论DHPLC技术在基因突变检测上的应用
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样本准备注意事项1. 样品制备和预处理DHPLC突变检测原理是依据DNA同源双链和杂合双链从色谱柱上的洗脱时间不一进行分离。
纯合突变产物与野生型PCR产物的DHPLC色谱图峰型相似，不易被识别鉴定，只有杂合双链DNA分子（即DNA分子一条单链含突变碱基，另一条单链为野生型），才能被灵敏地检出。
DHPLC分析样品是未经纯化的PCR扩增产物，杂合突变样品可直接用于分析，含纯合突变的样品需与野生型样品等量混合，以形成杂合双链。
样品的处理：PCR产物经过95℃变性5min，然后，大约以每分钟降1℃的速度将温至45℃以下，以充分形成杂合双链。
2. DHPLC检测所需要的PCR产物最低进样量DHPLC是一种灵敏的突变检测技术，对PCR扩增的严谨性、特异性要求较高。
PCR产量不足，且特异性差时，DHPLC的色谱图常不易判断；PCR过度扩增时，一方面增加碱基错误掺入的可能性，导致假阳性；另一方面，非特异性扩增产物含量增加，往往导致DHPLC分辨能力的下降，或形成异常峰型，容易导致检测失败。
DHPLC仪器的峰吸收值大于3mV。
在能满足检测所需量的前提下，减少扩增循环数，比如30个循环。
3.PCR产物的大小虽然DHPLC分析的DNA分子的大小为150-800bp，但最合适的片段大小为300bp左右。
为了保证筛查的灵敏度，我们建议您的扩增产物最好为300bp左右。
4.PCR引物设计PCR引物设计遵循一般引物设计原则。
在条件许可下：1 尽量使扩增产物的GC分布比较均匀；2 尽量使GC含量高的区域在扩增片段的两端；3 在检测高GC含量区域的突变时，有时可能需要在引物的5’端加GC夹。
在设计引物时，最好使您感兴趣的区域距扩增片段两端约30-50bp以上。
5.阳性结果的判断由于不含突变位点的PCR产物（野生型PCR产物）只有单一成分（即同源双链DNA分子），DHPLC图谱上呈现为单一峰型（同源双链峰，Homoduplex peak）。
DHPLC系统工作原理及其应用
・综述与专论・生物技术通报B I O TECHNOLO G Y BULL ET I N2006年增刊D HP LC 系统工作原理及其应用李莉 王翀 陈瑶生(华南农业大学动物科学学院,五山 510642) 摘 要: 变性高效液相色谱(DHP LC )是一种高通量筛选DNA 序列变异的新技术,从该仪器设备的组成、工作原理、基本操作方法、主要技术特点等作一综述,并对其在基因组领域的应用如S NP 分析、双链DNA 片段分析、微卫星分析、mRNA 定量分析、引物纯度检测等方面及在医学、遗传学方面的应用作了较详细的综述。
关键词: DHP LC 原理 应用W orki n g Pr i n c i ples and Appli cati on of DHP LC Syste mL i L i W ang Chong Chen Yaosheng(College of A ni m al Science,South China A gricultural U niversity,Guangzhou 510642) Ab s tra c t: Denaturing H igh Perf or mance L iquid Chr omat ography (DHP LC )is a kind of high thr oughout ne w tech 2nique t o detect the mutati on of the DNA sequence .The structure of the instru ment,working Princi p les,basic mani pulating method and main technical characteristic were revie wed .The app licati ons in the medicine,genetics and genome domain such as analysis of S NP,the frag ment of double strains,m icr osatellite,the quantitative mRNA,the pure detecti on of the p ri m e,et al were revie wed in detail .Key wo rd s: DHP LC Princi p le App licati on 基金项目:国家自然科学基金资助(30300249) 作者简介:李莉(19822),女,硕士研究生,专业方向:动物遗传育种与繁殖,电话:020********* 通讯作者:王翀(19682),女,博士,副教授,主要研究方向:分子遗传学,电话:020*********,E 2mail:betty@scau .edu .cn 变性高效液相色谱(denaturing high perf or mance liquid chr omat ography,DHP LC )是一种新的高通量筛选DNA 序列变异的新技术,这一技术最先由美国Stanf ord 大学Oefner 及Underhill 等于1995年报道,美国Transgenom ic 公司采用该原理制造专利化仪器,专利产品为WAVE µDNA 片段分析系统(WAVE µDNA frag ment analysis syste m )。
应用DHPLC技术检测PINK1基因突变的开题报告
应用DHPLC技术检测PINK1基因突变的开题报告一、研究背景和意义帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种神经系统退行性疾病，其发病率随着人口老龄化的加剧而逐年上升，已经成为全球范围内的重要公共卫生问题。
该病的临床特征为肌肉僵硬、震颤、步态不稳、姿势不良以及自主运动缺乏等，严重影响患者的生活质量与预期寿命。
PD的病因尚不清楚，但已经发现与该病相关的遗传学因素。
过去的研究发现，PINK1基因的突变是PD的一个遗传形式。
该基因位于人类第一号染色体上，属于蛋白激酶基因家族，编码的蛋白在线粒体的质量控制过程中发挥重要作用。
同时，突变还与罕见的儿童帕金森患者有关。
因此，检测PINK1基因突变对PD的早期诊断、治疗和遗传咨询具有重要的临床价值。
DNA测序是检测基因突变的常用方法，但其操作过程繁琐、费时费力、成本较高。
随着DHPLC（Denaturing High-performance Liquid Chromatography）技术的发展，其被广泛应用于基因突变检测中。
DHPLC技术可以快速地检测样品中的DNA序列中的突变，具有操作简便、灵敏度高、成本低等优点，逐渐取代了传统的DNA测序技术，成为目前基因突变检测的主要方法之一。
二、研究目的和内容本文旨在应用DHPLC技术检测PINK1基因突变，并探讨该技术在PD遗传检测中的应用价值。
具体内容包括以下几个方面：1. PINK1基因突变与PD遗传相关性的回顾研究；2. DHPLC技术的原理、优点和不足；3. 基于DHPLC技术的PINK1基因突变检测方法的建立和优化；4. 通过不同样本的检测结果比对，评价检测方法的精确度、准确度和可重复性；5. 结论和展望。
三、研究方法1. 样本采集和DNA提取：采用外周血分离法提取样本中的DNA，并通过NanoDrop光谱仪检测DNA的纯度和浓度。
2. DHPLC条件的筛选和优化：优化温度、梯度和缓冲液浓度，建立PINK1基因突变检测的专用检测方法。
DHPLC
变性高效液相（DHPLC）在基因研究方面的应用变性高效液相色谱（Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC）是一种新的高通量筛选DNA序列变异的新技术，这一技术最先由美国Stanford大学Oefner 及Underhill等于1995年报道，美国Transgenomic公司采用该原理制造专利化仪器，专利产品为WAVE® Maker片段分析系统。
1、仪器主要组成部分硬件部分：变性高效液相色谱仪（WAVE 3500HT）：WAVE L7100 型四元梯度溶液注入系统（含四元梯度泵），WAVE L7250 型Peltier可冷却、加热自动进样器，WAVE L73100 型高精度Peltier 柱箱，WAVE L73100型紫外/可见光检测器，WAVE L700在线去气装置：四通道，样品池（可容纳4个96 孔PCR 板，以便进行大规模分析筛查），WAVE® Maker 数据工作站系统（硬件）等。
软件部分：Microsoft windows NT 操作系统，SHMD-7000数据工作站控制接口软件，WAVE® Maker核苷酸片段分析系统专用软件包。
