扫描，经过计算机处理成为 三维图像。
高水平分辨率
• 人眼分辨率：0.20 mm • 光学显微镜分辨率：0.25 mm • 共焦显微镜分辨率：0.18 mm • 电子显微镜分辨率： 0.20 nm
共聚焦显微镜的分辨率理论极 限大约是0.15 mm，轴向分辨率 0.5 mm。
扫描
移动激光扫描器，逐点扫描
不在焦平面 的发射光
分光镜
物镜 激发光线
/theory/
荧光显微镜系统
一 次 性成 成像 像技
术 ，
CCD
X光机
样品
断层扫描技术， 逐点逐行扫描成像
CT机
激光扫描共聚焦系统
特点： 侧面有扫描器接口； 装有微量步进马达； 装有防振动装置； 装有光路转换装置； 配高数值孔径的物镜。
--基本原理及实例应用
李真 西7-103 2015-10
一种观察工具，需要前面的实验做基础
免疫组化、细胞化学、原位杂交、细胞转染……
什么是LSCM 用来做什么
它和荧光显微镜的关系？ 它和电子显微分
显微镜（Microscope）
泛指将微小(分辨率0.2μM)不可见或难见物 品之影像放大 ,而能被观察的工具。
XYZ扫描 XYT扫描
胚胎的结构
切片分层叠加
单层面扫描
多层叠加
耳蜗基底膜
三 维 图 像 重 建
三 维 图 像 重 建
激光共聚焦显微镜的功能
✓ 使用能量稳定的激光作为光源，且各种参数可调。 ✓ 荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标
记蛋白的表达量成正相关。 ✓ 同一个光学条件下，应用相同的荧光探针，通过
优势
局限
高垂直分辨率
沿Z轴逐层扫描，经过计算机处理成为 三维图像。
高水平分辨率
• 人眼分辨率：0.20 mm • 光学显微镜分辨率：0.25 mm • 共焦显微镜分辨率：0.18 mm • 电子显微镜分辨率： 0.20 nm
共聚焦显微镜的分辨率理论极 限大约是0.15 mm，轴向分辨率 0.5 mm。
扫描
移动激光扫描器，逐点扫描
不在焦平面 的发射光
分光镜
物镜 激发光线
/theory/
荧光显微镜系统
一 次 性成 成像 像技
术 ，
CCD
X光机
样品
断层扫描技术， 逐点逐行扫描成像
CT机
激光扫描共聚焦系统
特点： 侧面有扫描器接口； 装有微量步进马达； 装有防振动装置； 装有光路转换装置； 配高数值孔径的物镜。
共聚焦激光扫描PPT课件
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4
共聚焦显微镜的优点
减少由于光散射产生的图像模糊 增加有效分辨率 提高信噪比 厚标本的清楚细查 Z轴扫描 可以实现数字放大倍率的调节
.
5
Wide-field microscopy
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6
Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Excitation Diaphragm Excitation Filter
12
基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术
探测器 激光束
小孔
聚焦透镜 分光器
光学扫描 物镜
组织样品
Quarter Wave Plate 窗口
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13
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14
色素痣
A
明亮的黑素细胞巢围绕真 皮乳头呈圆形或椭圆形分布， 细胞形态规则，大小及明亮度 均一。细胞间有间隔。
B
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15
对皮肤疾病的治疗与疗效评估需 要先进的皮肤诊断技术
Emission Filter
Emission Filter Emission Pinhole
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10
原理示意图
光源（激光） 二色镜。 物镜 样品 针孔 检测仪 共焦显微镜的最大优点是可以只 从一个平面收集光。 针孔同焦平面成对（即共焦）， 使得来自焦平面以外的光远离检 测仪。 激光扫描显微镜按顺序一点一点 地、一行一行地扫描样品，将象 素资料合成一个图象。通过移动 焦平面，单个图象（光限幅）可 以放在一起，形成可以以后进行 数字处理的三维栈。
Ocular
Emission Filter
.
7
Confocal microscopy
.
