马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及ltr的作用

中国农业科学院
博士学位论文
马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变
作用
姓名：***
申请学位级别：博士
专业：预防兽医学
指导教师：孔宪刚;童光志
20050601
摘要
马传染性贫血病毒（ｅｑｕｉｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｎｅｍｉａｖｉｒｕｓ，ＥＩＡＶ）属反转录病毒科馒病毒属，是马传染性贫血（ＥＩＡ．简称马传贫）的病原体。

我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗，是迄今为Ｉｔ世界上唯一投入麻用的慢病毒疫苗。

该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行，是研究慢病毒免疫预防非常有价值的模型。

反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列（ＬＴＲ）对病毒复制有重要的调控作用，影响到病毒的繁殖动力学、组织嗜性、致病力等方面。

反转录病毒的囊膜蛋白，由于其基冈的高度变异性，受到病毒学研究的普遍关注，通过对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒与其亲本强毒Ｌ株前病毒全基因组核苷酸序列的比较分析，发现二者的ＬＴＲ和＂ｖ基冈（尤其是ｇｐ９０编码区）筹异较大。

为了研究ｅｎｖ基囡ｇｐ９０在我国ＥＩＡＶ－ＤＬＡ致弱过程中的作用．我们以ＥＩＡＶ强毒辽‘ｊ啉（Ｌ株）接种健康马，从不同时期发热期马血清中以ＲＴ＿ＰｃＲ扩增包含完整ｓ２基醐ｑｇｐ９０基因片段；同时以ＥＩＡＶ－ＤＬＡ接种健康驴白细胞并用ＲＴ－ＰＣＲ扩增相同的基因片段，将所得的强弱毒共３０个ｅｎｖ基冈
ｇｐ９０进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现，强弱毒ｇｐｇＯ序列存在着多个位点高度的一致性变异．所推导的氨基酸也存在１９个位点极其一致性变异．这些变异包括氨基酸的点突变和插入或缺失，其中，氨基酸在极性与非极性之间的变换及氮基酸的插入和缺失造成糖基化数量非常一致的变化。

在对其它慢病毒（如Ｈ１Ｖ、ＳＩＶ）研究过程中发现，糖基化对病毒的细胞嗜性、毒力以及病毒逃避中和抗体的能力起到了致关重要的作用。

经过序列及氨基酸的比较历发现．ｇｐ９０基囡Ｖ３到ｖ５Ｖ在强毒和弱毒之间差异显著，而在各自内部相对保守，变异较小。

对２７个ｓ２基冈进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现，ｓ２基因中也存在着３个１｝常一致的点突变，没有碱基的插入或缺失。

在对我国强毒ＥＩＡＶ－Ｌ和弱毒ＥＩＡＶ—ＤＬＡｇｎｖ基因变异研究的基础上，我们将马传贫强、弱毒ｇｐ９０全长及部分（Ｖ３－Ｖ５区）分别连接到逆转录病毒载体ｐＢＡＢＥ—ｐｕｒｏ，通过转染将马传贫强、
弱毒∞ｙ基阿整合到包装细胞系ＰＡ３１７中，利用抗性筛选到稳定表达细胞系；然后将马传贫强、弱毒ｇｐ９０全妖及Ｖ３－ｖ５Ｎ分别连接到高散真核表达载＇怫．ｐｃＤＮＡ３．１（＋），转染２９３Ｔ细胞系并经抗性筛选及弧克隆后获得高敛稳定表达马传贫强弱毒ｇｐ９及Ｖ３－ｖｓＮ基冈的细胞系，为研究ｇｐ９０及ｖ３．Ｖ５ｆ露结构与功能打Ｆ了良好的基础。

然而，我们至今对弱毒疫苗的致弱机理尚不清楚。

对以ＨＩＶ为主的慢病毒研究表明ＬＴＲ和∞Ｐ基因中Ｎ·连接糖基化与病毒的嗜性、感染性和抗体中平¨作川密切相芙。

我国马传染性贫血病毒强弱毒∞湛因之间Ｎ一连接糖基化存在明显的区别；根据强弱毒∞ｒ基冈变异的分析结果，构建了一系列Ｎ一连接糖基化突变分子克隆，力图对Ｎ．连接糖基化在我国屿传染性贫血病毒致弱过程中的作Ｈ｜进行阐述，通过转染驴白细胞并盲传１０４－℃，Ｊｆ亓仍朱获得Ｎ．迎接糖基化突变病毒，我廿Ｊ推测可能的原冈是由ｒＮ．连接糖基化的突变均忙丁。