2、DHPLC基本原理用离子对反向高效液相色谱法：⑴ 在不变性的温度条件下，检测并分离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段，类似RFLP分析，也可进行定量RT—PCR 及微卫星不稳定性测定（MSI）；⑵ 在充分变性温度条件下，可以区分单链DNA或RNA分子，适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制；⑶ 在部分变性的温度条件下，变异型和野生型的PCR产物经过变性复性过程，不仅分别形成同源双链，同时也错配形成异源双链，根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离，从而识别变异型。
根据这一原理，可进行基因突变检测、单核苷酸多态性分析SNPs等方面的研究。
临床分子生物学检验技术模拟考试题(附答案)
临床分子生物学检验技术模拟考试题（附答案）一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1、以下不是原癌基因的特点的是A、广泛存在于生物界，是细胞生长必不可少的B、在进化过程中，基因序列呈高度保守性C、通过表达产物DNA来实现功能D、在某些因素的作用下会形成能够致瘤的癌基因E、对正常细胞不仅无害，而且是细胞发育、组织再生、创伤愈合等所必需正确答案：C2、HIV核酸类型是A、单链DNAB、双链DNAC、单正链RNAD、单正链RNA 双聚体E、单负链RNA正确答案：D3、结核分枝杆菌的基因组特征是A、单链DNAB、双链DNAC、单正链RNAD、单正链RNA 双聚体E、单负链RNA正确答案：B4、采用了所谓酶联级联测序技术的测序方法是A、寡连测序B、焦磷酸测序C、化学裂解法测序D、双脱氧终止法测序E、边合成边测序正确答案：B5、由线粒体基因编码的细胞色素C氧化酶亚基数目有A、1个B、2个C、7个D、3个E、13个正确答案：D6、关于支原体的描述错误的是A、支原体是一类在无生命培养基中能独立生长繁殖的最小原核细胞微生物B、支原体有一个环状双链DNAC、以二分裂方式进行繁殖D、其分裂与DNA 复制同步E、解脲脲原体、人型支原体和生殖器支原体均可引起泌尿生殖道感染正确答案：D7、以下不属于DNA分析检测技术的是A、基因芯片B、ASO杂交C、Northern blotD、RFLP分析E、PCR正确答案：C8、下面关于 mtDNA基因突变的说法不正确的是A、同一细胞内所有的mtDNA会发生同样的变异B、同一细胞内的mtDNA会发生不同的变异C、mtDNA一般很难发生改变，一但mtDNA 基因突变就会导致疾病的发生D、点突变是mtDNA 碱基突变的主要形式E、mtDNA拷贝数目会发生改变,也属于 mtDNA 基因突变正确答案：C9、临床常采用的检测 ER、PR的方法是A、细胞学B、生物化学C、生物学D、免疫组织化学E、物理学正确答案：D10、不符合分子诊断特点的是A、检测对象为自体基因B、灵敏度高C、样品获取便利D、易于早期诊断E、特异性强正确答案：A11、第二代测序技术不能应用于A、从头测序、重测序B、转录组及表达谱分析C、小分子RNA研究D、个体基因组测序和SNP研究E、直接测甲基化的DNA序列正确答案：E12、下列哪一项是数字PCR技术与一般PCR技术的不同点A、需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应B、是一种在体外呈指数扩增核苷酸的技术C、每一循环包括高温变性、低位退火、中温延伸三步反应D、需要模板、引物、四种dNTP和Taq酶及Mg²⁺E、扩增的特异性取决于引物与模板 DNA 的特异结合正确答案：A13、最早发现的 Leber遗传性视神经病变 mtDNA 突变是A、ND1G3460AB、ND4 G11778AC、ND6T14484CD、tRNAMet A4435GE、tRNATh"A15951G正确答案：B14、关于测序策略的叙述正确的是A、应该具有最大重叠、最少数量的测序反应B、较小的目的DNA片段(如<1kb)，可以使用引物步移法C、较小的目的DNA片段(如<1kb)，可以使用随机克隆法D、大片段未知序列DNA 测序，可以直接测序E、大规模基因组计划，可以使用多个测序策略正确答案：E15、SELDI-TOF-MS中蛋白质芯片系统主要包含芯片、芯片阅读器和A、荧光检测器B、电泳仪C、质谱仪D、分析软件E、纳米生物传感器正确答案：D16、目前确认与人类肿瘤发生有关的RNA病毒是A、人乳头状瘤病毒B、乙型肝炎病毒C、EB病毒D、人类疱疹病毒-8E、丙型肝炎病毒正确答案：E17、纯DNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.8,可使比值降低的是A、蛋白质B、多糖C、氯仿D、RNAE、乙醇正确答案：A18、PCR中的脱氧核苷三磷酸不包括A、dATPB、dTTPC、dCTPD、dGTPE、dUTP正确答案：E19、下列病毒中，基因组可直接作为mRNA的3种病毒是A、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、流感病毒B、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、麻疹病毒C、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、新型肠道病毒D、脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒、轮状病毒E、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、甲型肝炎病毒正确答案：C20、关于DNA 芯片描述不正确的是A、探针为已知序列B、有序地高密度地固定于支持物上C、理论基础是核酸杂交D、可研究基因序列E、不能研究基因功能正确答案：E21、下列DNA序列中的胞嘧啶易发生甲基化修饰的是A、5'-CCCCCT-3'B、5'-GGGGCC-3'C、5'-CGCGCG-3'D、5'-GCACAC-3'E、5'-CTCTCCC-3'正确答案：C22、细菌产生的能灭活抗菌药物的酶不包括A、氨基糖苷类钝化酶B、氯霉素乙酰转移酶C、红霉素类钝化酶D、β-内酰胺酶E、喹诺酮类钝化酶正确答案：E23、SDS-PAGE 电泳消除或掩盖了不同种类蛋白质间的A、分子大小差异B、电荷差异C、疏水性差异D、氢键差异E、离子键差异正确答案：B24、用于病毒基因突变检测的技术是A、荧光定量PCR技术B、PCR-RFLP技术C、PCR微卫星检测技术D、原位杂交技术E、cDNA表达芯片技术正确答案：B25、编码HIV 衣壳蛋白的是A、pol基因B、vif基因C、env基因D、tat基因E、gag基因正确答案：E26、父母之一是哪种平衡易位携带者时，因活婴将100%为易位型先天愚型患儿，所以应劝阻其生育A、14/21B、13/21C、15/21D、21/22E、21/21正确答案：E27、PCR-ASO描述错误的是A、需要寡核苷酸探针B、检测点突变的技术C、PCR产物必须电泳分离D、需正常和异常两种探针E、需严格控制杂交条件正确答案：C28、在人类基因组中，编码序列占的比例为A、1.5%B、3%C、23%D、5%E、21%正确答案：A29、体细胞中染色体数目为47，称为A、超二倍体B、三体型C、单倍体D、单体型E、三倍体正确答案：B30、生物芯片根据芯片上固定的探针种类不同可分为几种，其中不包括A、DNA芯片B、蛋白质芯片C、细胞芯片D、组织芯片E、测序芯片正确答案：E31、Southern印迹杂交的描述正确的是A、不仅可以检测 DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息B、检测靶分子是RNAC、用于基因定位分析D、用于阳性菌落的筛选E、用于蛋白水平的检测正确答案：A32、首个被证实和克隆的乳腺癌易感基因是A、BRCA1B、BRCA2C、c-erbB-2/HER2D、ATME、p53正确答案：A33、首个报道的由连锁分析得到的前列腺癌易感位点是A、RNASELB、ARC、COX-2D、MSR1E、CDKN1B正确答案：A34、采用PCR-RFLP检测耳聋mtDNA A1555G常用的限制性内切酶是A、BsmAIB、ApaIC、Xba ID、BamHIE、KpnI正确答案：A35、不属于脆性X综合征分子诊断人群的是A、有 FraX体格或性格阳性征象者B、未诊断的 MR家族史C、发育迟缓或自闭症的患者D、没有 FraX家族史E、已明确母亲为携带者的婴儿正确答案：D36、未知突变的检测，下列最准确的方法是A、PCRB、RFLPC、核酸杂交D、序列测定E、ASO正确答案：D37、下列符合肺炎衣原体基因组结构特征的是A、Cpn有3个不同的血清型B、TWAR株基因组 