8
Confocal Principle
激光扫描共聚焦显微镜
都是DNA特异性的荧光染料，细胞毒性小，特异性强，专一性地与DNA 相结合，与DNA结合后都是以紫外光激发，发射明亮的蓝色荧光，
分辨率高
免疫荧光标记技术
• 免疫荧光技术是将抗体（或抗原）标记上荧光素（例如 FITC )，它与细胞或组织内相应抗原（或抗体）结合后， 通过观察、检测特征的荧光，定性、定位及定量地检测样 品中的抗体。免疫荧光技术的优点是其具有免疫反应的特 异性，又结合了荧光检测的敏感性
•注：动态监测过程需要连续采集一个固定视野的图像，因此 在离子测定时要求细胞贴壁牢固，监测期间不发生移位现象， 否则，不易的到好的定量结果。
常见的应用和方法
用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸 激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的
分布特征及含量，即实现定位，定性及定量检测 核酸 常用：细胞核定位及形态学观察 染色体观察等 前提：需将核酸用荧光探针标记 常用荧光探针： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 等
激光扫描 共聚焦显微镜
简介
• 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起 来的一项具有划时代意义的高科技新产品，它是 在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置， 利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率 提高了30%~40%，使用紫外或可见激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光 图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值， 膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态 学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等 领域中新一代强有力的研究工具，是目前生物医 学领域中最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。
• 另一方面，样品也会受到同一焦平面上的 临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对 比度降低，这被称为侧向（XY）干扰
分辨率高
免疫荧光标记技术
• 免疫荧光技术是将抗体（或抗原）标记上荧光素（例如 FITC )，它与细胞或组织内相应抗原（或抗体）结合后， 通过观察、检测特征的荧光，定性、定位及定量地检测样 品中的抗体。免疫荧光技术的优点是其具有免疫反应的特 异性，又结合了荧光检测的敏感性
•注：动态监测过程需要连续采集一个固定视野的图像，因此 在离子测定时要求细胞贴壁牢固，监测期间不发生移位现象， 否则，不易的到好的定量结果。
常见的应用和方法
用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸 激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的
分布特征及含量，即实现定位，定性及定量检测 核酸 常用：细胞核定位及形态学观察 染色体观察等 前提：需将核酸用荧光探针标记 常用荧光探针： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 等
激光扫描 共聚焦显微镜
简介
• 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起 来的一项具有划时代意义的高科技新产品，它是 在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置， 利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率 提高了30%~40%，使用紫外或可见激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光 图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值， 膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态 学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等 领域中新一代强有力的研究工具，是目前生物医 学领域中最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。
• 另一方面，样品也会受到同一焦平面上的 临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对 比度降低，这被称为侧向（XY）干扰
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1ppt课件
Pathway415、 Pathway435 800系列
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
FV1000 尼Ul康tra（Vnieikwo™n）C1-plus
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
精选课件PPT
精选课件PPT
35
荧光光谱
精选课件PPT
36
精选课件PPT
37
分隔发射的荧光
精选课件PPT
38
Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filters
精选课件PPT
39
（四）计算机系统
控制硬件的软件功能：
①控制电动显微镜； ②选择激光波长，调节激光强度； ③拍摄2-5维图像； ④选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光 挡片位置。
（10）、可即时或延时进行扫描
ROI(region of interesting，感兴趣区域） 实时（real time）显示
（11）、有线和帧方式的多重扫描功能
精选课件PPT
27
（12）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无 须很复杂地对仪器参数重新设置
（13）、有记忆功能
（14）、有专用的图象数据库 （15）、系统采用模块化设计，便于整个系统 的扩展和升级换代
有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；
⑾具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能
量共振转移）软件包。 精选课件PPT
41
精选课件PPT
42
三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤
（一）样品制备
激光共聚焦技术优秀课件
荧光样品的制备要求
荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确 保持样品应有的结构形态完整性 荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性 荧光强度适宜 荧光稳定性好 样品的荧光分布均匀 两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉
可以消除 图象背景干净、干扰杂质少
荧光探针的种类及应用
原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚 细胞形态结构
图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定 酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒PCR产物
目的蛋白细胞器定位观察
含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞
(1)将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 μL分别 加入1.5 mL离心管中，分别加入500 μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。 (2) 分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。 (3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。 (4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。 (5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。 (6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水 培养16小时。
激光共聚焦显微镜基本操作
获取共焦图像的步骤
在 VIS 模式中观察样品 装入 LSM 配置 扫描图像 保存图像
不同厚度光切图像
Z轴扫描
Z轴扫描、时间系列扫描
时间系列扫描
Z轴扫描＋时间系列扫描
组织和细胞样品中荧光的来源
自发荧光 荧光染色 免疫荧光－荧光抗体法产生荧光 外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光 酶致荧光
成为形态学、分子细胞生物学、神经 科学、药理学和遗传学等领域中新的 有力研究工具。
《激光共聚焦简化》课件
显微镜设置与校准
激光器选择
根据所使用的荧光染料选 择适当的激光器波长。
滤色片配置
选择合适的滤色片以减少 背景噪声并提高信噪比。
校准与调整
确保显微镜的焦距、放大 倍数和视野等参数设置正 确，以便获得清晰的图像 。
图像采集与处理
采集模式选择
图像处理
根据观察需求选择单帧采集、多帧平 均或实时扫描模式。
技术培训
参加相关技术培训，提高操作和维护显微镜的能 力。
05 案例展示与解析
细胞生物学研究案例
细胞骨架结构观察
利用激光共聚焦显微镜技术观察细胞 骨架的动态变化，解析细胞生长、分 裂和迁移过程中的骨架重构过程。
细胞器定位与功能研究
通过共聚焦显微镜对细胞内特定细胞 器进行高分辨率成像，分析其在细胞 代谢、信号转导等方面的功能。
《激光共聚焦显微镜技术简 化操作与解析》
contents
目录
• 激光共聚焦显微镜简介 • 激光共聚焦显微镜操作流程 • 激光共聚焦显微镜解析技术 • 激光共聚焦显微镜的维护与保养 • 案例展示与解析
01 激光共聚焦显微 镜简介
定义与工作原理
定义
激光共聚焦显微镜是一种光学显微镜技术，利用激光作为光 源，通过共聚焦方式获取样品的高分辨率、高对比度图像。
优点
色彩复原技术能够提供高对比度和高 分辨率的图像，同时能够选择性地标 记和染色细胞或组织的特定结构，有 助于研究者更深入地了解细胞或组织 的生理和病理变化。
缺点
由于荧光染料可能会对细胞或组织产 生一定的毒性作用，因此需要严格控 制染料的浓度和作用时间。
