毛细管电泳分析

第三讲 现代分离分析方法
毛细管电泳分析方法简介
第十一章 高效毛细管电泳分析
一、概述 generalization 二、经典电泳分析法 traditional electrophoresis 三、高效毛细管电泳分析 法 high performance capillary electrophoresis
缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工 作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电 渗流下降。
4. 温度的影响
毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。
温度变化来自于“焦耳热”； 焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强 度成正比。
3.焦耳热与温度梯度的影响
电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：
V I 2 Q Λm cb E 2 πr L
m—电解质溶液的摩尔电导；I—工作电流：cm—电解质浓度；
散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破 坏了塞流，导致区带展宽。
改善方法： （1）减小毛细管内径； （2）控制散热；
ai —溶质i
的解离度；μi —溶质i 在解离状态下的绝对淌度
3.表观淌度 μap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）： ν
ap=μap
E
五、HPCE中的参数与关系式
parameters and relation in HPCE
1.迁移时间（保留时间）
HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱 理论也适用。
高效毛细管电泳的特点
1.仪器简单、易自动化
电源、毛细管、检测器、溶液瓶
2.分析速度快、分离效率高
在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分 离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数；
3.操作方便、消耗少
进样量极少，水介质中进行；
4.应用范围极广
有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；
四、淌度
mobility
淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度； 淌度不同是电泳分离的基础。
1.绝对淌度(absolute mobility)μab
无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移 速度，简称淌度。可在手册中查阅。
2.有效淌度(effective mobility)μef
实际溶液中的淌度(实验中测定的)。 μef=∑aiμi
板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。
分离过程
电场作用下，毛细
管柱中出现：电泳现 象和电渗流现象。

带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反。ν 电渗流 >ν 电泳时,阴 离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中 性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被 相互分离。 （动画）
改变电渗流方向的方法：
（1）毛细管改性 表面键合阳离子基团； （2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细 管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。
4. HPCE中电渗流的流形
电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式 流动（谱带展宽很小）；
液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流 速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽 较大）。
1.纵向扩散的影响
在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ 2=2Dt
由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可 获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。
2.进样的影响
当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分 离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度： Winj= (24D t )1/2 实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。
q E 6π

二、电渗现象与电渗流
electroosmosis and electroosmotic flow
1.电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静 电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间 存在电位差。
当液体两端施加电压时， 就会发生液体相对于固体表面 的移动，这种液体相对于固体 表面的移动的现象叫电渗现象。
二、经典电泳分析
traditional electrophoresis
利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方 法和技术叫电泳法或电泳技术。 按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、 自由电泳； 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无 法与其他分析相比。
电渗流。
3.HPCE中电渗流的大小与方向
电渗流的大小用电渗流速度ν 度μ和电场强度E。即
电渗流表示，取决于电渗淌
ν
电渗流
= μE
0ε
电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即 μ = ε
ξ
ε 0—真空介电常数；ε —介电常数；ξ —毛细管壁的Zeta电势。
ν ν
电渗流
= ε 0ε ξ E = Lef/teo
1981年，Jorgenson和Luckas，用75Um内径石英毛细管 进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本 变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析 技术——高效毛细管电泳。
三、高效毛细管电泳分析
high performance capillary electrophoresis
5. HPCE中电渗流的作用
电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍； 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： ν ν
+ 0
=ν =ν
电渗流 电渗流 电渗流
+ ν - ν
+ef -ef
阳离子运动方向与电渗流一致； 阴离子运动方向与电渗流相反；
ν
=ν
中性粒子运动方向与电渗流一致；
（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离； （2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性， 如同改变LC中的流速； （3）电渗流的微小变化影响结果的重现性； 在HPCE中，控制电渗流非常重要。
温度每变化1度，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；
5. 添加剂的影响
（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大， 使溶液的黏度增大，电渗流减小。
（2）加入表面活性剂，可改变电 渗流的大小和方向；
加入不同阳离子表面活性剂 来控制电渗流。 加入阴离子表面活性剂，如 十二烷基硫酸钠（SDS），可以使 壁表面负电荷增加，zeta电势增 大，电渗流增大； （3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈， 使电渗流增大。
2
3.分离度
R 0.177
apVLef
DL
平均
平均
ap1 ap2
2
影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度 与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：
2(t 2 t1 ) R W2 W1
六、影响分离效率的因素—区带展宽
factors influenced the efficiency—band broadening
High performance capillary electrophoresis,HPCE
第一节 概述
generalization
第一节 概
述
一、概述
generalization
在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作 用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现 象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁 移速率不同，可实现分离。 1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲 溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血 清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α 、β 、γ 球蛋白； 发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定； 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖；
分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；
第二节 高效毛细管电泳分析法
high performance capillary electrophoresis,HPCE
高效毛细管电泳理论基础
basic theory of HPCE
一、PHCE基本原理 basic principles of PHCE 二、电渗现象与电渗流 electroosmosis and electroosmotic flow 三、影响电渗流的因素 factors influenced electroosmosis 四、淌度 mobility 五、PHCE中的参数与关系式 parameters and relation in HPCE 六、影响分离效率的因素 factors influenced separation efficiency
三、HPCE中影响电渗流的因素
factors influenced electroosmosis 1.电场强度的影响
电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时， 电渗流速度正比于工作电压。
2.毛细管材料的影响
不同材料毛细管的表面电 荷特性不同，产生的电渗流大 小不同；
3. 电解质溶液性质的影响
4.溶质与管壁间的相互作用
存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽； 蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题 特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。 细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面 积大，又增加了溶质吸附的机会。 减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，