结核分枝杆菌DNA分子生物学检测临床诊断价值探讨

结核分枝杆菌DNA分子生物学检测临床诊断价值探讨
探讨利用结核分枝杆菌的核酸扩增（PCR）技术，检测结核杆菌DNA在临床诊断中的价值。

方法采用病例对照研究方法，各组诊断采用双盲法，对健康对照组血标本，胸膜炎的胸水标本、腹膜炎的腹水标本、脑膜炎的脑脊液标本和有泌尿系症状的尿液标本，咳痰患者的痰标本进行PCR扩增及ABI—7300仪器荧光检测结核分枝杆菌DNA定量。

应用统计学分析阳性率、敏感性、特异性及各组间的统计学意义。

结果共检测427例，其中初治涂阳肺结核100例，初治涂阴肺结核100例，肺外结核100例，肺部其他疾病77例，健康对照50例。

结核杆菌DNA检测初治涂阳肺结核的阳性率86.0%、敏感性86.0%、特异性96.0%；阳性预测值97.7%、阴性预测值77.4%。

初治涂阴肺结核的阳性率42.0%、敏感性42.0%、特异性96.0%；阳性预测值95.5%、阴性预测值45.3%。

肺外结核的阳性率34.0%、敏感性34.0%、特异性96.0%。

阳性预测值94.4%、阴性预测值42.1%。

结论结核分枝杆菌DNA 分子生物学检测技术是对传统诊断活动性结核病实验室诊断方法的补充，具有较高的敏感性和特异性，对结核病的诊断有重要的诊断价值，成为结核病诊断和研究的重要手段。

【关键词】肺结核；结核分枝杆菌；核酸扩增（PCR）；结核杆菌DNA
结核病的实验室诊断方法为结核分枝杆菌的痰涂片和改良罗氏培养法，然而，涂片的阳性率低、培养费时且阳性率不高。

近年来，临床上应用聚合酶链反应（PCR）技术，进行结核分枝杆菌分子生物学检测，灵敏性及特异性高，为结核病的诊断提供了重要的诊断价值，现分析如下。

1 资料与方法
1.1 研究对象病例组：选择2010-01-01/2010-12-31住院病例487例，其中男性263例，女性224例，年龄15~87岁。

临床症状：咳嗽425例，咳痰368例，胸闷、气短187例，呼吸困难73例，胸痛98例，发热203例，乏力335例，消瘦139例，尿频、尿急、尿痛82例，腰部酸痛13例，头痛20例，腹痛34例，食欲差296例。

入院时患者诊断均不确定。

依据诊断标准，最后确定377例为病例组研究对象。

健康对照组：同时选择医院50例健康人群设对照组，男5例，女45例，年龄21~55岁。

1.2 诊断标准结核病诊断[1] ：涂阳肺结核诊断病例符合下列条件之一者：（1）直接痰涂片镜检抗酸杆菌阳性2次；（2）直接痰涂片镜检抗酸杆菌阳性1次，且胸片显示有活动性肺结核病变；（3）直接痰涂片镜检抗酸杆菌阳性1次加结核分枝杆菌培养阳性1次。

涂阴肺结核病例诊断要点：肺部有结核病变，直接痰涂片阴性或结核分枝杆菌培养阴性的肺结核，其诊断要点为：（1）具有典型肺结核临床症状和胸部X线表现；（2）抗结核治疗有效；（3）临床可排除其他非结核性肺部疾病；（4）BALF（支气管肺泡灌洗液）检出抗酸杆菌；（5）支气管或肺部组织病理检查证实结核性改变；（6）结核菌素（PPD5IU）皮肤试验强阳性，血清抗结核抗体阳性；（7）痰结核分支杆菌PCR探针检测阳性；（8）肺外结核部分病理检查证实结核病变或/和体液中抗酸杆菌阳性。

肺外结核病包括结核性胸膜炎、结核性腹膜炎、结核性心包炎、结核性脑膜炎、颈部淋巴结结核、肾结核。

非结核肺部疾病的诊断[2]包括肺炎、气管支气管炎、慢性阻塞性肺疾病。

1.3 实验方法
1.3.1 留取标本采集50份健康对照组血标本及采集治疗前患者各类临床标本，血标本146份、胸水标本67份、腹水标本30份、脑脊液标本8份、尿液标本82份，痰标本352份。

1.3.2 PCR法TB-DNA检测采用实时荧光定量PCR法。

试剂盒为达安基因公司产品。

取试验标本置于无菌密封瓶，加入等量4% NaOH消化液，静置30min，吸取1ml，12 000r离心5min，弃上清，加入DNA提取液,100℃恒温处理10min，取上清2μl至PCR 反应管内,反应管置定量PCR 扩增仪(ABI 7300型) 内,按以下条件进行扩增:93℃→2 min 预变
性,93 ℃45s→55 ℃60s10 个循环,93 ℃30 秒→55 ℃45 s30 个循环。

扩增过程中仪器实时检测荧光强度并分析增长曲线,根据Ct值计算出样本中TB-DNA含量(基因拷贝数/ml )。

阳性判定标准为:增长曲线呈典型S 型,最强荧光值较基础荧光值增高20单位以上。

1.3.3 抗酸杆菌检测每日留取晨痰标本做浓缩集菌抗酸杆菌检测，连续3次。

1.4 统计分析方法采用病例对照研究方法。

依赖于四格表，进行计算[3]。

率的比较采用X2检验。

2 结果
487例患者依据临床表现及相关辅助检查，最后确定诊断，并选择资料完整，符合要求的377例进行分析，其中初治涂阳肺结核组100例、初治涂阴肺结核组100例、肺外结核组100例、肺部其他疾病组77例。