DNA为单链环状结构C、Cpn基因组中存在22个主要外膜蛋白基因的新家族D、Cpn的种特异性抗原为 MOMPE、MOMP抗原与CT和鹦鹉热衣原体抗血清有交叉反应正确答案：D38、在进行多序列对比的多序列联配比对时，常用的程序是A、BLASTB、ClustalWC、EntrezD、SRSE、DBGET/LinkDB正确答案：B39、下列关于 Taq DNA 聚合酶的描述，错误的是A、以dNTPs为原料B、催化形成3'，5'-磷酸二酯键C、使DNA 链沿方向延伸D、不具有外切酶活性E、扩增的DNA片段越长，碱基错配率越低正确答案：E40、转录依赖扩增系统与其他PCR技术的区别是A、模板是 RNAB、模板是 DNAC、引物是 RNAD、模板和产物都是RNAE、需要热循环正确答案：D41、T-ALL中最常见的活化癌基因是A、N-rasB、NOTCH1C、NPMD、FLT3E、C-KIT正确答案：B42、质粒的主要成分是A、DNAB、蛋白质C、多糖D、氨基酸衍生物E、脂类正确答案：A43、以下关于主要组织相容性复合体的描述不正确的是A、基因编码产物称为 MHC抗原B、仅表达于一些免疫相关细胞的表面C、参与抗原提呈D、调节免疫应答E、制约细胞间的相互识别正确答案：B44、下列疾病不可进行基因诊断的是A、组织水肿B、SARS疑似患者C、肿瘤D、艾滋病E、血友病正确答案：A45、下述序列中，在双链状态下属于完全回文结构的序列是A、AGTCCTGAB、AGTCAGTCC、AGTCGACTD、GACTCTGAE、ACTCGACT正确答案：C46、珠蛋白生成障碍性贫血的主要原因是A、珠蛋白链合成速率降低B、出现异常血红蛋白SC、血红蛋白破坏加速D、珠蛋白基因突变导致氨基酸序列改变E、铁代谢异常正确答案：A47、HIV 最易发生变异的部位是A、刺突蛋白B、逆转录酶C、包膜蛋白D、内膜蛋白E、核衣壳蛋白正确答案：A48、p53基因定位于人哪个染色体上A、11q24B、17q20C、12p13D、11q13E、17p13正确答案：E49、其3'羟基末端带有可化学切割部分的dNTP称“可逆终止子”(reversible terminator),使用“可逆终止子”的测序反应是A、焦磷酸测序B、化学裂解法测序C、寡连测序D、双脱氧终止法测序E、边合成边测序正确答案：E50、HIV-1中最易发生变异的基因是A、polB、tatC、gagD、envE、nef正确答案：D51、目前，个体识别和亲子鉴定主要依靠A、STR基因座技术B、PCR-SSO技术C、蛋白质凝胶电泳技术D、PCR-SSCP技术E、细胞混合培养技术正确答案：A52、用于区分HBV主要基因型的序列是A、NS5b区B、C区C、NS3区D、5'UTR区E、NS5a区正确答案：D53、下列关于引物设计的原则中，错误的是A、两条引物的Tm值相差尽量大B、G+C的含量应在45%~55%之间C、尽量避免引物二聚体的出现D、反应体系中引物的浓度一般在0.1~0.2μmol/L之间E、5'端可加修饰基团正确答案：A54、要制订一个能够简洁准确的DNA 测序方案，首先应考虑A、DNA片段大小B、测序方法C、实验条件D、测序目的E、测序时间正确答案：E55、目前已知感染人类最小的DNA病毒是A、HIVB、HPVC、HBVD、HAVE、HCV正确答案：C56、关于BRCAI基因说法正确的是A、位于人染色体2p32上B、编码含1840个氨基酸的蛋白质C、是一种DNA 结合蛋白D、是一种原癌基因，其激活可促进肿瘤的形成E、BRCAI基因的突变使高危家族人群患乳腺癌的危险性比一般人降低8~10倍正确答案：C57、Down综合征为以下哪种染色体数目畸变A、单体型B、单倍体C、三体型D、三倍体E、多倍体正确答案：C58、某位点发生LOH时RF的数值是A、大于0.667且小于1.50B、大于0.667C、小于0.667或大于1.50D、小于1.50E、小于1.40正确答案：C59、HIV结构具有CD4分子受体的部位是A、衣壳B、内膜C、包膜D、刺突E、核酸正确答案：D60、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症遗传方式为A、常染色体显性遗传B、伴性遗传C、X染色体连锁不完全显性遗传D、X染色体连锁不完全隐性遗传E、常染色体隐性遗传正确答案：C61、延伸的温度通常为A、25℃B、55℃C、72℃D、37℃E、95℃正确答案：C62、嵌合型Down综合征患者的核型为A、46,XY,-13,+t(13q21q)B、45,XY,-13,-21,+t(13q21q)C、47,XY,+21D、46,XY/47, XY,+21E、46,XY,-21,+t(21q21q)正确答案：D63、SDS是一种阴离子表面活性剂，其可断开蛋白质分子内和分子间的A、氢键B、离子键C、二硫键D、酯键E、疏水键正确答案：A64、分析 mtDNA A3243G异质性突变的首选检测方法是A、PCR-RFLPB、PCR-DHPLCC、DNA测序D、荧光定量 PCRE、基因芯片正确答案：B65、下列不可以作为核酸探针使用的是A、microRNAB、单链DNAC、寡核苷酸D、mRNAE、病毒RNA正确答案：A66、链霉素的结合靶点是A、糖基转移酶B、DNA旋转酶C、NADHD、核糖体E、DNA 依赖RNA 聚合酶正确答案：D67、MALDI-TOF-MS不能分析糖蛋白的A、糖基化位点B、糖苷键类型C、糖基连接方式D、寡糖序列E、糖苷酶正确答案：E68、由于突变使编码密码子形成终止密码，此突变为A、终止密码突变B、错义突变C、无义突变D、移码突变E、同义突变正确答案：C69、为了保持蛋白质不被蛋白酶水解，常需加入一些蛋白酶抑制剂如A、硫脲B、核酸酶C、DTTD、PMSFE、尿素正确答案：D70、关于 mtDNA密码子描述正确的是A、线粒体基因组密码子与核基因组密码子相同B、人类mtDNA 起始密码子为 AUGC、人类mtDNA 终止密码子是 UGAD、人类mtDNA中AGG是Arg的密码子E、人类 mtDNA 起始密码子为AUA正确答案：E71、采用配体的特异性亲和力分离纯化蛋白的方法是A、盐析B、离心C、凝胶过滤层析D、亲和层析E、离子交换层析正确答案：D72、开展耳聋基因诊断有重要临床意义，但不包括A、可作为听力筛查的一个有效辅助手段B、可以预测耳聋疾病的病情和预后C、可以了解患者发生耳聋的分子病因D、可以预测下一代出现耳聋的概率E、可作为有效治疗耳聋的手段之一正确答案：E73、最早发现与mtDNA突变有关的疾病是A、肿瘤B、Leber遗传性视神经病C、糖尿病D、耳聋E、MELAS 综合征正确答案：B74、以下不需要对引物或探针预先标记的实时定量PCR方法是A、TaqMan水解探针技术B、探针杂交技术C、分子信标技术D、SYBR GreenⅠ荧光染料技术E、数字PCR技术正确答案：E75、SNP的实质不包括A、碱基缺失B、碱基转换C、碱基颠换D、碱基插入E、碱基转录异常正确答案：E76、以下为荧光染料技术的优点，不正确的是A、适合任何一个反应体系B、荧光信号量与PCR反应产物量成正比，可以实时监测C、荧光信号的检测在每一次循环延伸后，简单方便D、不需要进行凝胶分离等二次处理PCR产物，避免污染E、特异性高正确答案：E77、HLAI类抗原特异性取决于A、HLA-AB、HLA-BC、α重链D、β轻链E、染色体正确答案：C78、宫颈癌与HPV病毒感染密切相关，宫颈癌细胞产生的机制是A、HPV DNA 大量复制B、原癌基因被激活C、病毒增殖导致细胞破裂D、HPV导致细胞凋亡E、病毒蛋白在细胞内堆积正确答案：B79、与耳聋有关的最主要的 mtDNA突变是A、点突变B、插入或缺失C、大片段重组D、拷贝数变异E、异质性突变正确答案：A80、核型为45，X者可诊断为A、Klinefelter 综合征B、Down 综合征C、Turner综合征D、猫叫综合征E、Edward综合征正确答案：C81、关于带正电荷尼龙膜的描述下列不正确的是A、可结合DNAB、可结合 RNAC、对盐浓度要求不高D、核酸可通过UV交联共价结合E、本底较低正确答案：E82、Western 印迹时转移缓冲液中使用甲醇的浓度一般为A、30% v/vB、20% v/vC、40% v/vD、5%v/vE、10% v/v正确答案：B83、乳腺癌分子生物学检测的意义不包括A、筛选易感人群B、帮助减轻化疗的不良反应C、反映肿瘤的生物学行为D、预测早期乳腺癌复发、转移的风险E、筛选适合内分泌、化疗及靶向治疗的患者正确答案：B84、在人类基因组DNA序列中，DNA甲基化主要发生在A、腺嘌呤的N-6位B、胞嘧啶的N-4位C、鸟嘌呤的N-7位D、胞嘧啶的C-5位E、鸟嘌呤的C-5位正确答案：D85、指导合成蛋白质的结构基因大多数为A、高度重复顺序B、散在核元件C、回文顺序D、中度重复顺序E、单拷贝顺序正确答案：E86、蛋白质染色中哪种方法易造成蛋白质末端封闭，不利于蛋白质序列分析A、放射性核素标记染色技术B、铜染C、考马斯亮蓝染色D、银染E、荧光染色正确答案：D87、以下是游离型 