亲水色谱固定相研究进展

亲水色谱固定相研究进展
【摘要】：亲水作用色谱（Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）作为一种新型的色谱分离技术，在分离极性化合物方面作用显著，被广泛的应用于药物分析、食品检验、代谢组学、蛋白组学等领域。

固定相作为色谱发展和应用的基础，对色谱的分离性能有着重要的影响。

本文通过对HILIC固定相的组成、结构和性能等进行了综述，为HILIC的应用提供理论支持。

【关键词】：亲水色谱；固定相；强极性化合物
色谱分离技术已经有100多年的历史，反相色谱是应用最为广泛的分离模式，大部分的化合物在反相色谱柱上都能够实现分析与分离，这种分离的实现主要依靠的是疏水固定性与溶质之间的疏水相互作用实现对极性和中等极性化合物的高效分离，但是强极性和亲水性化合物在反相柱上却无法保留。

正相色谱和离子交换色谱可以部分补充反相色谱的不足，但是由于各自应用的局限性使得分离技术没有得到很大的突破[1]。

亲水色谱作为一种新型的分析模式，采用的是正相的固定相，反向的流动相，流动相中有机相的比例占60%-95%。

由于采用了反相的流动相体系，有效的改善了正相色谱应用中样品溶解度差的问题，在分析极性和亲水物质方面有着极大的优势[2]。

HILIC有很好的保留和分离选择性、水溶性样品溶解性好、保留时间不受流动相水含量的影响以及与质谱检测能够有效兼容等优势受到了研究者青睐，在药品分析和食品检验等领域应用广泛。

随着药品和食品标准的提高、各项组学技术的快速发展以及色谱连用技术的迅速崛起，极性化合物的有效分离和检测受到了越来越多的关注[3]。

1990年，Alpert[4]提出了HILIC的概念，同时他在试验中发现了氨基酸反相和亲水洗脱顺序的差异性。

2006年，Hemstrom和Ingum[5]对HILIC的分离机理、分离材料和各方面的综合应用进行了全面综述，发现占主导的保留机理与溶质的性质和使用的固定相密切相关。

2010年，McCalley[1]的实验结果表明，HILIC是一个包含分配、吸附和离子交换作用在内的复合的保留机理，有的甚至还存在憎水作用。

HILIC固定相的主要特征是固定相表面与水有很好亲和性的强极性基团，比如氨基、酰胺基等[6]。

最开始的HILIC是在正相色谱基础上实现的，如硅胶、氨基键合硅胶、二醇基键合硅胶等。

近年来，随着研究的深入，不同功能基团的HILIC技术得到了快速发展。

由于不同固定相的HILIC柱
保留性质存在的较大的差异，为了更好的选择应用HILIC柱，本文主要从HILIC 固定相的种类、结构和保留特性等方面进行综述。

1.未修饰硅胶固定相
生物学领域最常用的是未修饰的硅胶柱（图1），硅胶表面的硅羟基具有很好的极性和亲水性，可以直接用作HILIC固定相。

根据所分析物质的类型、流动相的组成等选用具有分配、吸附和离子交换等不同作用机理的硅胶柱。

硅胶的制备方法的差异会使得它在HILIC固定相应用上的差异性。

碱性硅酸盐溶液沉淀的方法制备得到的硅胶中存在金属杂质较多，不适合做固定相，硅溶胶在空气中凝结成形的方法制备得到的硅胶金属杂质含量小，稳定性好，可用作固定相[7]。

图1 未修饰硅胶结构
硅胶的硅氢化过程改变了硅胶的基本性质，将硅氧化硅胶表面引入一些弱极性或非极性基团可以增加硅胶的疏水性，能够对弱极性化合物的分离提供新的选择性。

这种疏水性改性使得硅氢化硅胶显示出一些独特的性质，通常会产生双保留机理，而未经改性的硅氢化硅胶在模式下表现出非常弱的选择性和保留，但是在HILIC模式下，它对强极性化合物的选择性和保留较强—。

