采用正交设计方法优化观赏桃ISSR-PCR反应体系

采用正交设计方法优化观赏桃ISSR-PCR反应体系
肖琳;曾艳玲;刘卫东
【摘要】In order to obtain the optimal ISSR-PCR reaction system of Prunus persica,and lay a foundation for studying genetic diversity of ornamental peach,concentrations of five factors (Taq DNA polymerase,Mg2 +,DNA template,dNTPs and primer) in P.persica ISSR-PCR amplification system were researched by using the method of orthogonal design,and data were analyzed by using software.The results showed that the optimal ISSR-PCR system was 0.4 U Taq DNA polymerase,1 mmol/L Mg2 +,10-80 ng DNA template,0.20 mmol/L dNPs and 0.3 μmol/L primer in 25 μL reaction system.The results of radient PCR showed the optimal annealing temperature for [SSR-PCR reaction was 49.3 ℃.The system was stable and reproducible,and could be used in the future researches on P.persica.%为了获得观赏桃ISSR-PCR最佳反应体系,并为观赏桃遗传多样性研究打下基础,采用正交设计的方法对观赏桃ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq DNA 聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物)的浓度进行研究,用SPSS软件处理分析数据.试验结果表明,观赏桃的最佳反应体系(25 μL)为Taq DNA聚合酶0.4 U,1 mmol/L Mg2+,模板DNA10～80 ng,dNTPs 0.20 mmol/L,引物浓度0.3 μmol/L,并且在梯度退火试验后发现49.3℃为最佳退火温度.这一体系反应稳定、重复性强,可以用于观赏桃基因研究.
【期刊名称】《经济林研究》
【年(卷),期】2017(035)004
【总页数】5页(P136-140)
【关键词】观赏桃;正交设计;ISSR-PCR
【作者】肖琳;曾艳玲;刘卫东
【作者单位】中南林业科技大学,湖南长沙410004;中南林业科技大学,湖南长沙410004;中南林业科技大学,湖南长沙410004
【正文语种】中文
【中图分类】S662.1
ISSR分子标记技术是对品种进行鉴别和进行亲缘关系分析的有效工具，可以直接
反映DNA基因组的变异水平[1]，具有操作简单、快速灵敏、重复性好的特点[2]，已被广泛用于多种植物的遗传多样性研究[3]。

桃Prunus persica (L.) Batsch系蔷薇科Rosaceae桃李属Prunus桃亚属Amygduhis，为落叶小乔木，最早起源于我国的西部地区，如今在我国广泛分布，是我国最古老的树种之一[4]。

桃按照类型可分为观赏桃和食用桃[5]，根据目前的
市场需求，培育出集观赏和食用于一体的观赏食用桃是目前培育桃树新品种面临的重要问题[6]，但是观赏桃树体品种众多，生命周期长，基因高度杂合，基因背景
复杂[7]，使得品种筛选变得十分困难。

本试验中采用正交试验法，选取4个水平，对观赏桃的ISSR-PCR反应体系的5个因素（Taq DNA聚合酶、Mg2＋、模板DNA、引物的浓度）进行研究，并利用SPSS17.0软件进行科学分析，以期建立
一个较为科学的反应体系。

本试验中选择4年生且生理条件良好，无病虫害，地径、树高及冠幅等条件基本
一致的观赏桃品种‘寿红’Prunus persica ‘Shouhong’作为材料，采集当年
生叶片、嫩芽置于－70 ℃冰箱备用。

引物参照加拿大哥伦比亚大学UBC公司
2006年公布的ISSR引物序列，由上海英骏生物技术有限公司合成。

采用改进CTAB法[8]提取基因组DNA，并利用核酸蛋白质分析仪对DNA的吸光度值（OD260/OD280）及DNA的浓度进行检测[9]。

参照陈云霞[10]、何刚[11]、巨秀婷[12]等人的研究方法，采取5个因素（Taq DNA聚合酶、Mg2＋、模板DNA、DNTPs、引物）4水平的正交试验（见表1），然后通过正交试验设计（见表2）对16个反应体系进行测试比较，筛选出
最佳的反应条件的因素组合，确立最佳反应体系。

以经过初步筛选的UBC811为引物，反应总体积为25 µL，将表2中的16个处理在PCR仪上进行PCR扩增反应，扩增程序为：初步反应程序为94 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再
延伸8 min；4 ℃保温。

PCR产物经由电泳后，用凝胶成像系统自动成像，并进
行拍照观察。

在确定正交试验的最佳反应体系的基础上，对退火温度进行梯度试验，设定退火温度47～57 ℃，由PCR扩增仪自动生成8个温度梯度，分别是 47.0、47.9、49.3、51.0、53.3、55.1、56.3、57.0 ℃。