Down综合征患者核型的为A、46,XY,-13,+t(13q21q)B、45,XY,-13,-21,+t(13q21q)C、47,XY,+21D、46,XY/47,XY,+21E、46,XY,-21,+t(21q21q)正确答案：C88、通过酶联级联反应检测每次核苷酸聚合所产生的PPi的测序方法是A、边合成边测序B、焦磷酸测序C、化学裂解法D、双脱氧终止法E、寡连测序正确答案：B89、病毒的遗传物质是A、DNAB、RNA和蛋白质C、DNA 或RNAD、RNA 和DNAE、DNA和蛋白质正确答案：C90、结核杆菌耐药基因中其功能与16S rRNA 相关的是A、rpoBB、katGC、rpsLD、rrsE、TlyA正确答案：D91、关于沙眼衣原体的分子生物学检验，错误的是A、检测 CT的PCR扩增靶基因序列主要有主要外膜蛋白基因、隐蔽性质粒DNA和16S rRNA 基因序列B、LCR技术适合于高危人群普查时大批量标本的检测C、PCR-RFLP可用于 CT分型D、RAPD技术不适用于血清学分型E、DNA序列分析不可用于耐药基因分析正确答案：E92、人类基因组中包含的基因数目约为A、4万~6万B、大于10万C、1万~2万D、6万~8万E、2万~3万正确答案：E93、第二代测序技术最主要技术特征是A、对单分子DNA进行非PCR的测序B、针对SNP进行非PCR的测序C、高通量和并行 PCR测序D、直接分析 SNPE、直接进行个体基因组测序和 SNP研究正确答案：C94、一位男性血友病患者，他亲属中不可能是血友病的是A、外甥或外孙B、同胞兄弟C、叔、伯、姑D、姨表兄弟E、外祖父或舅父正确答案：C95、关于DHPLC技术的描述不正确的是A、可实现高通量检测B、自动化程度高C、灵敏度和特异性高D、是分析异质性突变的首选方法E、是分析突变的金标准正确答案：E96、FMR-1基因上CGG重复序列异常扩增导致A、镰状细胞贫血B、脆性X综合征C、地中海贫血D、血友病AE、血友病 B正确答案：B97、关于白假丝酵母菌，以下描述错误的是A、俗称白色念珠菌，为人体正常菌群之一B、白假丝酵母菌引起的念珠菌病，以鹅口疮和酵母菌性阴道炎最常见C、白假丝酵母菌是一种条件致病菌，其致病性是假丝酵母菌中最弱的D、白假丝酵母菌通常存在于人的口腔、上呼吸道、肠道和阴道黏膜上E、临床上白假丝酵母菌的耐药现象日益突出正确答案：C98、SELDI-TOF-MS中的芯片主要包括两大类,分别是A、亲水性芯片和疏水性芯片B、阳离子芯片和阴离子芯片C、抗原-抗体芯片和酶-底物芯片D、受体-配体芯片和蛋白质-DNA芯片E、化学芯片和生物芯片正确答案：E99、下列有关蛋白质提取和分离的说法，错误的是A、采用透析法是蛋白质与其他小分子化合物分离开来B、离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离C、蛋白质在电场中与其自身所带电荷相同的电极方向移动D、透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性E、在蛋白质溶液中加入大量中性盐可使蛋白质沉淀析出正确答案：C100、美国国家信息中心(NCBI)提供的集成检索工具是A、EntrezB、SRSC、DBGET/LinkDBD、BLASTE、FASTA正确答案：A。
变性高效液相色谱结合多重PCR技术快速检测杜兴肌营养不良携带(精)
变性高效液相色谱结合多重PCR技术快速检测杜兴肌营养不良携带者大片段缺失Denaturing HPLC Coupled with Multiplex PCR for Rapid Detection of Large Deletions in Duchenne Muscular Dystrophy Carriers,Clinical Chemistry51, No. 7，1252-1256, 2005杜兴肌营养不良（DMD）和贝克肌营养不良（BMD）在新生男婴中的发病率为1/3500。
DMA和BMD都是X染色体连锁的隐性遗传病，源于Xp21.1处的dystropin基因突变。
其中约2/3的病例由女性携带者遗传，其余的病例由个体新发生的突变引起，无肌营养不良的家族史。
约60%的DMD病例的发病与基因内一个或多个外显子的大片段缺失相关，涉及基因近端和中间两个热点区域（外显子3-7和外显子44-55）。
约6%的DMD病例的基因变异与基因内大片段重复相关。
剩下的病例源于基因的点突变，小片段的缺失和插入。
正如Chamberlain 和 Beggs 等介绍的方法，受累的男性病例很容易通过多重PCR反应中特定扩增产物的缺乏进行诊断，不同频率的缺失的检出率高达98%。
但是对于携带者，由于未发生缺失的一条X染色体的妨碍，使得诊断DMD携带者较困难。
现在已经报道了多种进行DMD携带者诊断的策略，如定量Southern杂交，荧光原位杂交，连锁分析，基于荧光分析的技术，微芯片电泳，毛细管电泳，多重扩增的探针杂交，多重连接依赖的探针扩增等。
变性高效液相色谱技术（DHPLC）是一种简单，快速，非凝胶，非荧光依赖的方法，应用离子对反相液相色谱原理进行DNA变异检测，该技术灵敏度和特异性非常高。
我们将DHPLC 技术和多重PCR技术相结合，介绍了它在有效和精确诊断DMD家系中DMD携带者和非携带者的新应用。
多重PCR/高效液相色谱技术检测RB1基因重组Multiplex PCR/liquid chromatography assay for detection of gene rearrangements: application to RB1 geneNucleic Acids Research, 2004, Vol.32,No.18, 139摘要：大片段基因重组的筛查技术作为分子医学的重要组成部分已经建立，但仍然面临挑战。
DHPLC原理
DHPLC变性高效液相色谱(DHPLC)技术是一种能用于快速，自动和高通量检测基因的技术平台。
在分子生物学研究和临床基因诊断领域中，DHPLC技术可应用于DNA 的绝大部分检测，在很多领域已建立了快速、自动化核酸分析新方法和新标准。
利用该技术可以对单链和双链核酸进行快速、准确、自动化的分离、分析和定量；可用于单碱基替换（或单核苷酸多态性），小片段缺失或插入等多种已知和未知基因突变的检测；DNA/RNA片段大小判定；寡核苷酸分析及纯化；基因表达定量（Q-RT-PCR）和基因型分析（Genotyping）；基因表达差异分析；微卫星（MSI、STR）和杂和性丢失（LOH）分析；基因或染色体的部分缺失和多倍体的半定量分析等等；该技术可在生殖细胞系和体细胞系中筛查基因变异，它的应用范围包括：癌症基础研究、癌症放疗基因监控、癌症治疗药物基因组学监控、遗传性肿瘤早期诊断、肿瘤表观遗传学研究及诊断、各类遗传疾病的基因诊断、流行病学基因研究、临床微生物基因检测、法医鉴定、动植物遗传育种研究等。
原理DHPLC技术是利用液相色谱技术（HPLC），既在高压闭合液相流路中，将DNA 样品自动注入并在缓冲液携带下流过专利的DNA分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度条件下实现对DNA不同的分析；由紫外检测或荧光检测被分离的DNA样品，自动DNA片段收集器可根据需要自动收集被分离后的DNA样品，整个分析过程都是在计算机通过专用软件包NAVIGATOR完成的，专利的DNA分离柱具有很好的温度稳定性和酸碱稳定性，具有很长的有效寿命（大于6000次进样）和极好的分析稳定性（99%）。
DHPLC DNA色谱分离柱工作原理DNA分离柱，是使用无孔多苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）共聚物微球体作为稳定基质。
因为这些微球体都与含有18个碳原子的烷基长碳链相连，所以色谱柱的基质是疏水，电中性的，不会与核酸分子直接发生反应。
三乙基铵醋酸盐（TEAA）是一种离子对试剂，离子对试剂既是疏水性的又带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时TEAA的疏水基团又与固定相上碳-18链的疏水基团发生反应。
运用DHPLC技术检测PINK1基因突变
