铂类抗癌药物及其作用机理的分析技术进展_刘一

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檾檾檾檾檾檾檾檾殧殧殧殧进展评述
铂类抗癌药物及其作用机理的分析技术进展刘一1杨玉飞2，1白玉1刘虎威1*（1北京分子科学国家实验室，生物有机与分子工程教育部重点实验室，北京大学化学与分子工程学院分析化学研究所北京100871；2北京师范大学化学学院北京100875）科技部仪器专项基金项目（2012YQ090194-
9）和国家自然科学基金项目（21175005）资助2013-04-07收稿，2013-06-25接受
摘要以顺铂为代表的铂类抗癌药物已投入临床应用将近30年，因强大的抗癌活性及广谱的抗癌效果而得到了迅速发展和广泛应用，卡铂则是另一个成功应用的铂类抗癌药。

这些抗癌药的抗癌机理被普遍认为是Pt （II ）与DNA 的亲电作用，进而形成DNA 链交联而导致形变，但其详细的作用机理尚未十分清晰。

因此，对该类药物的药代动力学、转运机制及作用机理的研究具有重要意义。

关于铂族抗癌药物的分离分析方法近年来也得到了飞速的发展，包括测定Pt 总量的非选择性方法以及测定未受损Pt 化合物的选择性方法。

本文综述了研究铂族抗癌药物及其与生物大分子相互作用的分析方法，包括光谱法、电化学方法、高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、质谱法以及核磁共振法等，主要讨论近十年色谱、质谱技术在铂类抗癌药物分析中的应用特点及不足之处。

关键词铂族抗癌药物液相色谱毛细管电泳质谱相互作用Analytical Methodologies for the Analysis of Platinum-containing Anticancer Drugs and its Interaction Mechanisms Liu Yi 1，Yang Yufei 2，1，Bai Yu 1，Liu Huwei 1*（1Beijing National Laboratory for Molecular Sciences ，Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education ，College of Chemistry and Molecular Engineering ，Peking University ，Beijing 100871；2College of Chemistry ，Beijing Normal University ，Beijing 100875）Abstract Platinum-based anticancer drugs have become one of the leading chemotherapeutic drugs in cancer treatment for over 30years due to their high level and broad spectrum of antitumor activity．DNA has been identified as a key cellular target of the platinum containing drugs．The crosslinks formed by Pt （II ）-DNA interaction lead to DNA twisting and the subsequent cell death ，but the mechanism of which is not clarified．Therefore ，the understanding of the pharmacokinetics ，delivering pathways ，mechanism of interacting is of great importance．The analytical strategies for platinum-containing drugs can be classified as selective and non-selective methods．This reviews aims to provide a systematic survey of the latest analytical techniques for the analysis of platinum-containing anticancer drugs and their interaction with biomolecules．Spectroscopic methods ，electroanalytical methods ，high-performance liquid chromatography （HPLC ），gas chromatography （GC ），capillary electrophoresis （CE ），mass spectrometry （MS ）and others are covered ，with the emphasis on chromatographic and mass spectrometric set-ups．Keywords Platinum-containing anti-cancer drugs ，High-performance liquid chromatography ，Capillary electrophoresis ，Mass spectrometry ，Interaction 顺铂［顺式-二氯二氨合铂（II ），cis -diaminedichloroplatinum （II ），Cisplatin ，图式1］是由美国生理学
家Ｒosenberg 于1965年发现其抗癌性能并于1978年首先在美国批准临床使用的铂类抗癌药物，同时也是第一个用于治疗癌症的无机物［1，2］。

因其杰出的抗癌活性、广谱的抗癌效果及良好的靶向杀伤作用，
图式1顺铂及卡铂的结构Scheme 1Chemical structures of Cisplatin and Carboplatin
已广泛用于多种恶性肿瘤的临床治疗。

该类药物对睾
丸癌、卵巢癌、膀胱癌、鼻咽癌、食道癌及头颈部癌等均
有较好的治疗作用，目前仍为临床治疗癌症的主要药
物之一。

但是，其毒副作用亦十分明显，不良反应如肾
毒性、胃肠道反应、神经毒性及机体耐药性等限制了它
的广泛使用。

因此，
自顺铂发明以来，有很多人致力于铂类抗癌药物的研究［1，3］，并先后报道过3000多种铂
类配合物作为筛选药物［4］，但最终作为抗癌药进入临床试验的仅有28个，其中18个顺铂经过不同阶段的临床试验后因抗癌活性不强或毒性大等原因而最
终被放弃。

在被保留的10个铂配合物中，卡铂（图式1，
cis -Diamine-（1，1-cyclobutanedicarboxylato ）-platinum （II ），Carboplatin ）1985年于世界多国上市；奈达铂（Nedaplatin ）1995年于日本批准上市；草酸铂（Oxaliplatin ）1996年于法国批准上市；丙二酸铂（SKI2053Ｒ或sunplatin ）1999年于韩国批准上市［5］。

由
于在结构中引入了亲水性的环丁二羧酸作配体，
卡铂的肾毒性等毒副作用较顺铂而言稍缓和。

图1顺铂的摄入及细胞内相互作用［16］Fig．1Intake of Cisplatin and its interactions in cells ［16］
目前已有的研究普遍认为铂类抗肿瘤药物与DNA
的作用机理可分为跨膜运转、水合离解、靶向迁移和作
用于DNA 这4个步骤［2，6，7］；药物活性则是由水解、转
运以及与DNA 的结合、与邻近鸟嘌呤的特异作用和对
DNA 待解旋作用这几种作用的综合结果（图1）。