不同生产厂家由于所使用的硅胶材料、制备方法等的不同使得未修饰硅胶柱在分析物的保留、柱效和峰形上有很大差异[8]。

由于硅胶表面没有修饰层，因而硅胶的表面吸附活性、表面结构不均匀性和硅羟基的酸性使色谱峰形和分离重复性产生一定的问题。

有些分析物例如碳水化物，在硅胶柱上显示出峰拖尾和不规则吸附，并且保留的重现性也不是很好，这可能与硅氢化硅胶表面的极性减弱，对水的吸引力减弱有关。

硅胶表面没有修饰层使得纯硅胶固定相在HILIC模式下不具备很好的使用寿命。

因此，硅胶和杂化硅胶固定相用于HILIC模式时，溶质保留时间较短，分离重复性不是很好，适用范围有限[9-10]。

2.极性基团键合硅胶固定相
2.1传统极性基团键合硅胶固定相
2.1.1氨基键合相
氨基键合相（图2）对糖、有机酸、核苷等强极性化合物的分离选择性很好，从1970年到目前为止仍被广泛用于糖类的分析。

氨基柱对酸性化合物有较强的保留和特殊的亲和力，这可能与氨基的弱碱性在色谱分离过程中表现出一定的离子交换作用有关。

离子交换作用的存在对于HILIC固定性的选择性有积极的作用，但是由于流动相平衡时间较长，不可逆吸附和键合相的流逝，容易造成酸性化合物的保留时间过长或者峰形拖尾等问题，氨基柱的柱效和分离效率相对较低[11]。

图2 氨基键合相
2.1.2二醇基和氰基键合相
二醇基键合硅胶相（图4）通常包含中性的、亲水性的，二羟丙基链，通常用于分离蛋白和低分子量的苯酚化合物。

与未修饰硅胶相比，它具有硅胶高的极性和形成氢键的能力，但是不存在可离子化的基团，避免了离子交换和不可逆吸附作用。

与氨丙基硅胶柱相比，二醇基柱在酸性条件下可以缓慢的释放、伸展键合相，使多糖异构体和有不同环结构的多糖得到分离[12]。

交联的二醇硅胶相比未交联的二醇硅胶相有更好的水解稳定性、更强的憎水性、更好的峰形和分离度。

氰丙基硅胶（图3）色谱开始使用的时间较早，但是目前已经很少用于实验研究中，这可能与缺少形成氢键的能力有关。

文献报道氰丙基硅胶在高有机溶剂水流动相中，极性化合物的保留很弱。

在HILIC条件下，氰丙基硅胶相的机械稳定性会变差。

由于氰丙基硅胶存在着这些诸多问题，限制了它的使用[13]。

图3氰基键合相
图4二醇基键合相
2.2改良的极性基团键合硅胶固定相
RPLC基础上发展起来的传统正相色谱固定相虽然能够直接用于HILIC模式，但是在亲水性、选择性、重复性和使用寿命方面存在很多问题[13]，其应用范围有限。

因此新型的专们用于HILIC固定相材料的出现和发展迅速，在HILIC 柱上得到了很好的应用。

2.2.1酰胺键合相
酰胺基团通过一个短的烷基链键合在硅胶表面形成了酰胺类型的固定相（图5），一般用于分析低聚糖、糖蛋白、苷类等亲水性或两性聚合物的样品。

酰胺柱与未修饰硅胶柱相比，对强极性化合物的保留效果更好，与氨基硅胶柱相比，不受离子交换作用的影响，几乎不会产生不可逆吸附作用，分析样品的稳定性较好，可离子化样品也不会受到离子交换作用的影响[14]。

同时，由于氨基酰胺柱分析过程中不需要离子化流动相，因此液质联用的分析，不会影响样品的离子化过程。

图5 酰胺型键合相
2.2.2醇羟基键合相
醇羟基良好的极性和亲水性、低反应活性、稳定性好等优点，适合应用于亲水色谱固定相中，通常用于分离糖、氨基酸、肽等多种强极性样品。