堡±兰堡丝塞笙二童萱宣（图片来源于美国ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ公司网站：ｈｔｐ：／／ｗｗ．ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍ—ｉｃ．ｃｏｍ．ｃｎ．）图卜１同源和异源双链的形成及ＤＨＰＬＣ检测结果３图３－ｌ待测样品ＰＩＮＫｌ基因外显子ＩＡＰＣＲ产物（４５２ｂｐ｝Ｍ：１００ｂｐＤＮ＾Ｌａｄｄｅｒ卜２０：待测样品臣３－２待鹊样品ＰＩ豫ｉ基日外显亍ＩＢＰＣＲ产物（３３０ｂＯＭ：１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－３待剥样品ＰＩＮＫｌ基因外显子２ＰＣＲ产物（５２２ｂｐ）Ｍ：１００ｂｐＤＮ＾Ｌａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－４待测样品Ｐｆ＃Ｋ１基因外显孚＿ｊＰＣＲ产物（ｊ五品）Ｍ：１００ｂｐ蹦＾Ｌａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－５待测样品ＦＩＮＫＩ基因外显子４ＰＣＲ产物（４２９ｂｐ）Ｍ：１００ｂｐＤｌｔＡＬａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－６待测样品ＰＩＮＫｌ基因外显子５ＰＣＲ产物（３００ｂｐ）Ｍ：１００ｂｐＤＮ＾Ｌａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－７待测样品ＰＩＮＫｌ基因外显子６ＰＣＲ产物（３０９６９｝Ｍ：ＩＯＯｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３，８待测样品ＰｔＮＫｌ基因外显子７ＰＣＲ产物（４１６ｂｐ）Ｍ：ＩＯＯｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－９待测样品Ｐｌｌｆｆ（１基因外显子８ＰＣＲ产物（Ｓ２０ｂｐ）Ｍ：１ＯＯｂｐＤＩＶＡＬａｄｄｅｒ１－２０：待测样品３．２．２ＤＨＰＬＣ检测结果３．２．２．１ＤＨＰＬＣ检测正常图谱经ＰＡＧＥ胶检测后ＰＣＲ产物产量及特异性良好的待检样品与野生型样品的ＰＣＲ产物按ｌ：１混合，以２．３２．２条件进行变性后用ＤＨＰＬＣ检测。
待检样品的峰型与野生型样品的峰型相比较，峰型一致者考虑为正常，以下是ＤＨＰＬＣ检测的ＰＩＮＫｌ基因各外显子正常峰型（图３．１０一３．１８）。
图３－１０ＤＨＰＬＣ检测ＰＩＮＫｌ基因外显子ｌＡ的正常图谱（温度６８．ｔ℃），“＿．”样品峰，ＩＤ：４８７６，１１０５为待检样品，ＩＤ：１ＡＮ为野生型样品，待测样品峰型与野生型样品峰型一致图３－１１ＮｔＰＬＣ检测ＰＩＮＫｌ基因外显子１Ｂ的正常图谱（温度６７．８℃），。
变性高效液相色谱原理
高效液相色谱原理DHPLC变性高效液相色谱技术是近年来发展起来的一项新的分析技术，它是分离核苷酸片段及分析检测已知未知基因突变和SNP的最佳技术平台，其核心技术采用Transgenomic公司专利技术的DNA SepCartridge分离柱。
DHPLC能够分析检测已知未知突变和SNP，技术关键是依靠这样专利技术的分离系统，在专利技术的DNA SepCartridge分离柱中的基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）交联聚合物微球体，固定相为碳-18烷烃链，PS-DVB微球体与碳-18烷烃链之间形成碳碳共价键共同组成柱填料，填料是电中性、疏水性的，不易与核酸发生反应。
三乙基铵醋酸盐（TEAA）是一种离子对试剂，离子对试剂既是疏水性的又带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时TEAA的疏水基团又与固定相碳-18链的疏水基团发生反应。
这种离子对试剂是连接核酸和柱基质之间的桥梁，因此，它作为“桥分子”使DNA片段吸附在固定相上面。
通过改变流动相中乙氰及离子对试剂的浓度实现DNA片段的分离。
WAVE® DHPLC分离系统的三种操作模式：WAVE®系统是一套经济、高效及多用途的仪器。
标准WAVE系统提供可选择的冷却设备、双板自动进样器、柱箱、紫外检测器和分离柱组成。
这套系统可在同一分析标准下实现三种模式的运行。
将标准WAVE系统加工和升级可以进一步提升系统的可用性。
执行模式温度应用分离基础非变性 50℃测量双螺旋DNA的大小（小于2000bp）依赖大小 PCR质量检测及纯化依赖序列定量分析部分变性 52-75℃变性检测依赖大小（平均范围）单核酸多态性检测依赖序列完全变性 75-80℃测量双螺旋DNA大小（小于2000bp）依赖大小（平均范围） DNA分析（DNA SepR柱）依赖序列寡核苷酸质量（DNA SepR柱和OLIGO SepR柱）和纯度分析（片段收集器）大量纯化需要OLIGOSepPrep TM HC柱非变性条件：依赖分子量的分离WAVEMAKER TM软件能根据DNA片段分子量大小最大限度完善分离条件。
高效液相色谱的应用研究进展
高效液相色谱的应用研究进展【摘要】从1903年，色谱的开始使用，各种色谱技术应运而生，其中高效液相色谱由于其分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点，作为物质分离的重要工具，在各个方面都取得了很大的发展，并且出现了许多的新型色谱。
本文综述了变性高效液相色谱在生物遗传方面的应用，及高效液相色谱在医学方面的应用。
【关键字】HPLC（高效液相色谱） DHPLC（变性高效液相色谱）1.高效液相色谱概要色谱法是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。
根据流动相的状态可分为气相色谱法和液相色谱法。
在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成。
这种色谱称为高效液相色谱(1iighperformance liquid chromatography，HPLC)。
由于高效液相色谱法有分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物学与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛。
另外，在高效液相色谱法的基础上不断发展，变性高效液相色谱法(DHPLC)随之兴起，广泛用于生物学、遗传学等领域。
2.高效液相色谱在生物学的应用变性高效液相色谱法(DHPLC)是在高效液相色谱法的基础上发展起来的一种新方法。
DHPLC采用高压闭合液相流路，将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过DNA分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度条件下，由荧光检测被分离的DNA样品，从而实现对DNA不同的分析它因使用的温度不同而有不同的应用价值：①在非变性温度(40℃～5O℃ )条件下对不同长度的双链DNA进行分离，用于定量反相PCR、长度多态性分析以及杂合性缺失(LOH)分析等；②在部分变性温度(51℃～75℃)条件下进行基因突变，单核苷酸多态性和CpG甲基化的检测；③在完全变性温度(70℃～8O℃)条件下对寡核苷[1]酸进行质量控制和纯化，RNA分离及已知位点基因型的分析等。
基因变异的研究方法与进展
基因变异广义上说就是指基因结构变化从而产生了可遗传的变异。
也就是说DNA水平上的突变造成的基因改变。
而这一突变过程可能有很多原因，有自发性的，比如DNA配对过程中的装配错误，也有外源性的诱导因素，如物理，化学，生物因素等造成染色体结构改变或者基因结构的直接变化。
突变的形式多种多样，常见的有：点突变，即一个或多个核苷酸发生了改变；框内突变指的是3个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸；除此之外，还存在着DNA大片段的缺失，通常是指几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。
这其中，最常见的莫过于点突变，他是指一个或者几个核苷酸的缺失或改变，通常会形成三种类型，第一种是同义突变，即碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止突变，第二种是错义突变，指的是碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸，第三种是无义突变，即碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。
基于上述的变化，常见的基因变异研究方法有如下几种一、筛选性方法有人将这类方法分为2类，根据电泳性质不同及其他包括化学修饰法等1 RNase 法该法是一种最早提出的检测DNA突变的方法口。