月堪冈的ｖ３一ｖ５区，影响Ｊ，在驴自细胞上的细胞嗜性。

为了探讨ＬＴＲ在ＥＩＡＶ病毒复制平｝博｝录过群中的作ＪＬ｝』，升进一步研究ＥＩＡＶ的致病午¨免瞳机制，我＂Ｊ在已构建ＥＩＡＶ－ＤＬＡ株感染性分子克隆雨ＪＥＩＡＶ－Ｌ株前病毒ＤＮＡ全基冈细分子克隆的基础上，川ＥＩＡＶ－Ｌ株的ＬＴＲ利ｇｐ９０编码区分：ｉｉｆ替换Ｅ／ＡＶ－ＤＬＡ株感染性分ｆ兜隆的１ｆＨ庸片段，
薨＝以ＥＩＡＶ－Ｌ株的ＬＴＲ和ｇｐ９０编码区同时替换ＥＩＡＶ－ＤＬＡ株感染性分子克隆的相虑片段，构建了三个Ｅ１ＡＶ－ＤＬＡ株和Ｌ株前病毒基因组嵌合分子克隆，分州命名为ｐＯＫ．ＬＴＲ·ＤＬＡ／Ｌ、ｐＯＫ．ｅｎｖ—Ｄ乙Ａ，Ｌ、ｐｏＫ．ＬＴＲｅｎｖ－ＤＬＡ／Ｌ。

通过转染及盲传获得了一株嵌台病毒ｐＯＫ－ＬＴＲ－ＤＬＡ／Ｌ。

替换了ＬＴＲ的强弱毒嵌合病毒可以在驴白细胞中有效复制并且产生细胞病变。

随后我们进行了马体试验，通过对ＥＩＡＶ结构蛋白特异性抗体的监测表明，嵌合病毒可以有效刺激机体产生针对农壳蛋白ＣＡ（ｐ２６）和跨膜蛋白ｇｐ４５的特异性抗体．但不能有效刺激机体产生针对附加蛋白ｐ９和核农壳蛋白ＮＣ（ｐ１１）的特异性抗体．而对照攻毒马在笈病至死亡期间均检测到了高水平的附加蛋白ｐ９和核农壳蛋白ＮＣ（ｐ１１）的特异性抗体，结果表明，嵌合病毒在马体内是以低水平的复制长期刺激机体产生免疫应答，从而获得了良封的保护性，对试验马无致病性且可以保护马抵抗致死荆量的强毒攻击。

关键词：马传染性贫血病病毒，感染性分子克隆．长末端重复序列，Ⅲｖ基因，嵌合病毒，Ｎ一连接糖基化
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｅｑｕｉｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｎｅｍｉａｖｉｒｕｓ（ＥＩＡＶ）ｉｓａｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｗｉｔｈｉｎｔｈｅｆａｍｉｌｙＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅａｎｄｔｈｅｃａｕｓａｔｉｖｅａｇｅｎｔｏｆｅｑｕｉｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｎｅｍｉａ（ＥＩＡ）．ＴｈｅＣｈｉｎｅｓｅｄｏｎｋｅｙｌｅｕｋｏｃｙｔｅａＲｅｎｕａｔｅｄｓｔｒａｉｎｏｆＥＩＡＶ（ＥＩＡＶ－ＤＬＡ）ｗａｓｔｈｅｏｎｌｙｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｕｐｔｏｎｏ、ｖ，ｗｈｉｃｈｈａｓｂｅｅｎａｐｐｌｉｅｄｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙｉｎＣｈｉｎａａｇａｉｎｓｔＥＩＡ．ＥＩＡＶ－ＤＬＡｃａｎｓｅｒｖｅａｓａｍｏｄｅｌｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ．ＴｈｅＥ１ＡＶｐｒｏｖｉｒａｌｇｅｎｏｍｉｃｌｏｎｇ－ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）ｉｓａｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｐｒｏｍｏｔｏｒ，ｗｈｉｃｈｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅｅｎｖｅｌｏｐｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｔｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｉｎｉｔｉａｔｅｓｇｒｅａｔｉｎｔｅｒｅｓｔｓｆｏｒｉｔｓｆｒｅｑｕｅｎｔｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｓｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥＩＡＶ－ＤＬＡｗｉｔｈｔｈａｔｏｆＥＩＡＶ－ＬｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｂｏｔｈＬＴＲａｎｄｅｎＶｇｅｎｅ（ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｇｐ９０ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）ａｒｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈｌｙｖａｒｉｅｄ．
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ｐｒｏｃｅｓｓ
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ｌｅｖｅｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｎｄｕｃｅｉｍｍｕｎｅｌ、ｅｓｐｏｎｓｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｐｏｎｉｅｓｆｒｏｍｖｉｒｕｌｅｎｔｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏＥＩＡＶ－Ｌ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｑｕｉｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｎｅｍｉａｖｉｒｕｓ（Ｅ１ＡＶ），ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｅ，ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ，ｅｎｖｇｅｎｅ，ｃｈｉｍｅｒｉｃｖｉｒｕｓ，Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．
Ｖ
中国农业科学院研究生论文评审
论文答辩委员会
主席：李一经教授
专家组成员：步志高研究员
相文华研究员
曲连东研究员
童光志研究员
王君伟教授
李景鹏教授
答辩日期：２００５年６月１６日
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
哈尔滨中国
２００５年６月
独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

旃究型签名：夕争孕勿～时间：抄ｓ年多月护日
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关于论文使用授权的声明
本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

