狂犬病病毒PM株在人二倍体MRC_5细胞中的感染特性_张芮铭.caj
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2结果
2. 1 感染细胞的观察 显微镜下观察可见，MOI 为 0. 05 时，病毒收获前细胞部分回缩，排列较整齐，折 光度较好；MOI 为 0. 06 和 0. 07 时，病毒收获前细胞 出现聚集现象，液体中基本无死细胞；当 MOI 大于 0. 08 时，病毒收获前细胞脱落较严重。见图 1。
2. 2 病毒收获液的滴度 检测结果显示，MOI 为 0. 06 ～ 0. 07 时，病毒收获液的滴度较高，见图 2。 2. 3 病毒灭活液的效价 检测结果显示，MOI 为 0. 06 ～ 0. 07 时，病毒灭活液的效价较高，MOI 在 0. 05 ～ 0. 10 之间，病毒收获液的效价均符合 WHO 提出的疫苗 最低效价 2. 5 IU ／ 剂的要求，见图 3。
Beijing Minhai Biotechnology Co.，Ltd，Beijing 102600，China Corresponding author: GAO Zheng-lun，E-mail: gzlun@;
ZHANG Rui-ming，E-mail: reneezhang1031@ Abstract： Objective To observe the infectious characteristics of rabies virus PM strain in human diploid MRC-5 cells. Methods MRC-5 cells were inoculated with PM strain at MOIs of 0. 05，0. 06，0. 07，0. 08，0. 09 and 0. 10 respec－ tively，and observed by microscopy. The harvested virus liquid was determined for titer by indirect IFA. The inactivated virus liquid was determined for potency by test in NIH mice. Results The cells inoculated with PM strain at MOIs of 0. 06 ~ 0. 07 showed aggregation before harvest of virus，and few dead cells were observed in liquid. The harvested virus liquid showed high titer，while the inactivated virus liquid showed high potency. Conclusion The infectious char－ acteristics of rabies virus PM strain in human diploid MRC-5 cells was observed，which provided an experimental basis for optimization of production procedure of the rabies vaccine. Key words： Rabies virus PM strain; MRC-5 cells; Infectious characteristics; Titer; Potency
通讯作者：高正伦，E-mail：gzlun@； 张芮铭，E-mail：reneezhang1031@
本实验旨在观察狂犬病病毒 PM 株在人二倍体 MRC-5 细胞中的感染特性，通过比较不同 MOI 下病 毒收获液的滴度和病毒灭活液的效价，为疫苗生产 工艺的优化提供实验依据。
中图分类号： R373. 9 文献标识码： A 文章编号： 1004-5503（2013）09-1258-03
Infectious characteristics of rabies virus PM strain in human diploid MRC-5 cells
ZHANG Rui-ming，GAO Zheng-lun，FANG Qun，ZUO Jing，LIU Hai-wen， ZHENG Xue-xue，Liu Cui，ZHENG Sen-yuan
图 1 感染不同 MOI 病毒的 MRC-5 细胞收获前的状态观 察（× 400）
Fig 1. MRC-5 cells inoculated with PM strain at various MOIs（× 400 ）
病毒滴度（lg CCID50 ／ ml）
7. 8 7. 6 7. 4 7. 2 7. 0 6. 8 6. 6 6. 4 6. 2 6. 0
中国生物制品学杂志 2013 年 9 月第 26 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2013，Vol. 26 No. 9
·1263·
［3］ Go h KL, Chan WK, Shiota S, et al. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications ［J］. Helicobacter, 2011, 16（Suppl 1）: 1-9.
［6］ Agrawal A, Gupta A, Chandra M, et al. Role of Helicobacter pylori infection in the pathogenesis of minimal hepatic encephalopathy and effect of its eradication ［J］. Indian J Gastroenterol, 2011, 30（1）: 29-32.