2.1 结核分枝杆菌DNA检测结果5组研究对象结核分枝杆菌DNA检测阳性率分别为86.0%、42.0%、34.0%、14.3%和4.0%，涂阳肺结核阳性率最高，各组差异有统计学意义（X2 =136.854，P＜0.01），见表1。

2.2 初治涂阳肺结核患者结核分枝杆菌DNA检测结果100例初治涂阳肺结核患者分枝杆菌DNA阳性率为86%，经统计学分析，其结核分枝杆菌DNA检测敏感性86.0%，特异性96.0%，阳性预测值97.7%，阴性预测值77.4%，见表2。

2.3 初治涂阴肺结核患者结核分枝杆菌DNA检测结果分析100例初治涂阴肺结核患者结核分枝杆菌DNA阳性率为42%，经统计学分析，其结核分枝杆菌DNA检测敏感性42.0%，特异性96.0%，阳性预测值95.5%，阴性预测值45.3%，见表3。

2.4 肺外结核患者结核分枝杆菌DNA检测结果分析100例肺外结核患者结核分枝杆菌DNA阳性率为34%，经统计学分析，肺外结核患者结核分枝杆菌DNA检测敏感性34.0%，特异性96.0%，阳性预测值94.4%，阴性预测值42.1%，见表4。

3 讨论
结核病被认定为全球卫生紧急事件已有10余年.自20世纪80年代以来,该疾病有呈上升的趋势.如何快速诊断和治疗对防止结核病的传播意义重大.寻找一种特异、敏感、早期、快速、简便和预测预后的结核病细菌学检查方法是大家共同期盼的.结核分支杆菌(MTB)感染的实验室诊断主要包括细菌学检测、免疫学诊断、分子生物学诊断3方面的技术[4]。

WHO在全球结核病控制规划中指出,结核病主要应通过实验室诊断获得确诊.这一文件确立了实验室诊断在结核病控制中的重要作用.传统的结核病实验室检查主要是涂片抗酸染色检查和结核分枝杆菌(Mvcobacterium tuberculosis, MTB)培养法。

抗酸染色检查敏感性差,细菌量至少要大于5×106/L才能检测到阳性结果,而且无法区分MTB和非MTB感染。

MTB 培养阳性是TB诊断的金标准,但报告周期过长(2～8周),很难满足临床需要[5]。

近半个世纪以来,以DNA双螺旋结构、DNA重组技术以及人类基因组学为标志的分子生物学的蓬勃发展,带动了整个生命科学乃至相关学科的发展,成为生物学的带头学科。

分子生物学的理论与技术引进并渗透进结核病的多个领域,促进了结核病分子生物学的兴起与发展[6]。

结核分枝杆菌核酸扩增（PCR）诞生于1985年，由美国Muliis等发明。

PCR是由一对特定寡核苷酸引物介导的检测结核杆菌核酸中特异序列片段的体外酶促扩增技术，结核杆菌特异的靶序列
在体外通过不同温度循环，进行变性、复性、延伸，可使待检拷贝达数百万倍扩增而便于检出。

2000年美国CDC对核酸扩增检测（NAA）评价结果：涂阳标本的敏感性、特异性可达95%~96%及100%，而涂阴标本则各是48%~53%及96%~99%。

对涂阴患者在保证特异性在95%以上的条件下可提供50%的阳性率，是有助于临床诊断的[7]。

该研究是利用结核分枝杆菌的核酸体外扩增技术诊断结核病，分析此方法的灵敏性和特异性。

该项研究结果为结核分枝杆菌DNA检测初治涂阳肺结核的阳性率86.0%、敏感性86.0%、特异性96.0%；阳性预测值97.7%、阴性预测值77.4%。

初治涂阴肺结核的阳性率42.0%、敏感性42.0%、特异性96.0%；阳性预测值95.5%、阴性预测值45.3%。

肺外结核的阳性率34.0%、敏感性34.0%、特异性96.0%。

阳性预测值94.4%、阴性预测值42.1%。

实验特异性较高，说明诊断结核病的假阴性较低，与预期结果基本相符合，与文献报道一致[8]。

这项检测技术有较高的敏感性及特异性，并且高于痰涂片的敏感性及特异性，应用于临床，可提高结核病的诊断率，减少漏诊率。

这种方法是对传统的诊断活动性结核患者的实验室方法的补充。

该方法已成为结核病诊断和研究的重要手段,为结核病的诊断提供重要依据，更好的防治结核病[9]。

4 参考文献
[1] 中华医学会. 临床诊疗指南/结核病分册[M]. 北京：人民卫生出版社，2006：1-121.
[2] 中华医学会. 临床诊疗指南/呼吸病学分册[M]. 北京：人民卫生出版社，2009：1-174.
[3] 宋文虎.结核病诊断方法的敏感性、特异性和预测值[J].中国防痨通讯,1987,9（4）:180-182.
[4] 石榴,黄文杰.结核病实验室诊断技术新进展[J]. 广东医学，2008，29（11）:1770-1771.
[5] 陈建.结核分枝杆菌分子生物学分型技术研究进展，中华流行病学杂志，2008，29（5）:67-69.
[6] 吴雪琼，庄玉辉，张晓刚，等.聚合酶链反应和DNA探针联合检测临床标本中结核杆菌的研究[J].中华结核和呼吸杂志，1996，19：37-40.
[7] P D O Davies,M Pai .结核病的诊断与误诊[J].国际结核病与肺部疾病杂志（中文版）,2009,4（1）:38-45.
[8] 雷建平，熊国亮，苏钢，等.外周血淋巴细胞部份结核菌DNA检测的探讨[J].中国防痨杂志，1997，19（3）：131-132.
[9] 端木宏廑，赵雁林．结核病研究进展及热点[J]．结核病与胸部肿瘤，2002，(1)：1—4．。