研究生签字．；≥每叭帆护ｆ年∥月沙日
导师签字：赋闻：２刀艿年ｇ目２／｜Ｒ
弓口
马传染性贫血病瘸毒（ｅｑｕｉｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｎｅｍｉａｖｉｒｕｓ，ＥＩＡＶ）属反转录病毒科慢病毒属，是严重危害马属动物的传染病马传染性贫血病的病原体。

ＥＩＡＶ曾在反转录病毒的研究中发挥了重要作心，是第一个被确认的具有传染性的反转录病毒，也是第一个被分离山来的慢病毒。

慢病毒还包括人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－Ｉ和ＨＩＶ－２）、猴免疫缺陷病毒（ＳＩＶ）、猫免疫缺陷病毒（ＦＩＶ）、牛免疫缺陷病毒（ＢＩＶ）、绵羊梅迪一维斯纳病毒（ＭＶＶ）和山羊关节炎脑炎病毒（ＣＡＥＶ）。

慢病毒属病毒在基因组结构、复制的分子机制、抗原漂移及病毒与宿主的相互作用等方面都有类似的特征。

当前国外关于慢病毒免疫及疫苗研究所得出的结果不尽一致，有一些结论甚至互相矛盾，当然，这与慢病毒的高变异性有关。

对丁慢病毒相关疾病的防制，如ＨＩＶ引起的艾滋病和ＥＩＡＶ引起的马传贫，在病毒感染后通过治疗不能彻底清除病毒，一口－感染，或者转归死亡，或者终生带毒，唯一的防制途径只能是预防免疫。

以艾滋病为例，自１９８１年首次发现艾滋病以来，艾滋病病毒（ＨＩＶ）的感染迅速在全世界广泛流行，据ＷＨＯ估计，到本世纪初，全球艾滋病息者已超过５０００万人，同时网艾滋病而死亡的人数也超过１６００万人，到２０１０年．全球艾滋病患者将超过ｌ亿人。

人们对艾滋病病毒的研究投入了巨大人力、物力和财力，但至今没有得到理想的结果。

由丁Ｊ慢病毒主要侵害机体的免疫系统，造成持续性感染，再加上独特的感染机制，使得慢病毒疫苗的研制非常困难。

ＥＩＡＶ除具有慢病毒的共同特征外，还有其独特的地方。

如ＥＩＡＶ潜伏期短，可产生高滴度的病毒血痘和剧烈的临床病理学现象，因此可作为研究慢病毒感染致病机理的动物模型；在ＥＩＡＶ感染过科中，会｛Ｕ现新的抗原变异株，与疾病复发相关，是研究慢病毒与宿主相互作瑚过稃中抗原变异的极好模型：与其它慢病毒感染明显不同的是，慢性ＥＩＡＶ感染经历‘年左厶的时间变为隐性感染，病毒的增殖被长期抑制，感染马有正常寿命，大多数最终能控制住病毒的复制，阐明其免疫保护机制，对丁慢病毒疫曲的研究具有重要意义。

我国对马传贫的研究始ｒ解放前．在党和国家的大力支持卜，在儿代科学家的不懈努力ｒ终］：研制成功马传贫驴闩细胞弱毒疫凿，目前国外还未见有相廊有敞ＨＩＶ疫苗的报道。

我国马传贫弱毒疫苗在近二十多年中的应用中已成功控制了我国马传贫的流行，在占巴和蒙占席川也取得了良好的效果。

冈此．全面研究我国马传贫弱毒疫苗的致弱机理、保护性免疫机制将是今后研究的重要方向。

中国农业科学院博士学位论文０Ｉ苦
一、马传染性贫血病病毒概述
马传染性贫血病毒（ｅｑｕｉｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｎｅｍｉａａｉｒｕｓ，ＥＩＡＶ）引起马属动物以持续感染、反复发热和贫血为特征的急性传染病，称为马传染性贫血（ｅｑｕｉｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｎｅｍｉａ，ＥＩＡ，简称马传贫），住马属动物中造成严重的经济损失。

目前，各人洲均已发现本病，是马属动物晟重要的传染病之一。

马传染性贫血病于１８４３年首先在法国发现。

１９０４年，法国学者Ｖａｌｌｅｅ和Ｃａｒｔｅ证明，ＥＩＡ的病原是滤过性的，并首次命名为马传染性贫血病毒。

１９６１年，日本学者Ｋａｂａｙａｓｈ在体外用马驹骨髓细胞和马外周血白细胞培养ＥＩＡＶ获得成功。

从此开创了ＥＩＡＶ研究的新纪元。

７０年代初期，Ｃｏｇｇｉｎｓ博士建立了检测感染马血清抗体的琼脂扩散试验，成为检测马传贫的标准方法（ＣｏｇｇｉｎｓＬ＇ｅｔａｌ．，１９７２）。

７０年代另一项重要研究进展是中国研制成功了马传染性贫皿病毒驴白细胞弱毒疫苗（沈荣显１９８３），并在８０年代广泛用于我国马传贫的预防，现已成功控制了我国的马传贫流行．在古巴的应用亦取得了良好的敬果（孔宪刚等，１９９４）。