定量分析技术
01 02
定量分析技术
利用激光共聚焦显微镜的定量分析软件，对获取的图像进行定量分析和 数据提取。这种技术能够提供更准确和可靠的实验数据，有助于研究者 更深入地了解细胞或组织的生理和病理变化。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
扫描速度与分辨率设置
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
激光扫描共聚焦显微镜图文讲解
激光扫描共聚焦显微镜吴旭2008.10.14高级显微镜原理正置、倒置显微镜细胞遗传工作站活细胞工作站激光显微分离系统激光共聚焦显微镜概述激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocalmicroscope ，LSCM ）生物医学领域的主要应用通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测……Conventional fluorescence microscope Confocal microscope历史1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。
1967年，Egger 和Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。
1977年，Sheppard 和Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。
1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。
1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。
Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987Zeiss 、Leica 、Meridian 、OlympusZeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Nikon A1R 激光扫描共聚焦显微镜Prairie UltimaIV 活体双光子显微镜国家光电实验室（武汉）自制随机定位双光子显微镜Leica TCS SP5 激光共聚焦扫描显微镜基本原理相差、DIC 常用荧光标记共聚焦原理Two ways to obtain contrast in light microscopy. The stained portions of the cell in(A reduce the amplitude of light waves of particular wavelengths passing through them.A colored image of the cell is thereby obtained that is visible in the ordinary way. Light passing through the unstained, living cell (B undergoes very little change in amplitude, and the structural details cannot be seen even if the image is highly magnified. The phase of the light, however, is altered by its passage through the cell, and small phase differences can be made visible by exploiting interference effects using a phase-contrast or a differential-interference-contrast microscope.D. Phase-contrast or adifferential-interference-contrast microscopeFour types of light microscopy. (A The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, atechnique known as bright-field microscopy.The other images were obtained by techniques discussed in the text: (B phase-contrast microscopy, (C Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D dark-field microscopy.常用荧光探针Proteins Nucleic Acids DNA Ions pH Sensitive Indicators Oxidation States Specific Organelles荧光显微镜原理明场：透射荧光：落射落射的优点：物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
7
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
1
2
目录
01 原理 02 应用
2
01 原理
3
4
荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
17
18
Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
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弧灯 膜
目镜
孔
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02 应用
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荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
荧光共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦荧光显微镜 (laser scanning confocal microscopy,LSCM)
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目录
01 原理 02 应用
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01 原理
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荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。 当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射 线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发 出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波 段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立 即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
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Conversion of azide to primary amine via Staudinger
reaction in metal-organic fracile conversion of azide to primary amine in metalorganic frameworks (MOFs) was accomplished by Staudinger reduction. After the reaction, MOFs retained high crystallinity confirmed by X-ray diffraction patterns, meaning a high usability of this method for postsynthetic modification of MOFs. Bulky phosphine groups provided surface-selective modification of MOFs via a reaction between resulting amine groups of MOF and activated ester with fluorescein, illustrated by confocal laser scanning microscope (CLSM) observation. This method opens up new possibilities for the preparation of MOFs having core-shell structures.
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
18Biblioteka THANK YOU19
7
只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
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弧灯 膜
目镜
孔
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02 应用
10
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12
Phe
红树植物秋茄
与GC-MS检测浓度相符
Pyr
12
13
黑麦草
洋葱
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北京化工 大学
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15
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16
A surfactant template-assisted strategy for synthesis of ZIF-8 hollow nanospheres
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(a) Preparation process for HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres. (b,c) CLSM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm). (d,e) SEM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm; scale bar 100 nm).