1 材料与方法
1. 1 病毒及细胞 狂犬病病毒 Pitman Moore（PM） 株 PM1503-3M（65 代，为生产用毒种，工作浓度 ≥ 6. 5 Lg LD50 ／ ml）、CVS 株和 MRC-5 细胞（26 代）均 来自法国赛诺菲巴斯德；BHK-21 细胞由中国食品药 品检定研究院提供。
［4］ ห้องสมุดไป่ตู้usters JG, Van Vliet AH, Kuipers EJ. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection［J］. Clin Microbiol Rev, 2006, 19（3）: 449-490.
［5］ Mitric觍 D, Plesa A, Constantinescu R, et al. Efficacy of Helicobacter pylori eradication therapy in cirrhotic patients with peptic ulcer disease ［J］. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, 2011, 115（2）: 367-374.
0. 04 0. 05 0. 06 0. 07 0. 08 0. 09 0. 10 0. 11 0. 12
MOI
图 2 不同 MOI 病毒收获液的滴度
Fig 2. Titers of harvested virus liquid inoculated at various
MOIs
（下转第 1263 页）
9人用禽胚狂犬病疫苗和细胞培养狂犬病疫苗经过四十多年的发展在狂犬病暴露前和暴露后免疫的安全性有效性已被证实1目前接种狂犬病疫苗是防治人患狂犬病唯一有效的方法我国每年有1000万耀1200万人接受狂犬病暴露后的疫苗接种2
DOI:10.13200/ki.cjb.000127
·1258·
中国生物制品学杂志 2013 年 9 月第 26 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2013，Vol. 26 No. 9
中国生物制品学杂志 2013 年 9 月第 26 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2013，Vol. 26 No. 9
·1259·
1. 2 主要试剂 BME 培养基和 PBS 购自美国 Invitrogen 公司；胎牛血清（澳洲血源 SH30084-03）购自 美国 Hyclone 公司；人血白蛋白（用于配制病毒培养 液）购自西班牙 Grifols 公司；胰酶（2. 5%）购自美国 GIBCO 公司；异硫氰酸荧光素标记的抗狂犬病病毒 糖蛋白单克隆抗体由法国赛诺菲巴斯德惠赠；β-丙 内酯购自 Ferak 德国 Berlin 公司。 1. 3 实验动物 SPF 级昆明小鼠，雌性，体重 11 ~ 15 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合 格证号：0300129。 1. 4 细胞培养 复苏 26 代 MRC-5 细胞，接种于 F75 cm2 塑料培养瓶中培养。待细胞长成单层后，用 PBS 洗涤，2. 5%胰酶消化，按 1 ∶ 4 比例传代，传至 第 37 代备用。 1. 5 病毒培养 将 37 代 MRC-5 细胞消化后制成浓 度为 5. 0 × 106 个 ／ ml 的悬液，分别接种 0. 05、0. 06、 0. 07、0. 08、0. 09、0. 10 MOI 的 PM 株狂犬病病毒，置 35 ℃温室培养，用 BME 配制的病毒冲洗液连续冲洗 2 次后，继续置 35 ℃温室培养 3 ～ 5 d，显微镜下观 察，当 80%以上细胞被感染，并出现细胞圆缩时，收 获病毒。 1. 6 病毒收获液滴度的检测 采用间接免疫荧光法。 将收获的病毒液系列稀释，在 96 孔微量培养板中与 BHK-21 细胞于 36 ℃，5% CO2 培养箱共培养 48 h 后， 通过异硫氰酸荧光素标记的抗狂犬病病毒糖蛋白单 克隆抗体检测各孔中是否存在病毒，荧光显微镜观察， 计算病毒对细胞的半数感染剂量（lg CCID50 ／ ml）。 1. 7 病毒液的灭活及效价检测 采用小鼠 NIH 法。 收获的病毒液澄清后，经 3 μm 滤膜过滤，使用Millipore 300 kd 超滤膜包，按照既定比例进行超滤浓缩， 用1 ∶ 4 000 的 β-丙内酯灭活，取样进行 1 ∶ 25、1 ∶ 125、 1 ∶ 625、1 ∶ 3 125 稀释，于第 0 天和第 7 天分别经腹腔 免疫昆明小鼠，每只 0. 5 ml；于第 2 次免疫后 1 周， 即第 14 天经脑腔攻击 30 LD50 的狂犬病病毒 CVS 株 悬液，每只 0. 03 ml。攻击后观察 14 d，记录小鼠存 活数，并计算病毒灭活液的效价。