１９７７年，证明ＥＩＡＶ是ＲＮＡ病毒，含有反转录酶，将其划入反转录病毒科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）。

进一步的研究表明，Ｅ１ＡＶ与原型慢病毒梅迪．维斯纳病毒（ＭＶＶ）形态相似、血清学相关、基冈绸结构相似、单核一巨噬细胞嗜性相同，因此于１９８５年将其划为慢病毒属（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｒｕｓ）成员。

１９８１年首次发现爱滋病，两年后．法国巴斯德研究所的Ｌ．Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、美国ＮＩＨ的Ｒ．Ｇａｌｌｏ、旧金山的Ｌｅｖｙ几乎在同时发现人类慢病毒人免疫缺陷病毒（Ｈ！Ｖ）为艾滋病的病原。

Ｅ１ＡＶ是遗传结构最简单的慢病毒，人多数毒株的序列已被测定（Ｋａｗａｋａｍｉｅｔａｌ，，１９８７：Ｒｕｓｈｌｏｗｅｔａｌ，，１９８６；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｅｔａ１．，１９８６）。

目前已构建成功从致死性毒力到中等毒力的一系列感染性分子克隆，为在分子水平上进行厂ｆ泛深入的研究奠定了基础，ＥＩＡＶ感染Ｊ》９潜伏期只有几犬至儿周，而且在感染过箨中新抗原变异株的出现与疾病的复发相关（丁力等．１９９６）。

马传染性贫血病毒的感染会导致急’陛发热反应，经过多次发病期，最后进入长期无症状阶段。

但是马传染性贫血病有序的疾病进程即急性、慢性和无症状携带马只是儿种可能结果中的一种（ＣｈｅｅｖｅｒｓａｎｄＭｃＧｕｉｒｅ，１９８５；Ｍｏｎｔｅｌａｒｏｅｔａｌ，１９９３：Ｓｅｌｌｏｎｅｔａｌ，１９９４；Ｃｏｏｋｅｔａｌ，１９９６）。

而且ＥＩＡ所表现的不同的临床症状与病毒株、马的品种俘多种因素有关，即便是同种动物不同个体之间对ＥＩＡＶ的易感性也有所不同（Ｋｅｍｅｎｙｅｔａｌ，１９７１：ＧｕｔｅｋｕｎｓｔａｎｄＢｅｃｖａｒ’１９７９：ＣｏｏｋｅｔａＪ，１９９８；Ｐａｙｎｅｅｔａｌ，１９９４，１９９８；Ｃｏｏｋｅｔａｌ，２００１）。

在许多情况ｒ，病毒可以在包括肾、肝、脾在内的许多器官中广泛复制（ＭｃＧｕｉｒｅｅｔａｌ，１９７１；Ｒｉｃｅｅｔａ１．１９８９：ＳｅｌｌｏｎＤＣ，ｅｔａ１．，１９９２：Ｍａｌｌｒｙｅｔａｌ，１９９８；Ｏａｋｓｅｔａ１．，１９９９：Ｈａｒｒｏｌｄｅｔａｌ，２０００），从而导致病毒血症（Ｋｏｎｏ．１９６９：ｌｓｓｅｌｃｔａ１．１９９２：Ｗａｎｇｅｔａｌ，１９９４；Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ，１９９５；Ｈａｒｒｏｌｄｅｔａｌ，２０００；Ｃｏｏｋｅｔａｌ，２００１）。

发病马可弛可视粘膜出血、爸Ｒ和黄疸、体表淋巴结肿人、腹ｒ和四肢部水肿。

组织学检夯可址肿的实质细胞坏死、淋巴样细胞浸润、ｌ＿ｌ！｜皮细胞增生平¨山现含铁血黄索。

通常ｒ感染后１个月内出现急性发热（Ｏａｋｓｅｔａｌ１９９８），紧接着为反复发热的慢性阶段，感染弓往一年内一般平均经历６－８个发病期。

虽终多数感染马可以控制病毒成为隐性感染马（Ｈａｍｍｏｎｄｅｔａｌ，１９９７：２０００），叫此马传贫成为研究慢病毒免疫控制机制的良好模唰。

１国内外Ｅｌ＾ｖ毒株及特性
目前已分离到很多ＥＩＡＶ毒株，各毒株毒力有强有弱，有体外培养适应株也有非适应株。

近年来构建了几株高致病力和非致病性的感染性分子克隆，为ＥＩＡＶ的研究创造了良好的条件。

ＥＩＡＶ各毒株特性见表。

不同ＥＩＡＶ毒株的特性
毒株名特性
Ｗｙｏｍｉｎｇ野毒
１３６９
Ｍａｌｍｑｕｉｓｔ
ＣＬ－２２
ＰＥＲ－Ｖ
Ｔｈ－ｌ
ＭＡ—ｌ
Ｌ株（辽毒）
驴系马传贫强毒株（驴强毒，ＤＡ）
Ｈ株
驴［Ｊ细胞弱毒株
（ＤＬＡ）
Ｙ株
Ｖ７０
ｐＳＰＥＩＡＶｌ９
ＷＥＮＶｌ７／ＷＥＮＶｌ６
ＥＩＡＶｕＫ在美国分离到的高毒力自然毒株，毒种经马体内传代．
Ｗｙｏｍｉｎｇ野毒株适应Ｃｆ２ｔｈ细胞克隆到的非黪染性前病毒分于克隆。