其原理是RNase可以识别RNA：DNA或RNA：RNA杂交链中错误配对的碱基并将其切断。
经聚丙烯酰胺凝胶电泳将正常链及被切断的含有突变点的链区分开来。
杂交方法是将同位素或其它方法标记的正常野生型RNA 片段与相对应的待测DNA 片段混合，90"C左右变性并在室温下复性形成杂交分子。
当待测DNA 片段中存在碱基突变时，在该位点上二条链不能正常配对，便成为RNase的识别和切割位点2 DGGE、CDGE、TGGE、TSGE法梯度变性凝胶电泳（DGGE）原理是当双链DNA在梯度变性的聚丙烯酰胺凝胶中行进到与DNA变性温度(熔点温度)一致的凝胶变性浓度位臵时，DNA 发生解旋变性此时电泳速度迅速降低。
各突变检测方法比较
1、RNA酶A切割法（RNase A cleavage）在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。
当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。
故如果仅分析被检DNA的一个条链，突变检出率只有30％，如同时分析正义和反义二条链，检出率可达70％。
该法需要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于1-2kb 的大片段进行检测，并能确定突变位点。
于这些优越性，它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。
电泳法（不能确定突变位点，都要通过测序等解决）2、变性梯度凝胶电泳（DGGE）双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。
一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain, MD)和解链行为(melting behavior) 。
一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。
当浓度度再升高依次达到各其他解链区域浓度时，这些区域也依次发生解链。
直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA 完全解链。
如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。
在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。
三种单基因遗传病的产前分子诊断
三种单基因遗传病的产前分子诊断徐盈 张建芳 郭芬芬 黎昱 燕凤 徐慧 任菊霞 宋婷婷 王德堂 辛晓燕 陈必良（第四军医大学西京医院妇产科，陕西西安 ７１００３２）【摘要】 目的 探讨脊髓性肌萎缩症（ＳＭＡ）、苯丙酮尿症（ＰＫＵ）和先天性软骨发育不全（ＡＣＨ）产前基因诊断的高效的临床检测方法。
方法 根据不同单基因病的基因突变类型，本研究应用ＤＨＰＬＣ技术对１例ＳＭＡ阳性家族史的胎儿绒毛样本进行ＳＭＮ１基因７号外显子缺失检测，选择正常人及ＳＭＡ患者作对照。
通过直接测序法分别对ＰＫＵ家系和ＡＣＨ家系的患者、表型正常的个体及其胎儿进行ＰＡＨ致病基因和ＦＧＦＲ３基因第１０外显子进行检测。
结果 ＳＭＡ阳性家系中，胎儿未检测到ＳＭＮ１基因７号外显子的纯合缺失，建议继续妊娠，结果顺利产出１名正常儿。
ＰＫＵ阳性家系通过检测发现患者在ＰＡＨ基因上确实存在无义突变，ｃ．７８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６１Ｔｅｒ）和错义突变ｃ．８４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２８１Ｌｅｕ），均为杂合子。
但是胎儿与患者母亲的突变类型一致，为携带者，不发病，建议继续妊娠。
软骨发育不全患者送检标本ＦＧＦＲ３基因外显子１０发现１处序列异常，为ｃ．１１３８Ｇ＞Ａ，导致编码氨基酸改变Ｇｌｙ３８０Ａｒｇ，但其胎儿羊水标本检测ＦＧＦＲ３基因外显子１０未发现序列异常。
结论 根据单基因病不同的基因突变类型，选择合适的方法可快速、准确地实现单基因病产前基因的诊断，尽早避免单基因病患儿的出生。
【关键词】 单基因病；产前分子诊断；脊髓性肌萎缩症；苯丙酮尿症；先天性软骨发育不全【中图分类号】 Ｒ７１４．５５ 【文献标识码】 Ａ犇犗犐：１０．１３４７０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｐｄ．２０１４．０４．０１１基金项目：陕西省科技统筹创新工程（２０１２ＫＴＣＬ０３ ０９） 通讯作者：张建芳，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｆ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ【犃犫狊狋狉犪犮狋】 犗犫犼犲犮狋犻狏犲 Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｓｐｉｎａｌｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ（ＳＭＡ），ＰＫＵａｎｄａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ（ＡＣＨ）．犕犲狋犺狅犱 Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｓｔｍｅｔｈｏｄｓａｒｅａｐｐｌｉｅｄｂａｓｅｄｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｕｔａ ｔｉｏｎａｌｐａｔｔｅｒｎ．Ｔｈｅｃｈｏｒｉｏｎｉｃｖｉｌｌｕｓｏｆ１ｆｅｔｕｓｗｉｔｈＳＭＡｐｏｓｉｔｉｖｅｆａｍｉｌｙｈｉｓｔｏｒｙｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅｅｘｏｎ７ｏｆｔｅｌｏｍｅｒｉｃｓｕｒｖｉａｌｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎ（ＳＭＮ１）ｇｅｎｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＤＨＰＬＣ．ＮｏｒｍａｌｍｅｍｂｅｒａｎｄＳＭＡｐａ ｔｉｅｎｔｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｈｅｈｏｔｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｅｘｏｎ１０ｏｆＦＧＦＲ３ｇｅｎｅａｎｄＰＡＨｇｅｎｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ，ｎｏｒｍａｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓａｎｄｐｒｅｇｎａｎｃｙｆｅｔｕｓ．犚犲狊狌犾狋狊 ‘Ｈｏｍｏｚｙ ｇｏｕｓｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｔｈｅＳＭＮ１ｅｘｏｎ７ｗａｓｎ′ｔｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｐｒｅｇｎａｎｃｙｆｅｔｕｓ．Ｔｈｅｐｅｄｉｇｒｅｅｄｉａｇｎｏｓｅｄａｓｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｉｎｕｅｄｔｏｐｒｅｇｎａｎｃｙ，ａｎｄｇａｖｅｂｉｒｔｈｔｏａｎｏｒｍａｌｂａｂｙ．ｃ．７８１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ２６１Ｔｅｒ）ａｎｄｃ．８４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２８１Ｌｅｕ）ｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆＰＡＨｇｅｎｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｐａｔｉｅｎｔｗｉｔｈＰＫＵｐｏｓｉｔｉｖｅｆａｍｉｌｙｈｉｓｔｏｒｙ．Ｆｏｒｔｕｎａｔｅ ｌｙ，ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈｅｆｅｔｕｓｓｈｏｗｓｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＰＡＨｇｅｎｅａｓｓａｍｅａｓｈｉｓｍｏｔｈｅｒｃ．