· 基础研究 ·
狂犬病病毒 ＰＭ 株在人二倍体 ＭＲＣ-５ 细胞中的感染特性
张芮铭，高正伦，方群，左静，刘海文，郑学学，刘翠，郑森元
北京民海生物科技有限公司，北京 102600
摘要： 目的 观察狂犬病病毒 PM 株在人二倍体 MRC-5 细胞中的感染特性。方法 分别将 0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0. 09、0. 10 MOI 的 PM 株狂犬病病毒接种至 MRC-5 细胞中，显微镜观察感染细胞的状态；间接免疫荧光法检测病毒 收获液的滴度；小鼠 NIH 法测定病毒灭活液的效价。结果 MOI 为 0. 06 ～ 0. 07 时，病毒收获前细胞出现聚集现象， 液体中基本无死细胞；病毒收获液的滴度和病毒灭活液的效价较高。结论 观察了狂犬病病毒 PM 株在人二倍体 MRC-5 细胞中的感染特性，为疫苗生产工艺的优化提供了实验依据。 关键词： 狂犬病病毒 PM 株；MRC-5 细胞；感染特性；滴度；效价
人用禽胚狂犬病疫苗和细胞培养狂犬病疫苗经 过四十多年的发展，在狂犬病暴露前和暴露后免疫的 安全性、有效性已被证实［1］，目前接种狂犬病疫苗是 防治人患狂犬病唯一有效的方法，我国每年有 1 000 万 ～ 1 200 万人接受狂犬病暴露后的疫苗接种［2］。
影响狂犬病疫苗接种后效果的因素很多，其中 最主要的就是疫苗效价。影响疫苗效价的因素包括 生产时宿主细胞状态、病毒感染复数（MOI）、病毒接 种时间和培养时间等，而 MOI 是影响病毒产量的重 要因素之一。
2. 1 感染细胞的观察 显微镜下观察可见，MOI 为 0. 05 时，病毒收获前细胞部分回缩，排列较整齐，折 光度较好；MOI 为 0. 06 和 0. 07 时，病毒收获前细胞 出现聚集现象，液体中基本无死细胞；当 MOI 大于 0. 08 时，病毒收获前细胞脱落较严重。见图 1。
2. 2 病毒收获液的滴度 检测结果显示，MOI 为 0. 06 ～ 0. 07 时，病毒收获液的滴度较高，见图 2。 2. 3 病毒灭活液的效价 检测结果显示，MOI 为 0. 06 ～ 0. 07 时，病毒灭活液的效价较高，MOI 在 0. 05 ～ 0. 10 之间，病毒收获液的效价均符合 WHO 提出的疫苗 最低效价 2. 5 IU ／ 剂的要求，见图 3。
Beijing Minhai Biotechnology Co.，Ltd，Beijing 102600，China Corresponding author: GAO Zheng-lun，E-mail: gzlun@;
ZHANG Rui-ming，E-mail: reneezhang1031@ Abstract： Objective To observe the infectious characteristics of rabies virus PM strain in human diploid MRC-5 cells. Methods MRC-5 cells were inoculated with PM strain at MOIs of 0. 05，0. 06，0. 07，0. 08，0. 09 and 0. 10 respec－ tively，and observed by microscopy. The harvested virus liquid was determined for titer by indirect IFA. The inactivated virus liquid was determined for potency by test in NIH mice. Results The cells inoculated with PM strain at MOIs of 0. 06 ~ 0. 07 showed aggregation before harvest of virus，and few dead cells were observed in liquid. The harvested virus liquid showed high titer，while the inactivated virus liquid showed high potency. Conclusion The infectious char－ acteristics of rabies virus PM strain in human diploid MRC-5 cells was observed，which provided an experimental basis for optimization of production procedure of the rabies vaccine. Key words： Rabies virus PM strain; MRC-5 cells; Infectious characteristics; Titer; Potency