由Ｗｙｏｍｉｎｇ野毒株在马皮肤成纤维细胞ｔ多代次肓传获得的适应株．奉身毒力弱．复归马体经几次传代后毒力又增强。

由Ｍａｌｍｑｕｉｓｔ株获得的无毒力感染性分子克降（ＷｈｅａｅＫｌ９９０）。

由感染性分子克隆ｐＥＲ复归后分离到的病毒，与ＣＬ．２２大致相同。

Ｈ是ｐＥＲ．的Ｕ３区由非感染性的无毒力１３６９株而得。

麻省分离的ＥＩＡＶ自然毒（强毒）接种马，在首次病毒血症期间采集的ｍ清毒。

Ｔｈ．１适应马真皮细胞，体外培养获得的非致病性毒株。

由辽宁省分离到的自然强毒。

辽毒株（Ｌ株）经过一系列的驴体传代后获得．对马和驴毒力明硅增强。

由黑龙江省分离到的白然毒。

由ＤＡ绎过驴自细胞体外培养传代致弱的疫苗毒株，接种马匹能保护马抗州源及异源强毒攻击。

新疆分离到的自然毒株。

日本分离的强毒株。

无毒力感染性分子克隆
急性敏痫的感染性分子克隆
敛病性分于克隆
２ｇａｇ基因及其编码蛋白
ＥＩＡＶｇａｇ基冈的翻译产物是分子餐为５５ｋＤａ的前体蛋白Ｐ５５Ｇａｇ，由病毒编码的蛋白酶裂解形成ＥＩＡＶ四种主要的结构蛋白：基质蛋白ＭＡ（ｐ１５，１２４氨基酸），农壳蚩向ＣＡ（ｐ２６，２３５氨基酸），核衣壳蛋白ＮＣ（ｐ１１．７６氨基酸）和附加蛋白ｐ９（５１氨基酸）。

Ｇａｇ蛋白住病毒粒子的组装过程中发挥重要的作川（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｅｔａ１．，１９８６：Ｅｒｉｃｅｔａｌ，１９９８：杨威等，２０００，）基质蛋白ＭＡ／Ｐ１５位于ｐ５５Ｇａｇ的Ｎ端，由核苷酸序列推导氨基酸序列，推测其第一个氦基酸应为Ｍｅｔ。

但氨基酸序列分析表明，Ｎ端被阻断，推测其Ｎ端Ｍｅｔ在加ｆ过稃中被去除或修饰（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎｅ１ａ１．，１９８７），这种修饰并。

眼Ｇａｇ前体的肉豆越酸化所致。

在其它慢病毒农壳前体甾向的Ｎ端仃一个肉盟蔻酸残基，目前认为，这有助丁。

该蛋向任病毒缃接硐ｆ释放过稃·¨插入－印ｆ
中国农业科学院博上学位论文‘ｊＩ高
胞膜。

另外，ｐ１５的丝氨酸和苏氨酸存在不同程度的磷酸化。

研究表明在Ｇａｇ蛋白中存在多个细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ｃＴＬ）表位、辅助性Ｔ琳巴细胞表位和Ｂ淋巴细胞表位（ＭｃＧｕｉｍｅｔａｌ，１９９４：Ｚｈａｎｇ，ｅｔａｌ，１９９９，２０００：Ｌｏｎｎｉｎｇ，ｅｔａｌ，１９９９ａ：ＭｃＧｕｉｒｅ，ｅｔａｌ，２０００；Ｌｏｎｎｉｎｇｅｔａｌ，１９９９ｂ）。

对于Ｇａｇ蛋白，ＣＴＬ表位仅存在于ｐ１５和ｐ２６蛋白．而ｐ９和ｐｌｌ蛋白没有ＣＴＬ表位。

辅助性Ｔ淋巴细胞表ｆ：：７．也存在丁ｐ１５基质蛋白和ｐ２６农壳蛋向中。

ＥＩＡＶｐ２６的Ｂ淋巴细胞表位何干Ｃ末端。

在所有ｆ纷研究马中，ｐ２６蚩向至少有～个辅助性Ｔ淋巴细胞表位。

农壳蛋向ＣＡ／ｐ２６是ＥＩＡＶ主要的核心蛋白，占病毒总蛋白含量的４０％，也是病毒重要的免疫原性蛋白之一。

ｐ２６抗原在不同毒株中高度保守，在病毒粒子中含量高且容易制备，而且感染马持续产生ｐ２６抗体，因此ｐ２６一直被选作为商品化诊断抗原。

Ｋｏｎｇ等利崩杆状病毒，昆虫细胞系统表达ｐ２６基冈，将该重组蛋白作为诊断抗原获得了良好的效果（Ｋｏｎｇｅｔａ１．，１９９７）。

Ｓｅｎｔｓｕｉ等构建了包含ｐ２６基因的重组杆状病毒．以此病毒表达产物通过ＡＧＩＤ及ＥＬＩＳＡ对试验感染马及自然赙染马进行血清学调查，同时以马细胞培养病毒的ＡＧＩＤ及ＥＬＩＳＡ作为对照，结果是一致的表明重组ＥＩＡＶｐ２６抗原对异源毒株有交叉反应，可用丁自然ＥＩＡ感染的诊断（Ｓｅｎｔｓｕｉｅｔａ１．，２００１）。