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荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
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A colored image of the cell is thereby obtained that is visible in the ordinary way. Light passing through the unstained, living cell (B undergoes very little change in amplitude, and the structural details cannot be seen even if the image is highly magnified. The phase of the light, however, is altered by its passage through the cell, and small phase differences can be made visible by exploiting interference effects using a phasecontrast or a differential-interference-contrast microscope.
The unique scanning module is thecore of the LSM 510 META.
It contains motorized collimators, scanning mirrors,individually adjustable and positionablepinholes, and highly sensitive detectors including the META detector.
Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987
Zeiss 、Leica 、Meridian 、Olympus
Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜
Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜
D. Phase-contrast or a
differential-interferencecontrast microscope Four types of light microscopy. (A The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, atechnique known as bright-field microscopy.The other images were obtained by techniques discussed in the text: (B phase-contrast microscopy, (C Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D dark-field microscopy.
Two ways to obtain contrast in light microscopy. The stained portions of the cell in
(A reduce the amplitude of light waves of particular wavelengths passing through them.
激光扫描共聚焦显微镜 吴旭 2008.10.14 高级显微镜原理 正置、倒置显微镜 细胞遗传工作站 活细胞工作站 激光显微分离系统 激光共聚焦显微镜 概述 激光扫描共聚焦显微镜 （Laser scanning confocalmicroscope， LSCM ） 生物医学领域的主要应用 通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水 平结构功能研究 高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构 和功能的分析检测 ……
Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜
Nikon A1R 激光扫描共聚焦显微镜
Prairie UltimaIV 活体双光子显微镜
国家光电实验室（武汉）自制随机定位双光子显微镜
Leica TCS SP5激光共聚焦扫描显微镜
基本原理 相差、 DIC 常用荧光标记 共聚焦原理
1977 年， Sheppard和 Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性 关系和激光扫描器的拉曼光谱学。
1984 年， Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为 SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。 1986 年 MRC-500 型改进为光束扫描，用作生 物荧光显微镜的共聚焦系统。
Conventional fluorescence microscope Conin Minsky 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美 国的专利。
1967 年， Egger 和 Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。
由于 pinhole 的存在，使得部分杂散光（虚线部分）没有被 PMT 探测器探测 到，从而提高了成像效果。 通过对样品在 x-y 方向上的逐点扫描，可以形成二维 图像。如果调解焦平面在 z 方向的位置，连续扫描多个不同 z 位置的二维图像，则 可以形成一个 3D 图像， 3D
的重建需要软件的支持。
常用荧光探针 Proteins Nucleic Acids DNA Ions pH Sensitive Indicators Oxidation States Specific Organelles
荧光显微镜原理
明场：透射 荧光：落射 落射的优点： 物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。 激发光损失小，荧光 效应高。 共聚焦原理
The unique scanning module is thecore of the LSM 510 META.
It contains motorized collimators, scanning mirrors,individually adjustable and positionablepinholes, and highly sensitive detectors including the META detector.
Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987
Zeiss 、Leica 、Meridian 、Olympus
Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜
Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜
D. Phase-contrast or a
differential-interferencecontrast microscope Four types of light microscopy. (A The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, atechnique known as bright-field microscopy.The other images were obtained by techniques discussed in the text: (B phase-contrast microscopy, (C Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D dark-field microscopy.
Two ways to obtain contrast in light microscopy. The stained portions of the cell in
(A reduce the amplitude of light waves of particular wavelengths passing through them.
激光扫描共聚焦显微镜 吴旭 2008.10.14 高级显微镜原理 正置、倒置显微镜 细胞遗传工作站 活细胞工作站 激光显微分离系统 激光共聚焦显微镜 概述 激光扫描共聚焦显微镜 （Laser scanning confocalmicroscope， LSCM ） 生物医学领域的主要应用 通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水 平结构功能研究 高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构 和功能的分析检测 ……
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国家光电实验室（武汉）自制随机定位双光子显微镜
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基本原理 相差、 DIC 常用荧光标记 共聚焦原理
1977 年， Sheppard和 Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性 关系和激光扫描器的拉曼光谱学。
1984 年， Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为 SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。 1986 年 MRC-500 型改进为光束扫描，用作生 物荧光显微镜的共聚焦系统。
Conventional fluorescence microscope Conin Minsky 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美 国的专利。
1967 年， Egger 和 Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。
由于 pinhole 的存在，使得部分杂散光（虚线部分）没有被 PMT 探测器探测 到，从而提高了成像效果。 通过对样品在 x-y 方向上的逐点扫描，可以形成二维 图像。如果调解焦平面在 z 方向的位置，连续扫描多个不同 z 位置的二维图像，则 可以形成一个 3D 图像， 3D
的重建需要软件的支持。
常用荧光探针 Proteins Nucleic Acids DNA Ions pH Sensitive Indicators Oxidation States Specific Organelles
荧光显微镜原理
明场：透射 荧光：落射 落射的优点： 物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。 激发光损失小，荧光 效应高。 共聚焦原理