通讯作者：高正伦，E-mail：gzlun@； 张芮铭，E-mail：reneezhang1031@
本实验旨在观察狂犬病病毒 PM 株在人二倍体 MRC-5 细胞中的感染特性，通过比较不同 MOI 下病 毒收获液的滴度和病毒灭活液的效价，为疫苗生产 工艺的优化提供实验依据。
中图分类号： R373. 9 文献标识码： A 文章编号： 1004-5503（2013）09-1258-03
Infectious characteristics of rabies virus PM strain in human diploid MRC-5 cells
ZHANG Rui-ming，GAO Zheng-lun，FANG Qun，ZUO Jing，LIU Hai-wen， ZHENG Xue-xue，Liu Cui，ZHENG Sen-yuan
图 1 感染不同 MOI 病毒的 MRC-5 细胞收获前的状态观 察（× 400）
Fig 1. MRC-5 cells inoculated with PM strain at various MOIs（× 400 ）
病毒滴度（lg CCID50 ／ ml）
7. 8 7. 6 7. 4 7. 2 7. 0 6. 8 6. 6 6. 4 6. 2 6. 0
中国生物制品学杂志 2013 年 9 月第 26 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2013，Vol. 26 No. 9
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［3］ Go h KL, Chan WK, Shiota S, et al. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications ［J］. Helicobacter, 2011, 16（Suppl 1）: 1-9.
［6］ Agrawal A, Gupta A, Chandra M, et al. Role of Helicobacter pylori infection in the pathogenesis of minimal hepatic encephalopathy and effect of its eradication ［J］. Indian J Gastroenterol, 2011, 30（1）: 29-32.
1 材料与方法
1. 1 病毒及细胞 狂犬病病毒 Pitman Moore（PM） 株 PM1503-3M（65 代，为生产用毒种，工作浓度 ≥ 6. 5 Lg LD50 ／ ml）、CVS 株和 MRC-5 细胞（26 代）均 来自法国赛诺菲巴斯德；BHK-21 细胞由中国食品药 品检定研究院提供。
［4］ ห้องสมุดไป่ตู้usters JG, Van Vliet AH, Kuipers EJ. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection［J］. Clin Microbiol Rev, 2006, 19（3）: 449-490.
［5］ Mitric觍 D, Plesa A, Constantinescu R, et al. Efficacy of Helicobacter pylori eradication therapy in cirrhotic patients with peptic ulcer disease ［J］. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, 2011, 115（2）: 367-374.
0. 04 0. 05 0. 06 0. 07 0. 08 0. 09 0. 10 0. 11 0. 12
MOI
图 2 不同 MOI 病毒收获液的滴度
Fig 2. Titers of harvested virus liquid inoculated at various
MOIs
（下转第 1263 页）
9人用禽胚狂犬病疫苗和细胞培养狂犬病疫苗经过四十多年的发展在狂犬病暴露前和暴露后免疫的安全性有效性已被证实1目前接种狂犬病疫苗是防治人患狂犬病唯一有效的方法我国每年有1000万耀1200万人接受狂犬病暴露后的疫苗接种2
DOI:10.13200/ki.cjb.000127