另外，ＣＡ／ｐ２６与ＨＩＶ－１的Ｐ２４蛋白同源性高，而且ＥＩＡＶ感染马血清与ＨＩＶ－１有交叉免疫沉淀反应。

后来还发现牛慢病毒（ＢＪｖ）和猫慢病毒（ＦＩＶ）的农壳蚩自与ＥＩＡＶｐ２６也有交义反席。

进一步的研究还表明，ｐ２６Ｃ末端的８３个氨基酸构成了具有高度免疫原性的结杜Ｊ域。

其中位丁１５３—１７３之间的２０个残基序列为主要同源区（ＭＨＲ），ＭＨＲ的核心序列是１５８到１７２位之间的ＫＥＰＹＰＥＦＶＤＲＬＬＳＱＩ（Ｙｏｕｎｇｅｔａ１．．１９９１），这是慢病毒抗血清之间存在交义反廊性的基础。

核衣壳蛋白ＮＣ／ｐ１１位丁＾ＣＡ／ｐ２６Ｆ游，ＮＣ最显著的特征是其县有两个Ｃｙｓ－Ｘ２一Ｃｙｓ．Ｘ４－Ｈｉｓ．Ｘ４．Ｃｙｓ（ＣＣＨＣ）型锌指结构（Ｍａｕｒｅｒｅｔａｌ，１９８８；Ｐｕｆｉｅｒｅｔａ１．，１９９８）。

锌指结构是许多ＤＮＡ结台蛋ｎ共有的结构基ＪＴ＇（ｍｏｔｉｆ），病毒粒子中ＮＣ正是通过这一结构与病毒ＲＮＡ紧密结合的。

ＮＣ是高度警碱性的蛋白，含大鼍的碱性氨基酸ｔ，ｙｓ和Ａｒｇ，这些带止电的碱性氨基酸具有与带负电的核酸结合形成核蛋白体的特性。

ＮＣ在ＲＮＡ掺八病毒粒子和病毒组装过程中起重要作用（Ｒａａｂｅｅｔａ１．，】９９８ａ），保护病毒ＲＮＡ免受核酸酶的降解。

ｐ９蛋白足由Ｅ１ＡＶ编码的一个附加蛋白，编码序列对廊于基因组中ｇａｇ－ｐｏＩ蓐霍的部分，在推测的ｇａｇ－ｐｏＩ移框何点Ｆ游。

当ｇａｇ—ｐｏｌ融合蚩白表达时，ｐ９的表达将被关ｎ】。

ｐ９与病毒组装晚期的释放有关，这一功能定何ｒｐ９蛋白２３．２６伉的ＹＸＸＬ基序上．义称为病毒晚｝ｃ｜ｊ翔装功能区（１ａｔｅｄｏｍａｉｎ）（ｗｈｅＲｅｒＬＤｅｔａｌ，１９９０）。

ＣｈｅｎＣ，ＬｉＦ住研究ＥｌＡＶＧａｇ蛋白ｐ９在病毒山芽及感染中的作Ⅲ时指山：以前的研究认为ｐ９蛋白的功能是完成病毒晚期包装并将病毒粒子从包浆膜上释放，是由ＹＰＤＬ基序（Ｌ－结构域）介导的，通过构建了一系列ｐ９基冈截断及点突变的前病毒感染性分子克隆，进一步研究ｐ９蚩自在病毒的包装和复制过程中的作Ｊ｛ｊ，±．｛果发现ｐ９住ＥＩＡＶ对病毒的ｆＪｊ芽并不是绝对需要的，这表明存在其他病毒蟹白雨ｌｐ９一起共同介导病毒的晚期出芽．同时也表明在ＥＩＡＶ的复制中，Ｇａｇ蛋向还有我”Ｊ以前尚术认识剑的作剧ｆＣｈｅｎｅｔａｌ，２００１）。

Ｌｉ等住研究ＥＩＡＶ同源性及异源性Ｌ结构域的功能性替换和何置依赖性刚．分别以ＨＩＶ－１利ＲＳＶ的Ｌ结构域中的ＰＴＡＰ相ｌＰＰＰＹ替换ＥＩＡＶ－Ｌ结构域中的ＹＰＤＬ，表明ＥＩＡＶｐ９Ｌ结』＝｝！Ｊ域对ｊ‘病毒的山芽和感染有州显作＿Ｌ｝』，例时发现牲口９的存在ｈＨｆｖ＿ｉ的Ｐ’ｒＡＰ和ＲＳＶｎ勺ＰＰＰＹ
可有效帮助ＥＩＡＶ的出芽和感染性，考虑到ＹＰＤＬ、ＰＴＡＰ及ＰＰＰＹ有着截然不同的特异性结合特征，以上结果表明有不同的途径进入同一细胞来介导病毒的出芽和感染（Ｌｉｅｔａ１．．２００２）。