与传统的二元醇羟基固定相对比，多元醇羟基固定相的分离效果更好，选择性更强，这与多元醇羟基特异的空间结构有关[15]。

醇羟基的HILIC固定相主要有单羟基固定相、多元羟基固定相、环糊精固定相（ClickCD）、葡萄糖固定相（Click Glucose）
和麦芽糖固定相（Click Maltose）[16]等。

环糊精是应用较为广泛的HILIC固定相。

环糊精分子具有亲水的外表面和疏水的内腔，其分子呈上宽下窄、两端开口、中空的筒状物，腔内部呈相对疏水性，而所有羟基则在圆锥体上下边缘的外部，使得外表面呈相对亲水性。

主要用于分离糖醇、单糖、寡糖和极性化合物。

Click CD（图6）除了具有HILIC所有特性，还表现出反相/亲水作用混合色谱模式的保留行为，对弱极性化合物有反相色谱的作用。

与TSK-GEL Amide-80相比，Click CD对氨基酸的保留效果、稳定性和重现性更好。

环糊精柱和硅胶柱联合使用分离了一些在RPLC条件下无法分离的黄酮和异黄酮化合物[17]。

图6 β环糊精结构
2.2.3两性离子固定相
两性离子键合硅胶同时具有正电荷和负电荷中心，其总体的表面电荷效应较小，最初用来分离无机盐和离子化合物，后来被广泛的用于HILIC分离。

磺酸甜菜碱键合硅胶相和磷酰胆碱固定相是较为常用的两性离子键合硅胶相。

磺酸甜菜碱键合硅胶相对水有很强的吸附作用，它被广泛的用于分离小分子极性化合物、代谢产物、硫代葡萄糖苷、氨基糖苷、肽糖肽和其它化合物。

磯酰胆碱固定
相基团的排列顺序与磺酸甜菜碱键合硅胶相不同，因此氨基酸、羧酸等的洗脱顺序在两种两性离子固定性中是不一致的[18]。

2.3其它极性基团改性的硅胶固定相
氟化硅胶键合固定相也可以用于分离芳香胺、卤代芳香化合物和其它极性芳香化合物。

将巯基乙醇和硫代甘油键合在硅胶表面制得巯基乙醇硅胶相和硫代甘油硅胶相可以同时在RPLC和HILIC方面使用，对各种类型样品的分离选择性和洗脱顺序与二醇键合相存在显著差异。

通过反应将各种糖共价键合于硅胶表面，可以制备得到各种糖类固定相，在HILIC条件下，可以分离强极性的氨基酸、糖肽、寡核苷酸和天然产物。

Persson[19]等人发现，在硅胶表面嵌入聚合甲基丙烯酸山梨醇得到的固定相的分离选择性与商用的极性硅胶键合柱、裸硅胶柱相比，显示出巨大的差异。

混合模式的离子交换色谱柱也可用来分离极性、弱极性，甚至非极性化合物[20]。

2.3.有机聚合物基质的固定相
有机聚合物基质固定相表面通常都含有离子交换或两性离子基团，用于分离糖和一些中性化合物。

早期有研究者采用苯乙烯基的阴、阳离子交换树脂在HILIC条件下分离多糖和中性样品，非离子性样品的保留随乙醇水流动相中乙醇浓度的增大而增加，苯乙稀二乙烯基苯树脂柱的柱效较低，分析时间较长，但是分离的选择性却非常高。

表面存在氨基基团的聚合物基质固定相通常被用来分离寡糖和生物材料中的氟尿嘧啶，以及碳水化合物富集体中的牛磺酸和蛋氨酸[21]。

聚合物基质固定相与硅胶固定相相比，重现性好，使用时间长，基线稳定，但是在HILIC条件下使用时，分离效率会显著降低。

作为硅胶柱的补充应用，聚合物基质固定相在强酸或者强碱或者硅胶不能分析分离的条件下会被用来分析分离样品。

有机聚合物整体柱通常是将单体、交联剂、引发剂和致孔剂等注入一个空管模具中，通过光、热等方式引发，在柱内进行原位聚合，反应结束后将致孔剂及其它未反应物质除去，即可得到具有大孔和中孔结构的整体柱。