８４２Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｐｒｏ２８１Ｌｅｕ）．Ｔｈｅｐｅｄｉｇｒｅｅｄｉａｇｎｏｓｅｄａｓｃａｒｒｉｅｒｃｏｎｔｉｎｕｅｄｔｏｐｒｅｇｎａｎｃｙ．ＴｈｅｍｏｔｈｅｒｏｆｔｈｅｆｅｔｕｓｄｉａｇｎｏｓｅｄａｓａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａｈａｄＧ１１３８Ａｍｕｔａｔｉｏｎ，ｂｕｔｔｈｅｆｅｔｕｓｈａｄｎｏｒｍａｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１１３８ｉｎｅｘｔｏｎ１０ｏｆＦＧＦＲ３，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅｗｅｒｅｅｘｃｌｕｄｅｄｆｒｏｍａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ．犆狅狀犮犾狌狊犻狅狀狊 Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｉｆ ｆｅｒｅｎｔｔｅｓｔｍｅｔｈｏｄｓｉｓｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｐｒａｃｔｉｃａｌｗａｙｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｎｏｇｅｎｉｃｄｉｓｅａｓｅ．【犓犲狔狑狅狉犱狊】 ｍｏｎｏｇｅｎｉｃｄｉｓｅａｓｅ；ｐｒｅｎａｔａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉａｇｎｏｓｉｓ；ｓｐｉｎａｌｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ；ＰＫＵ；ａｃｈｏｎ ｄｒｏｐｌａｓｉａ. All Rights Reserved. 目前，遗传病与心血管病、癌症一起成为严重危害人类健康和致死率最高的前三名疾病，也是我国出生缺陷的重要原因之一［１］。
新疆3个HCM家系MYH7基因突变DHPLC检测和DNA测序结果分析
新疆3个HCM家系MYH7基因突变DHPLC检测和DNA测序结果分析杨忠伟;冯秀丽;王伟;王忠【摘要】Objective To study familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM's) main pathogenic gene beta myosin heavy chain beta - myosin heavy chain gene and MYH7 mutation. Methods Denaturing high performance liquid chromatography with DHPLC detection and DNA sequencing method were used to deted 3 HCM family members of the MYH7 gene exon 8 , 14 and the downstream nearby sequence. Results One family was foundThr441Met mutation at exon 14 of MYH7 gene, in addition there was a point mutation at exon 8. Two other families were also found to have different point mutations. Conclusions The application of denaturing high performance liquid chromatography and direct DNA sequencing technology can realize to familial hypertrophic cardiomyopathy mutation screening of MYH7 gene, facilitates the early diagnosis, risk prediction.%目的研究家族性肥厚型心肌病(HCM)的主要致病基因β肌球蛋白重链,MYH7突变情况.方法用变性高效液相色谱DHPLC检测和DNA测序方法对3个HCM家系成员的MYH7基因8、14外显子及附近上下游序列进行检测分析.结果 3个家系其中1个家系发现MYH7基因14外显子中存在Thr441Met突变,该突变在中国人中是首次发现,此外外显子8也存在1个点突变.另外两个家系也发现有不同位点的突变.结论运用变性高效液相色谱技术和DNA直接测序技术能实现对家族性肥厚型心肌病MYH7基因突变的筛查,有利于早期诊断、患病风险预测.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2012(032)012【总页数】5页(P1437-1441)【关键词】家族性肥厚型心肌病;β肌球蛋白重链;基因突变【作者】杨忠伟;冯秀丽;王伟;王忠【作者单位】新疆石河子大学医学院教学实习基地奎屯农七师医院,新疆石河子832000;新疆石河子大学医学院教学实习基地奎屯农七师医院,新疆石河子832000;新疆石河子大学医学院研究生办,新疆石河子832000;新疆石河子大学医学院第一附属医院,新疆石河子832000【正文语种】中文【中图分类】R542.2肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM，OMIM160760)是一种常染色体显性遗传性疾病，约60%～70%的患者有家族史，其编码肌节蛋白的基因突变是这一疾病的分子基础，已证明有10余种基因涉及400多种突变与本病相关［1］。
DHPLC联合一代测序技术在脊髓肌萎缩症携带者筛查中的应用
doi :10.3969/j.issn.1002-7386.2022.04.005·论著·DHPLC 联合一代测序技术在脊髓肌萎缩症携带者筛查中的应用刘春苗 孟雁欣 张志敏 杨扬 王亚男 张海娟项目来源:河北省青年自然科学基金项目(编号:H2017106030);石家庄市科学技术研究与发展计划项目(编号:211461163)作者单位:050011 河北省石家庄市第四医院产科(刘春苗、张志敏、杨扬、王亚男、张海娟),产前诊断中心(孟雁欣)通讯作者:张海娟 E⁃mail:zhj151********@ 【摘要】 目的 探讨高效液相色谱联合一代测序技术进行运动神经元生存基因(survival motor neuron ,SMN )缺失/点突变检测在脊髓肌萎缩症(spinal muscular atrophy ,SMA )携带者筛查中的临床应用价值。
方法 收集2018年1月至2019年1月就诊的3544例样本进行高效液相色谱技术(DHPLC )检测,一代测序技术序惯性行SMN1点突变测序分析。
结果 3544例样本共检出61例拷贝异常携带者(男33例,女28例),检出率1.72%。
42例SMN1缺失携带(约占1.18%),31例SMN1∶SMN2为1∶1,11例SMN1∶SMN2为1∶2。
17例SMN1转换成SMN2(SMN1∶SMN2=1∶3),约占0.48%。
2例SMN1∶SMN2=1∶0。
61例SMA 携带者配偶行SMN1检测,11例SMN1变异。
9例SMN1缺失携带者SMN1∶SMN2=1∶1,2例SMN1转换成SMN2(SMN1∶SMN2=1∶3)。
3544例样本行SMN1靶向测序,2例为SMN1点突变携带者,1例p.Q164X 为致病突变携带者,1例为5号内含子位置SNP 位点。
对上述配偶进行SMN1拷贝缺失及点突变检测未见异常。
余样本未见明确变异位点。
妇双方知情同意并签署知情同意书后,11对夫妇双方均为SMN1携带者胎儿于孕18周进行胎儿羊水染色体检查。
基因扫描：鉴定未知的基因突变位点
自从1996年LightCycler实时荧光定量PCR仪上市后，融解曲线分析就成为了实时PCR技术的一个组成部分。
SYBR® Green I染料让研究者们不仅可以进行无需探针的定量，还可以通过融解曲线分析的方式直接进行产物鉴定。
但是精细的序列识别（如SNP基因分型）还是需要标记探针。
用融解曲线分析进行SNP基因分型最初是用一条标记引物加上一条标记探针完成的，后来发展为两条标记探针，每条都是单标记。
这些技术今天已经在普通实时定量PCR仪上得到了广泛应用。
现在，这一技术有了最新的进展。
可用于高分辨率融解曲线分析的新仪器和饱和双链DNA结合染料让研究者不用探针即可完成突变扫描和基因分型。