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中国生物制品学杂志 2013 年 9 月第 26 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2013，Vol. 26 No. 9
中国生物制品学杂志 2013 年 9 月第 26 卷第 9 期 Chin J Biologicals September 2013，Vol. 26 No. 9
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1. 2 主要试剂 BME 培养基和 PBS 购自美国 Invitrogen 公司；胎牛血清（澳洲血源 SH30084-03）购自 美国 Hyclone 公司；人血白蛋白（用于配制病毒培养 液）购自西班牙 Grifols 公司；胰酶（2. 5%）购自美国 GIBCO 公司；异硫氰酸荧光素标记的抗狂犬病病毒 糖蛋白单克隆抗体由法国赛诺菲巴斯德惠赠；β-丙 内酯购自 Ferak 德国 Berlin 公司。 1. 3 实验动物 SPF 级昆明小鼠，雌性，体重 11 ~ 15 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合 格证号：0300129。 1. 4 细胞培养 复苏 26 代 MRC-5 细胞，接种于 F75 cm2 塑料培养瓶中培养。待细胞长成单层后，用 PBS 洗涤，2. 5%胰酶消化，按 1 ∶ 4 比例传代，传至 第 37 代备用。 1. 5 病毒培养 将 37 代 MRC-5 细胞消化后制成浓 度为 5. 0 × 106 个 ／ ml 的悬液，分别接种 0. 05、0. 06、 0. 07、0. 08、0. 09、0. 10 MOI 的 PM 株狂犬病病毒，置 35 ℃温室培养，用 BME 配制的病毒冲洗液连续冲洗 2 次后，继续置 35 ℃温室培养 3 ～ 5 d，显微镜下观 察，当 80%以上细胞被感染，并出现细胞圆缩时，收 获病毒。 1. 6 病毒收获液滴度的检测 采用间接免疫荧光法。 将收获的病毒液系列稀释，在 96 孔微量培养板中与 BHK-21 细胞于 36 ℃，5% CO2 培养箱共培养 48 h 后， 通过异硫氰酸荧光素标记的抗狂犬病病毒糖蛋白单 克隆抗体检测各孔中是否存在病毒，荧光显微镜观察， 计算病毒对细胞的半数感染剂量（lg CCID50 ／ ml）。 1. 7 病毒液的灭活及效价检测 采用小鼠 NIH 法。 收获的病毒液澄清后，经 3 μm 滤膜过滤，使用Millipore 300 kd 超滤膜包，按照既定比例进行超滤浓缩， 用1 ∶ 4 000 的 β-丙内酯灭活，取样进行 1 ∶ 25、1 ∶ 125、 1 ∶ 625、1 ∶ 3 125 稀释，于第 0 天和第 7 天分别经腹腔 免疫昆明小鼠，每只 0. 5 ml；于第 2 次免疫后 1 周， 即第 14 天经脑腔攻击 30 LD50 的狂犬病病毒 CVS 株 悬液，每只 0. 03 ml。攻击后观察 14 d，记录小鼠存 活数，并计算病毒灭活液的效价。
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狂犬病病毒 ＰＭ 株在人二倍体 ＭＲＣ-５ 细胞中的感染特性
张芮铭，高正伦，方群，左静，刘海文，郑学学，刘翠，郑森元
北京民海生物科技有限公司，北京 102600
摘要： 目的 观察狂犬病病毒 PM 株在人二倍体 MRC-5 细胞中的感染特性。方法 分别将 0. 05、0. 06、0. 07、0. 08、 0. 09、0. 10 MOI 的 PM 株狂犬病病毒接种至 MRC-5 细胞中，显微镜观察感染细胞的状态；间接免疫荧光法检测病毒 收获液的滴度；小鼠 NIH 法测定病毒灭活液的效价。结果 MOI 为 0. 06 ～ 0. 07 时，病毒收获前细胞出现聚集现象， 液体中基本无死细胞；病毒收获液的滴度和病毒灭活液的效价较高。结论 观察了狂犬病病毒 PM 株在人二倍体 MRC-5 细胞中的感染特性，为疫苗生产工艺的优化提供了实验依据。 关键词： 狂犬病病毒 PM 株；MRC-5 细胞；感染特性；滴度；效价
人用禽胚狂犬病疫苗和细胞培养狂犬病疫苗经 过四十多年的发展，在狂犬病暴露前和暴露后免疫的 安全性、有效性已被证实［1］，目前接种狂犬病疫苗是 防治人患狂犬病唯一有效的方法，我国每年有 1 000 万 ～ 1 200 万人接受狂犬病暴露后的疫苗接种［2］。
影响狂犬病疫苗接种后效果的因素很多，其中 最主要的就是疫苗效价。影响疫苗效价的因素包括 生产时宿主细胞状态、病毒感染复数（MOI）、病毒接 种时间和培养时间等，而 MOI 是影响病毒产量的重 要因素之一。