３ｐｏｌ基因及其编码产物
ｐｏＩ基因编码病毒复制所需的各种酶类，包括蛋白酶【ｐｒｏｔｅａｓｅ）、反转录酶（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＲＴａｓｅ）、脱氧尿嘧啶核苜酸酶（ｄＵＴＰａｓｅ）及整合酶（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）。

蛋白酶的分子量为１０ｋＤａ，由１０４个氨基酸组成。

分子结构中包含底物结合区和底物作用区，蛋白酶的功能是裂解病毒的前体蛋白。

ｄＵＴＰａｓｅ位于ＲＮａｓｅＨ与整和酶之间。

ｄＵＴＰａｓｅ对丁Ｉ病毒在分化细胞上的复制是１＃必需的，但对于在非分化的巨噬细胞中，病毒的有效复制需要ｄＵＴＰａｓｅ（Ｄｅｂｏｒａｈｅｔａｌ，１９９３：Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎｅｔａ１．，１９９５）。

ＥＩＡＶ反转录酶基因与其他反转录病毒如ＨＩＶ同一基冈具有同源性。

根据这一同源性，用ＨＩＶ－Ｉ反转录酶的单克隆抗体亲合层析法可纯化得到ＥＩＡＶ的反转录酶。

反转录酶有三种活性：即依赖于ＲＮＡ的ＤＮＡ聚合活性，依赖ＤＮＡ的ＤＮＡ聚台活性和ＲＮａｓｅＨ活性。

根据反转录酶氨基酸序列的保守性，可以分析各反转录病毒问亲缘关系。

４ｅｎｖ基因及其编码产物
ｅｎｖ基冈转录后经过单剪接产生了约４．２ｋｂ的ｍＲＮＡ，经细胞翻泽系统合成糖蛋白前体，然后由蛋白水解酶裂解为表面蛋白（ｓｕ）ｇｐ９０平｜Ｊ跨膜蚩白（ＴＭ）ｇｐ４５，它们都含有中和抗原决定簇。

反转录病毒的囊膜蛋白通过与细胞受体作Ｈ｛影响病毒的细胞嗜性，也是介导细胞融合和病毒穿入细胞过程中的重要作用成分。

在宿主对反转录病毒感染的免疫虑答中，囊膜蛋白是中和抗体和细胞毒Ｔ细胞的主要靶分子（Ｌｏｎｎｉｎｇｅｔａｌ．，１９９９）。

４１表面蛋白（ＳＵ／ｇｐ９０）
ｇｐ９０是高度糖基化的蛋白，不同毒株的病毒分别禽有１３．１７个Ｎ．连接糖化何点。

糖化也是慢病毒囊膜蛋白的共有特征，糖侧链具有重要生物学功能：在病毒与靶细胞的结合过科中，糖侧链能稳定囊膜蛋白构型，有利丁病毒与靶细胞的结台。

糖侧链还有助ＴＩ囊膜生白止确折叠，形成ｌＬ确的构象。

在哺乳动物细胞中加入抑制剂抑制Ｎ．连接寡糖的生物合成时．病毒感染性和合胞体（ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ）形成能力都会显著降低（Ｒｅｉｔｔｅｒｅｔａ１．，１９９８）。

病毒囊膜的变异主要集中住ｇｐ９０区．ｇｐ４５的变异牧少（Ｌｅｒｏｕｘｅｔａｌ，１９９７；Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎｃｔａｌ，１９９６：Ｐａｙｎｅｅｔａ１．１９８７；Ｚｈｅｎｇｅｔａ１．１９９７ａ：Ｚｈｅｎｇｅｔａｌ，１９９７ｂ）。

ｇｐ９０是ＥＩＡＶ变骨比较集中㈨×：域之一，变异卡要集中在Ｃｙｓ环状坌古构和高变区（ＨＶＲ）。

随着研究的不断深入平『ｆ数据积累，义将ｇｐ９０的变异『×细分为８个可变阿．分ｊ；ＪＪ命名为Ｖ１、Ｖ８，井提出Ｖ３区与ＨＩＶ－ｌ的Ｖ３结构（Ｃｙｓ环）侄功能（重要－ＪＪ和区，ＰＮＤ）上是相剥麻的。

ＲＮＡ病毒的基冈绑突变率是每个复制周川，每位点订１０－３＿１０”５个核廿－酸替换。

在宿主的选抒ｒＫ／Ｊ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｐｒｅｓｓｕｒｃ）Ｈ儿体一㈨≈球是ｆ｛＿ｊｎ爹突变株构成的钟』别＋１‘柑体，其。