高分辨率融解曲线分析最初是用标记引物来完成的（Gundry et al., 2003），用于区分不同的杂合子和纯合子。
随后饱和染料的引入让这类实验不再需要任何荧光标记的寡核苷酸（Wittwer et al., 2003）。
由于无需进行产物分离，用融解曲线进行突变扫描天生就简单、便宜。
其检测杂合SNP的灵敏度和特异性至少跟其他更为复杂的技术一样高（Reed and Wittwer, 2004, Chou et al., 2005）。
高分辨率融解曲线分析的应用文献正在急剧增加。
目前最重要的一类应用叫做基因扫描，即不通过测序或在测序之前，对PCR扩增片段中可能存在的未知突变进行搜索。
其原理就是检测由于突变造成的DNA融解曲线形状变化。
要进行这种分析，除了上述的饱和双链DNA结合染料外，还需要具备出色温度均一性的仪器以及精密的分析软件，才能从满天繁星般复杂的数据中解读出特定序列“星座”的信息。
通过LightCycler® 480实时荧光定量PCR系统平台上引入LightCycler® 480 High Resolution Melting Master试剂和专用的分析软件，罗氏应用科学构建了第一个基于板式实时定量PCR系统的基因扫描解决方案。
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论ＤＨＰＬＣ技术在基因突变检测上的应用DHPLC用来检测DNA突变和单核酸多态性，可以取代传统分子生物学技
术，不需要制备凝胶，检测DNA片段做到了全自动、高效、快速、准确，在疾病相关基因突变检测方面提供了有效的技术手段，是一种快速有效的基因突变筛查方法。
标签：DHPLC技术；基因突变；检测
1DttPLC技术原理
变性高效液相色谱(DHPLC)是一种高通量、自动化的基因突变检测技术。
该技术已在医学、癌症、药物等研究领域开展应用，与SSCP和DNA直接测序等突变检测技术相比，DHPLC具有灵敏性更高，特异性更强，廉价省时等优点。
DHPLC技术的原理是基于未解链的和部分解链的双链DNA在部分失活条件下具有不同保留的性质。
这种部分失活条件可以采取升高温度的手段获得。
所有基因组DNA的单拷贝均可通过PCR反应大量扩增，杂合子个体的DNA经扩增产生异源双链，由于错配位点的氢键被破坏，因此在异源双链上形成“鼓泡”，导致它与纯合子个体的DNA扩增产物——完全匹配的同源双链的解链特征不同。
在部分加热变性的条件下，异源双链DNA分子更易于解链形成Y形结构，与固定相的结合能力降低。
当流动相中乙腈浓度梯度增大时，异源双链将先于同源双链被洗脱出来，带有突变序列的样品呈现出异源双链和同源双链混合物的峰形特点，而不含突变序列的样品则只有同源双链的峰形。
据此可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段，从而提供有无突变的信息。
2DHPLC技术在突变基因诊断中的应用
基因突变是指基因组DNA分子在结构功能上发生碱基对组成或排列顺序的改变，主要包括碱基的替换和小片段的缺失或插入，它是导致基因型疾病的重要原因之一。
基因突变在生物医学研究中，尤其是在基因型疾病诊断及病理研究中有着非常重要的作用。
随着人类基因组整体测序计划的发展，探索基因突变的任务变得十分迫切。
随着人类基因组整体测序计划的发展，探索基因突变的任务变得十分迫切。
DHPLC技术自最早被用于分析人Y染色体单核苷酸多态性位点(SNP)以进行人种进化的遗传性研究；此后还用于筛查致病基因突变位点、分析单核背酸多态性以及基因启动子CpG岛甲基化修饰改变等研究；因其灵敏性及准确度均较高，操作实现了半自动化，检测周期短、费用低，尤其适合于基因结构复杂而无突变热点或突变频率低于20％的单基因变异，以及多基因致病突变。
(1)散发性卵巢癌p53基因突变定位于17染色体的p53基因是目前研究得最广泛的抑癌基因，迄今发现的人类肿瘤的2500种基因突变中，p53蛋白的393
个氨基酸就有280个位点存在突变，其直接的后果是导致氨基酸的改变，最终使p53蛋白失活，丧失抑癌作用。
杜明和丰有吉，利用DHPLC来检测50例散发性卵巢癌p53基因外显子5，8的突变，18例突变都可以使用DHPLC的方法发现，没有假阳性和假阴性。
说明DHPLC可以用于临床筛查基因突变，并且对于异质性肿瘤而言，DHPLC检测基因突变无疑是最可靠的。
(2)胃癌组织基因突变鲁狲、徐惠绵、任群等人利用DHPLC对39例胃癌组织及血清中p53基因突变进行检测，并测序验证。
在他们的研究中p53基因的突变率为21％(8/39)；其中肠型胃癌突变率40％(6/15)明显高于弥漫型胃癌8.33％(2/24)(P＜0.01)；发现既往未见报道突变3例。
这充分说明了DHPLC是一项较好的检测胃癌组织中基因突变的筛查方法
(3)汉族人I型多囊肾致病基因突变张树忠等人，通过采用DHPLC技术检测汉族人常染色体显性多囊肾病(AD－PKD)I型致病基因PKDl的突变：以来源于19个ADPKD家系的67名成员血样标本的基因组DNA为模板，通过长链PCR 和巢式PCR联合扩增的方法扩增PKDl全编码区，然后采用DHPLC方法进行初步筛查，将存在异常色谱图的扩增产物经核苷酸测序，确定突变的具体位点和类型，共检测出14个致病突变，包括10个错义突变、1个插入突变、1个缺失突变、2个无义突变。
他们实验结果充分说明了DH－PLC方法可以作为更为有效筛查汉族人ADPKDPKDl突变位点的检测途径。
(4)乳腺癌BRCAl基因突变BRCAl基因为“乳腺癌1号基因”，位于17q21，有22个编码外显子。
目前已经发现约40％～50％的遗传性乳腺癌和卵巢癌患者BRCAl基因发生突变。
李丹等利用聚合酶链反应PCR扩增BRCAl基因，该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，直接进行DH－PLC分析，从124例乳腺癌患者中共发现9种突变，确定了9种乳腺癌患者可能发生的突变类型，为今后临床应用DH－PLC对高危人群BRCAI基因进行早期基因检测提供了9个位点，所有DPHLC检测显示峰型异常的样品经测序证明均存在突变或者SHP，证明该技术阳性检测率为100％。
且具有操作简单、快速、敏感、准确且经济等特点。
3DHPLC技术与其他技术在突变基因诊断中的联合应用
目前在核酸分析领域与HPLC联用的检测手段有紫外(ultraviolet photometric detector，UV)、荧光(fluorescencedetector)、质谱(mass Spectrometry，MS)等。
其中紫外检测器(UV)凭借其良好的通用性成为应用最为广泛的检测器，但灵敏度不高的弱点使其使用受到一定的限制。
在核酸分析和一些突变扫描方法中有时需要更高的灵敏度，这时具有更高灵敏度和选择性的荧光检测器成为首选。
但是荧光检测器要求使用荧光标记物，且通常使用的染料如吖啶黄、溴化乙锭是有毒物质。
Scalano实验室开发出SYBR Green，染料不仅具有更好的灵敏度，而且使用更安全。
激光诱导荧光是目前灵敏度最高的检测方法之一。
Hecker等采用荧光标记PCR引物、激光诱导荧光方式进行检测，证明DH－PLC方法可以区别含量相差500倍的两个等位基因，这使多份样本的混合检测成为可能。
同时荧光标记单链，使色谱图的解释变得更加容易。
美国Transgenomie公司在WA VEOR核苷酸片段分析系统技术平台基础上，开发出一种后荧光检测技术。
在所有分析条
件不变的情况下，被检测的核酸片段经DHPLC分离之后在混合室中与荧光试剂混合，然后进行检测，不仅可以提高灵敏度上百倍，而且不需要昂贵的荧光标记引物。
近年来电喷雾离子化一质谱(EIS－MS)作为一种重要的结构分析工具与IR －RP－HPLC联用也已应用于核酸分析领域，该联用技术不仅可以确证被分离的单链DNA的成分特性，还可以确证扩增的PCR产物的基因型。
众所周知，在核酸的质谱分析中为了获得高置信度的分析结果，对分析物进行适当的脱盐和去除小分子量杂质是必不可少的，这也正是HPLC－MS的魅力所在，但质谱的高成本使该项技术较难推广使用，
4总结
DHPLC用來检测DNA突变和单核酸多态性，可以取代传统分子生物学技术，不需要制备凝胶，检测DNA片段做到了全自动、高效、快速、准确，在疾病相关基因突变检测方面提供了有效的技术手段，是一种快速有效的基因突变筛查方法。
DHPLC技术也有不足之处：对PCR要求很高；不能直接检测出纯合突变，只能提供个体样本有无突变的信息，但无法得出具体的突变类型；当有多个片段需要检测时，由于有多个解链温度，需要多步检测，增加了工作量等。
尽管如此，在目前的检测手段中，DHPLC仍是一种快速、高效、准确、经济及半自动化筛查基因杂合突变的工具，优于测序等其他分子生物学方法，相信在未来的基因组学研究领域中必将继续发挥重要的作用。