确定最佳退火温度后，设定循环次数
皆为30，反应程序同PCR正交试验设计。

根据表2设计的16个处理重复进行3次试验，将得到的产物分别进行电泳，结果如图1A～C所示。

参照文献[13-15]，依据图1效果依次计分，条带数多且清晰明亮，背景数低的计为16分；条带模糊，产生弥散条带，反应特异性低的计为1分。

3次试验分别统计，按照处理顺序依次计分为：2、3、1、15、10、5、14、6、12、13、4、11、16、9、8、7；2、3、1、7、8、6、14、9、5、13、4、10、11、12、16、15；2、7、5、9、6、4、15、11、8、13、1、3、12、10、14、16。

从结果上看，数据较为一致。

利用SPSS17.0软件将上述处理结果与评分结果进行方差分析，结果见表3。

由表
3可见，Taq DNA聚合酶对反应结果影响最大，模板DNA影响程度最小，Mg2
＋及引物的浓度均会对试验结果产生较为明显的影响，而模板DNA的浓度影响较小，因此需要进一步进行因素内的多重比较分析。

在方差分析之后，为了了解各因素不同水平对ISSR-PCR的影响，利用SPSS17.0软件对每个因素的各水平做多重比较，评价结果如图2所示。

Taq DNA聚合酶在所选梯度范围内对PCR结果影响最大。

从图2A可以看出，0.1 U时反应效果欠佳，而0.4 U与0.6 U水平之间差距不显著，而0.2～0.4 U水平之间有较大的提升，结合图1电泳结果可得出，当Taq DNA聚合酶浓度过低时条带颜色浅、不清晰，相反浓度过高时条带过亮导致模糊，所以在25 µL体系中，Taq DNA聚合酶浓度为0.4 U时效果最佳。

Mg2＋在所选梯度范围内对PCR结果也有着重要的影响。

从图2B可以看出，
Mg2＋浓度在1 mmol/L与2 mmol/L时差距不大且都接近最佳试验反应效果，
相较之下1.5和2.5 mmol/L时表现效果欠佳，再次参照图1电泳结果进行对比，可以发现Mg2＋在浓度为1 mmol/L时效果更好，条带更为清晰，所以这里1 mmol/L作为试验反应的Mg2＋浓度。

模板DNA的含量对PCR试验也具有影响，当模板DNA含量为10、20及40 ng 时，水平间表现无明显差异，当含量从40 ng提升至80 ng时，试验效果才有了
微小的提升，考虑到模板DNA对PCR试验结果影响不大，所以在本试验25 µL
的体系中，模板DNA含量可以取10～80 ng之间的任意数值。

dDTPs也是影响PCR试验效果的因素之一。

从图2D可以看出，dDTPs对试验的影响作用在0.10、0.20及0.25 mmol/L时差异性不明显，而0.15 mmol/L时效
果不够理想，将浓度0.10 mmol/L时的结果与0.20及0.25 mmol/L时进行对比，由于从0.20至0.25 mmol/L时呈上升趋势且考虑到试验成本问题，故选择0.20 mmol/L作为最佳浓度。

在所选梯度范围中引物的浓度对PCR结果产生了重要影响，在引物浓度从0.1至0.2 µmol/L时呈下降趋势，但从0.2至0.3 µmol/L时呈急速上升趋势，而浓度对试验的影响，自0.3 µmol/L之后趋近于平缓，从图2E也可以看出，浓度为0.3
和0.4 µmol/L时水平间差异不明显，因此选择0.3 µmol/L作为试验浓度。

退火的温度也会影响到PCR扩增试验的反应，温度会直接影响到引物与模板DNA 的特异性结合。

试验中直接利用了德国Biometra公司生产的PCR仪，自动生成
了8个温度，依次为57.0、56.3、55.1、53.3、51.0、49.3、47.9、47.0 ℃，并进行3次重复试验查看结果（见图3）。

从试验结果可以看出，温度过高则条带变少，亮度过大，扩增性差，温度过低则亮度低，条带模糊，经过反复对比，温度在49.3 ℃时条带清晰，扩增性好且多态性高，所以在本体系条件下确立最佳的退火
温度为49.3 ℃。

物种DNA的不同也决定了其所要求的ISSRPCR反应的条件不同[16]，为了提高
反应的准确性，有必要对其有影响的几个因素进行研究分析，近年来有不少科学研究者对此进行了深入研究，田华[17]等通过设置不同的梯度，进行单一变量来对细叶桉的ISSR-PCR的试验条件进行摸索，杨水云[18]首先将正交试验法应用到了PCR反应条件的优化中，此后更多的学者将这个方法应用到了梨树[3]、杜仲[19]、石斛[20]等物种的研究中。