ｔ吖ｊ‘个或儿个
占优势的突变株，叫做病毒的准种。

慢病毒具有高度的抗原变异性，用Ｅ１ＡＶ接种矮种马并连续分离病毒进行序列比较，发现∞ｖ基因每年每点有１０一．１０。

个替换。

馒病毒是一个由密切相关的准种构成的异质性群体。

Ｅ１ＡＶ的抗原变异现象正是这种高度变异的反映，这种高度变异的特性给慢病毒疫苗的研究造成很大障碍。

ＥＩＡＶｇｐ９０的Ｎ一连接糖基化位点位置和数目与病毒生物学特性有一定的关系。

Ｎ．连接糖基化同样也是慢病毒研究共同面临的问题，糖基化位置和数目与病毒生物学特性关系紧密（ＲｅｉｔｔｅｒａｎｄＤｃｓｒｏｓｉｅｒｓ，１９９８：Ｏｈｇｉｍｏｔｏｅ＇ｔａ１．，１９９８；Ｌｅｏｎａｒｄｅｔａ１．，１９９０）。

最近构建的几个致病性ＥＩＡＶ分子克隆体现出了一定的规律性。

ｐＳＰＥＩＡＶｌ９是ＷＥＮＶｌ７和ＷＥＮＶｌ６的亲本感染性分子克隆，ＷＥＮＶｌ７和ＷＥＮＶｌ６是将致病性ＥＩＡＶ基因组３’端片段重组到非致病性分子克隆而获得的致病性分子克隆，ＷＥＮＶｌ７和ＷＥＮＶｌ６ＥＩＡＶ的Ｎ一连接糖基化位点均比其非致病亲本株多（Ｐａｙｎｅｅｔａ１．，１９９８）。

在对ＳＩＶ的研究也发现，伴随着Ｎ．连接糖基化位点的增多，病毒毒力增强（Ｅｄｍｏｎｓｏｎｃｔａｌ．．１９９８）。

ｇｐ９０是ＥＩＡＶ变异比较集中的区域之一，ｇｐ９０的变异率比ｇｐ４５多２—３倍。

从一匹感染矮马在不同时间获得四个分离物，对其ｅｌｌＶ序列比较发现，所有核苷酸序列的变化儿乎都是由单碱基替换引起的，只有一个三碱基插入，无移码突变，７５％的核苷酸变异能引起氨基酸替换（ＢｈａｒａｔＰａｒｅｋｈｅｔａ１．，１９８０）。

通过序列分析和抗原性分析，发现ｇｐ９０含有两个稳定区和一个可变区（Ｂａｌｌｅｔａ１．，１９９２）。

有人研究ＥＩＡＶ基因组在病程中及非病程中幼马中的进化，对感染幼马急性期及稳定期血浆中病毒ＲＮＡ基因组进行检测来研究囊膜变异情况．结果发现，病毒囊膜ｇｐ９０在持续性感染中的变异不体现发病周期的次数和慢性感染期的病毒血症情况，也不依赖于Ｋ期无症状感染时期病毒出现稳定复制水平。

总之，ＥＩＡＶ的变异主要与病毒持续性低水平复制及靶组织的选择密切相关，即使没有病毒血症的存在，囊膜在持续性感染的各个时期仍然持续变异以逃避宿主防御机制的清除（Ｌｅｒｏｕｘｅｔａ１．，２００１）。

Ｂａｌｌ以新生鼠为模型对ＥＩＡＶ致病性和非致病性表面囊膜蛋白（ＳＵ）进行研究发现，两种表面囊膜蛋白生物学特性有明显的区别，致病性表面囊膜蛋白可导致新生鼠腹泻（Ｂａｌｌｅｔａ１．，２００５）。

４．２跨膜蛋白（ｒＭ／ｇｐ４５）
ｇｐ４５是轻度糖化的疏水性蛋白，镶嵌在病毒囊膜的脂质烈层之中。

ｇｐ４５的４１５个氪基酸残基中有４个Ｎ一连接糖化位点。

ＥＩＡＶ的ｇｐ４５具有反转录病毒穿膜蛋白的一些共同特征：有两个高度疏水陌，疏水区中间由１１０．１６０氮基酸肽段隔开。

Ｎ．端的疏水区称为融合区，该区在病毒囊膜与细胞膜融合时发挥作用促使膜融合。

靠近ｃ一端的疏水区叫做穿膜锚，横跨在病毒囊膜上起『刊着作用（Ｎａｎｃｙｅｔａｌ．，１９９０：Ｃｈｏｎｇｅｔａ１．，１９９１）。

所有Ｂ、Ｃ、Ｄ刑反转录病毒和ＨＩＶ－ｌ的下Ｍ崔白都在穿膜锚之后有１００个左☆氨基酸，而ＥＩＡＶ有２００个氮基酸（Ｌｕｃｉｗｅｔａ１．，１９９８）。

同ｇｐ９０相比，ｇｐ４５要稳定得多。

从一匹感染矮马在不同时间获得四个分离物，对其ｅｎｖｙ比较发现（Ｐａｙｎｅｅｔａ１．，１９８７），四个变异株的ｇｐ４５之间的氨基酸序列芹异为Ｏ．７～２％．Ｎ一端比Ｃ．端更稳定，两个疏水区和四个Ｎ．连接糖化何点在所有变异株中均是保守的。