整体柱的微观结构为相互粘连的聚合物微珠，在这些内粘连的聚合物微珠间存在整体柱特有的大孔-流通孔，分离过程中大部分流动相直接流过大孔通道，只有非常少部分会驻留在介孔或微孔中。

因此，聚合物整体柱非常适合于大分子的快速分离，尤其是
蛋白分子，而小分子会进入纳米尺度的小孔中，在分离过程中很难被洗脱出来，峰展宽现象严重。

聚合物固定相对小分子的分离效果差，柱效低，不适宜用于小分子的分离。

常用制孔剂与强极性单体混溶性差是聚合物整体柱发展受限的主要原因，用极性、亲水性基团对聚合物整体柱进行改性后可以解决这些问题。

Courtois[22]等人将聚乙二醇作为制孔剂的一部分添加到聚合体系中，制得高极性亲水柱，该固定相获得的大孔与蛋白分子兼容，不会引起蛋白的折叠和失活。

Viklund[23]采用光引发共聚反应制备了一种富含磺酸烷基甜菜碱两性离子，可以用于阳离子交换模式分离蛋白的聚合物整体柱。

研究显示聚合时二甲基丙烯酸的浓度和致孔剂溶液的成分可以影响磺酸甜菜碱整体柱的多孔性、渗透性、选择性和保留特性，而且增加温度可以改善分离[24]。

有机聚合物整体柱在HILIC条件下还可以应用于毛细管电色谱，并且显示出高的柱效。

Li[25]等人在石英毛细管的内壁上进行热聚合得到了两性毛细管整体柱，对于中性、碱性和酸性极性物质的分析效果较好。

3.总结与展望
针对各类强极性样品的分离问题，结合HILIC模式的分离特性，设计和制备结构新颖的极性固定相仍是未来HILIC研究的重要方向。

HILIC模式的分离机理不是十分明确，存在着多种复杂的相互作用。

溶质除了在流动相和固定相表面水层中的分配作用以外，还存在与固定相直接的相互作用。

由于键合相的结构直接影响溶质与固定相的相互作用，而相互作用不仅决定色谱保留特性，而且对色谱分离效率也产生重要影响，因此HILIC固定相的发展除了需要考虑键合相结构对保留特性影响之外，还需要兼顾键合相结构对分离效率的影响，期望发展出适用范围广的HILIC固定相。

文献报道，HILIC能够与溶质分子发生静电相互作用，溶质分子与固定相之间也存在着直接的氢键作用和偶极作用。

HILIC固定相的种类繁多，不同HILIC固定相具有不同的选择性和适用范围，而对HILIC固定相的保留特性缺乏系统的研究，因此选择“合适”的HILIC 色谱柱十分困难。