本试验中采用了正交试验方法，根据统计学原理，从复因子试验结果中，着重研究了Taq DNA聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dDTPs、引物的浓度及PCR退火的
温度这几个方面，结合分析及对电泳图的观察，得出在25 µL的体系中，Taq DNA聚合酶浓度为0.4 U，模板DNA含量为10～80 ng，dNTPs为0.20
mmol/L，引物的浓度选择0.3 µmol/L，并且在49.3 ℃的条件下退火为最佳的反应条件体系。

试验结果会因为试验材料、试验环境、试验仪器等产生误差，可能会导致重复试验时结果存在略微的差异，但是总体而言上述反应体系具有较强的重复
性，下一步可以在此研究基础上，利用这个体系对观赏桃的遗传多样性进行研究，分析其亲缘关系[21]，并结合当地的状况，对观赏桃种质资源的分类与保护[22]，及观赏桃品种的栽培及育种进行研究。

【相关文献】
[1]宋江华,赵颖.乌塌菜ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J].植物研究,2013,33(2):238－242.
[2]曾艳玲,谢鹏,谢耀坚,等.桉树ISSR-PCR反应体系的建立及优化[J].中南林业技大学学
报,2008,28(2):44－48.
[3]曾艳玲,谭晓风,曾晓峰.采用正交设计方法优化梨ISSRPCR反应体系[J].湖北农业科
学,2008,47(11):1235－1237.
[4]胡东燕.桃花依旧笑春风——桃花品种介绍(一)[J].中国花卉盆景,2002,15(4):6－7.
[5]张秀英,段思兰.桃花品种资源多样性的研究[J].中国园林,1997,13(2):17－19.
[6]陈巍,闰田力,徐文荣.观赏桃品种介绍及发展现状[J].温州农业科技,2008,12(3):8－11.
[7]易芍文,李进斌,周小罡,等.云南省梨属植物资源的微卫星分析研究[J].西南农业学
报,2004,17(2):192－196.
[8]谭晓风,漆龙霖,黄晓光.山茶属植物叶片DNA抽提[J].中南林学院学报,1999,19(4):16－21.
[9]王弦云,朱晓敏,王勤.杜仲ISSR-PCR反应体系的建立与引物筛选及其在遗传多样性研究中的应
用[J].经济林研究,2013, 31(3):30－34.
[10]陈云霞,葛乐乐,王雪薇.珍稀濒危植物宝华玉兰ISSRPCR反应体系建立及优化[J].湖北农业科学,2016, 55(16):4206－4209.
[11]何钢,朱丽芳,梁文斌,等. 仙茅根茎DNA的提取及其ISSR-PCR反应体系的优化[J].经济林研究,2016,34(1):33－39, 44.
[12]巨秀婷,阿啟兰.郁金香ISSR-PCR体系建立与优化[J].分子植物育种,2016,14(4):973－979.
[13]刘德好,陆永良,娄玉霞,等.正交试验法优化稗属植物ISSR-PCR反应体系[J].上海农业学
报,2016,32(4):17－21.
[14]王韦,肖松,吴洪娥,等.月季ISSR-PCR体系的建立[J].种子,2015,34(7):33－36.
[15]王书珍,查三省,程呈,等.杜鹃花ISSR-PCR反应体系的建立和优化[J].北方园艺,2015,7(14):111－114.
[16]林玲,汤浩茹,刘燕,等.观赏桃ISSR-PCR反应体系的优化[J].生物技术通报,2009,12(12):72－75.
[17]田华,张党权,谭晓风,等.细叶按ISSR-PCR体系的建立与优化[J].经济林研究,2009,27(1):13－16.
[18]杨水云,李续娥,吴明宇,等.正交实验法在PCR反应条件优化中的应用[J].生物数学学
报,2005,20(2):201－206.
[19]王弦云,朱晓敏,王勤,等.杜仲ISSR-PCR反应体系的建立与引物筛选及其在遗传多样性研究中的应用[J].经济林研究,2013,31(3):30－34.
[20]孔琼,袁盛勇,薛春丽,等.云南野生石斛ISSR-PCR分析[J].西南农业学报,2015,28(3):1242－1245.
[21]李单琦,谢德金,王汉琪,等.福建柏遗传多样性ISSR分析[J].中南林业科技大学学
报,2016,36(5):63－67,78.
[22]彭昕,吉庆勇,李玉兰,等.濒危药用植物三叶青ISSR分子标记的建立[J].中成药,2015,37(7):1507－1514.。