何首乌中二苯乙烯苷的制备及抗氧化机理研究

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以ＢＨＴ、Ｖｃ、白藜芦醇（ＲＥ）为对照，分别对二苯乙烯苷（ｓＧ）、大孔吸附树脂 分离样品（ＲＦ—ｓＧ）、何首乌租提物（Ｃ－ＳＧ）体外抗氧化性能进行测定。考察了亚油酸 体系抗氧化性，还原性，ＤＰＰＨ自由基、超氧阴离子、羟自由基、Ｈ２０２清除能力以及金 属鏊合性。得出结论：从何首乌中提取的不同纯度的二苯乙烯苷样品均具有抗氧化、清 除自由基功能。其活性强弱依次为ＳＧ、ＲＦ．ＳＧ、Ｃ－ＳＧ。与常用抗氧化剂ＢＨＴ、Ｖｃ对 照，ｓＧ亚油酸体系抗氧化性、还原性、清除ＤＰＰＨ自由基能力相对较弱；而清除超氧 阴离子、羟基自由基、Ｈ２０２能力要高于ＢＨＴ、Ｖｃ。而与结构相似的ＲＥ对照，ｓＧ优于 ＲＥ，原因是在结构上ｓＧ比ＲＥ多形成了一个（２．Ｏ．Ｇｌｕ）糖苷；由此２．糖苷的推电子 效应，可以使对位羟基（ｃ５－０Ｈ）所形成的苯氧自由基更为稳定，以便终止自由基链反
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摘要
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何首乌（，Ｄ易翟ｒＤ疗堋ｍ“的％ｒ“ｍ ７７ｉ搠６）为蓼科多年生草本植物的块根，是我国传统的
延年益寿的中草药。何首鸟中主要的功效性成分＝苯乙烯苷近年来成为研究的热点。文 献报道了其多项生理功能：抗氧化、清除自由基；抗肿瘤；降低胆固醇；抑制动脉粥样 状硬化；保护肝脏；具有血管舒张作用；防治老年痴呆；提高记忆等功效。其间以抗氧 化、清除自由基性能最为突出。故本课题以贵州何首乌为原料，建立了分离纯化的工艺 路线，分离制备得到二苯乙烯苷晶体，深入探讨了二苯乙烯苷抗氧化性能及抗氧化机理， 为进一步研究何首乌的药理提供了理论基础。 在分析选取何首乌原料后，研究二苯乙烯苷的分离提取工艺。运用溶剂提取、壳聚 糖絮凝澄清、大孑Ｌ吸附树脂分离技术分离纯化何首乌中二苯乙烯苷。首先，通过单因素、 中心组合实验，运用响应面分析法优化了水提取工艺条件，得到最佳条件为：固．液比 １：１５，温度５０℃，时间４０ｍｉｎ。而后，对水提浓缩液选用壳聚糖为絮凝剂进行了澄清以 除去蛋白、果胶等大分子杂质，通过正交实验得到最佳条件为：壳聚糖添加量：Ｏ．３ｍ酌ｎＬ， ｐＨ值４．５，温度２０℃。最后，对１５种大孔吸附树脂进行静态吸附实验，优选出５种吸 附率高，解吸效果良好的树脂进行了静态吸附动力学、静态吸附等温线方程的拟和实验， 考察了树脂的吸附速率以及溶液浓度与饱和吸附量了的关系，最终选出大孔吸附树脂 ＨＰＤｌｏｏ作为分离纯化二苯乙烯苷的最佳树脂。继而分别对树脂的动态吸附条件：进样 浓度、流速、进样ｐＨ值、洗脱溶液进行了优化，最终确定相关柱条件，洗脱方式为先 用２０％乙醇洗脱除去部分杂质，在用４０％乙醇洗脱目标产物二苯乙烯苷，使得最终产物 纯度为８４．４７％，得率为７５．１２％。 应用聚酰胺柱层析系统初步纯化了何首乌的乙醇粗提液，而后通过溶剂结晶技术， 首次分离得到了二苯乙烯苷白色针状晶体，液．质（ＬＣ．ＭＳ）联用测定纯度为９９．４９％， 相对分子质量为４０６；通过核磁共振分析（ＮＭＲ）鉴定其结构：并运用ｘ．射线衍射、 差示扫描量热分析（ＤＳＣ）、热重分析（ＴＧＡ）等技术对晶体性质进行了初步测定，证 明二苯乙烯苷不存在同质多晶现象，仅有一种针状晶体存在形式，且不含结晶水，熔点
氧化能力明显优于白藜芦醇。随后建立Ｄ．半乳糖致衰小鼠模型（注射ｌｏｏｍｇｍ鲋Ｄ一半
乳糖４２天），选用２个剂量（２０ｍｇ，ｋｇ，ｄ；４０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）分别以ＳＧ及ＲＦ．ｓＧ给小鼠灌胃， 结果表明：给药组小鼠的血清、肝脏、心脏、脑组织的ＭＤＡ均低于模型组，ＳＯＤ、ＧＳＨ．Ｐｘ 均高于模型组；各项指标值接近正常组。充分体现了二苯乙烯苷的抗氧化之功效。 通过＝苯乙烯苷与Ｈ２０２作用，分离纯化得到四个主要氧化代谢产物，并通过 ＬＣ—ＭＳ、ＮＭＲ鉴定结构，其中得率最高的主要产物为二聚体一＝苯乙烯苷给出氢质子， 后自身聚合而成。由此产物结构判定二苯乙烯苷抗氧化作用的反应位点为苯环上Ｃ５．ＯＨ 最活泼，易于给出Ｈ原子。其次两个为二苯乙烯苷氧化双键断开的降解产物；另外一个 为二苯乙烯苷被氧化为二联苯。 运用柱层析分离手段，纯化ＤＰＰＨ自由基诱导二苯乙烯苷的氧化产物，ＬＣ．ＭＳ证 明得到主要产物多为二苯乙烯苷的二聚体，且均为同分异构体。最终分离鉴定出一个二 聚体，为苯环上Ｃ４’－０Ｈ给出氢原子，进而形成稳定二聚体。
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江南大学博士学位论文
应，从而提高抗氧化能力。 通过量子化学计算机模拟计算，分别从分子的前线轨道理论，各原子的净电荷数， 以及苯氧自由基的生成热等方面，推测出二苯乙烯苷苯环上ｃ５．ＯＨ、ｃ４・．ｏＨ抗氧化的活 性较强。 为了进一步讨论构效关系，将二苯乙烯苷酶解，比较二苯乙烯苷与苷元的清除ＤＰＰＨ 自由基效果，因为苷元存在邻位酚羟基形成分子内氢键，苷元清除ＤＰＰＨ自由基能力高 于二苯乙烯苷。 在测定了二苯乙烯苷体外抗氧化、清除自由基作用基础上，进一步考察了二苯乙烯 苷小鼠体内的功效。首先，对照白藜芦醇，分别考察了何首乌中不同纯度二苯乙烯苷样 品对小鼠心脏、肝脏、脑离体组织脂质过氧化的抑制率。证实了二苯乙烯苷抑制脂质过
关键词：
二苯乙烯苷何首乌抗氧化清除自由基抗氧化机理
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