对HILIC色谱柱的评价方法和标准评价样品并不一致，很多色谱生产厂家给出的色谱柱评价采用的也仅是几个样品的检验结果，不能全面反映色谱柱的特性。

因此后续的研究应更多的关注HILIC色谱固定相的评价标准的建立。

【参考文献】
[1]Mccalley D V. The challenges of the analysis of basic compounds by high performance liquid
chromatography: some possible approaches for improved separations.[J]. 2010, 1217(6):858-880.
[2]NovákováL, HavlíkováL, VlčkováH. Hydrophilic interaction chromatography of polar
and ionizable compounds by UHPLC[J]. Trac Trends in Analytical Chemistry, 2014, 63:55-64.
[3]郭志谋, 张秀莉, 徐青,等. 亲水作用色谱固定相及其在中药分离中的应用[J]. 色谱,
2009, 27(5):675-681.
[4]Alpert A J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic
acids and other polar compounds.[J]. Journal of Chromatography A, 1990, 499(2):177-196.
[5]Hemström P, Irgum K. Hydrophilic interaction chromatography.[J]. Journal of Separation
Science, 2006, 29(12):1784.
[6]Buszewski Bogusław, Noga Sylwia. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)
—a powerful separation technique[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 402(1):231-47.
[7]Dejaegher B. HILIC methods in pharmaceutical analysis.[J]. Journal of Separation Science,
2010, 33(6-7):698.
[8]Spagou K, Wilson I D, Masson P, et al. HILIC-UPLC-MS for Exploratory Urinary Metabolic
Profiling in Toxicological Studies[J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(1):382-390.
[9]Li R, Huang J. Chromatographic behavior of epirubicin and its analogues on high-purity
silica in hydrophilic interaction chromatography.[J]. Journal of Chromatography A, 2004, 1041(1-2):163-169.
[10]Jandera P. Stationary phases for hydrophilic interaction chromatography, their
characterization and implementation into multidimensional chromatography concepts.[J].
Journal of Separation Science, 2008, 31(9):1421-37.
[11]Yeung E S. 24th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations
and Related Techniques - Part I - Seattle, WA, USA, 24-30 June 2000 - Foreword[J]. Journal of Chromatography A, 2001, 913(1-2):1-2.
[12]Strege M A. Hydrophilic interaction chromatography-electrospray mass spectrometry
analysis of polar compounds for natural product drug discovery.[J]. Analytical chemistry, 1998, 70(13):2439-45.
[13]Mcnulty D E, Annan R S. Hydrophilic Interaction Chromatography for Fractionation and
Enrichment of the Phosphoproteome[M] Phospho-Proteomics. Humana Press, 2009:93-105.
[14]Berthod A, Wang X, Gahm K H, et al. Quantitative and stereoisomeric determination of light
biomarkers in crude oil and coal samples[J]. Geochimica Et Cosmochimica Acta, 1998, 62(9):1619-1630.
[15]Li X, Xu J, Jiang Y, et al. Hydrophilic-interaction liquid chromatography (HILIC) with dad
and mass spectroscopic detection for direct analysis of glyphosate and glufosinate residues and for product quality control.[J]. Acta Chromatographica, 2009, 21(4):559-576.
[16]徐雪峰, 沈爱金, 郭志谋,等. 基于巯基-烯点击化学法的β-环糊精固定相多模式色谱保
留行为研究[J]. 色谱, 2013, 31(3):185-190.
[17]沈爱金, 郭志谋, 梁鑫淼. 亲水作用色谱固定相的发展及应用[J]. 化学进展, 2014,
26(1):10-18.
[18]Viklund C, Anders Nordström A, Irgum K, et al. Preparation of Porous
Poly(styrene-co-divinylbenzene) Monoliths with Controlled Pore Size Distributions Initiated by Stable Free Radicals and Their Pore Surface Functionalization by Grafting[J].
Macromolecules, 2001, 34(34):4361-4369.
[19]Persson J P, Hemstrom P H, Irgum K. STATIONARY PHASE FOR HYDROPHILIC
INTERACTION CHROMA TOGRAPHY:, US20090294362[P]. 2009.
[20]Jiang W, Fischer G, Girmay Y, et al. Zwitterionic stationary phase with covalently bonded
phosphorylcholine type polymer grafts and its applicability to separation of peptides in the hydrophilic interaction liquid chromatography mode.[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1127(1-2):82.
[21]刘丹. 有机聚合物整体柱的改性及在样品预处理中的应用[D]. 吉林大学, 2016.
[22]Courtois J, Byström E, Irgum K. Novel monolithic materials using poly(ethylene glycol) as
porogen for protein separation[J]. Polymer, 2006, 47(8):2603-2611.
[23]Viklund C, Anna Sjögren A, Irgum K, et al. Chromatographic Interactions between Proteins
and Sulfoalkylbetaine-Based Zwitterionic Copolymers in Fully Aqueous Low-Salt Buffers[J].
Analytical Chemistry, 2001, 73(3):444-52.
[24]李钰鑫. 新型磺酸基甜菜碱硅胶杂化整体柱的制备及应用[D]. 湖南师范大学, 2013.
[25]李金祥, 王晨雪, 佟艳辉. 一种极性毛细管整体柱的制备及其在酚类化合物萃取中的应
用[J]. 鲁东大学学报(自然科学版), 2013, 29(2):129-133.。