在与
DNA 形成加合物时，嘌呤环上的7-位氮原子（N7）是活
性最高的结合位点（图式2），
而药物对N1及N3也具有一定的亲和性［8，9］。

同时，药物与DNA 的亲和性还受到
碱基空间位置的制约。

通常认为，暴露在DNA 骨架外
部且具有合适距离的2个活性N 最容易与药物产生交
联。

Pt 与DNA 分子中的碱基对（通常是2个鸟嘌呤，
GG ）通过横向或纵向的交联作用而形成加合物，从而阻
止DNA 的复制或逆转录过程，达到抑制细胞生长的作
用。

该复合物没能被DNA 修复识别，但详尽的作用机理和步骤、药物亲和性及选择性的产生原理等关键问题，目前并不十分清楚［10］。

同时，此类药物在生物
体内环境中亦具有较高的反应活性，
极易与环境中的亲核中心发生反应，其水溶液中的化学反应包括水合反应、与Cl －的取代反应以及与含O ，S 等的生物分子的取代反应等都极可能对药物到达DNA 作用
中心时的形态、构象及活性有较大影响。

此外，研究表明，进入生物体内的大部分铂类药物都在运输过
程中与含S 蛋白结合［11］，而这些结合物可能通过对细胞凋亡通路的初始化过程的阻滞作用而抑制肿瘤
活性［12 14］，也可能是药物副作用及耐药性的始作俑者［15］。

图式2
铂类抗癌药物与碱基的作用位点Scheme 2Binging sites of Platinum-containing anticancer drugs with bases
由于铂类抗癌药物与蛋白质、DNA 等生物分子作用的复杂性、转运过程及代谢过程的多样性以及
其水解产物及代谢产物的复杂性，将铂类抗癌药物与其生物转化产物分离并对这些降解产物在用药浓度水平上进行检测，具有至关重要的意义。

总体来讲，用于铂类化合物的定量分析方法可分为只测Pt
总量的非选择性方法以及检测未受损化合物（Intact compound）的选择性方法。

关于这些分析方法的综述文献，多针对其中几个点或面进行分析总结，例如，Esteban-Fernandez等［16］系统综述了含Pt抗癌药物的分析策略；Timerbaev等介绍了生物基质中的金属类药物的分析方法及研究进展［17］、综述了毛细管电泳（CE）在金属药物分析方面的应用及进展［18］、并总结了CE在金属药物研制过程与质量控制中的应用，特别强调了CE与元素专一（Element-specific）的或分子专一（Molecule-specific）的选择性质谱（MS）检测在这一领域的优势［19］；Hartinger等［20］综述了近年来CE在抗癌药物分离分析中的进展；Bosch 等［10］比较系统全面地总结了近年来顺铂的检测方法，包括经典的光谱法和色谱法、MS法等。

本文将从分析方法分类的角度，总结近10年来铂族抗癌药物的分析检测技术及方法，主要包括光谱法（紫外-可见光谱、磷光法、原子吸收法、红外光谱法）、电化学方法、色谱法（液相色谱法、气相色谱法）、CE、MS、核磁共振法（NMＲ）、X-射线衍射法等。

通过总结和分析各方法的特点、优势及不足，并通过相互比较，为铂族抗癌药物分析检测方案提供选择依据。

1铂类抗癌药物的研究方法
1.1光谱法
由于铂类抗癌药物的摩尔吸光率极低且无荧光，使得光谱法在这一领域的应用存在诸多局限。

光谱法工作主要出现在早期文献中，常见光谱法如紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）法以及荧光（FL）法一般需要进行选择性衍生化，而红外光谱（IＲ）法的实现需基于Pt-蛋白或Pt-DNA加合物的生成，以此研究分子中化学键的变化，但IＲ几乎没有定量能力。

1.1.1紫外-可见吸收光谱单一铂类化合物的UV-Vis分析通常需要对样品进行选择性衍生化。

若分析Pt-DNA加合物等具有紫外吸收的分子，则需要考虑生物基质背景的强烈干扰，因此，UV方法对Pt 药物的分析并不常见。

Anilanmert等［21］以邻苯二胺为衍生试剂，用UV-Vis方法对尿液中的顺铂进行了检测。

该工作采用705nm为吸收波长，由于该波长远离顺铂、邻苯二胺及尿液中其他生物分子的吸收波长，故而降低了干扰，检出限可达8.40μg/mL。

1.1.2磷光法（Phosphorimetry）Gooijer等［22］于1984年报道了以经典的液相色谱（LC）猝灭联乙酰磷光法检测Pt（II）化合物，采用反相LC条件分离对顺铂及卡铂进行了定量分析，检测限可分别达3.0ˑ10－7及3.3ˑ10－7mol/L，即ng/mL量级。

但同时他们指出，该方法应用于尿样分析时，样品基质对检测的干扰相当严重，一个可能的解决方案是增加柱前样品处理步骤。

Bauman等［23］使用猝灭磷光检测（Quenched phosphorescence detection）尿液和血浆中的顺铂，线性范围可达5ˑ10－7 5ˑ10－5mol/L，检测限也可达到ng量级。

1.1.3原子吸收法（AAS）AAS法是一种可以比较清楚地得到样品中Pt总量的经典方法，在早期的铂类抗癌药物分析中应用最多，在目前的常规定量工作中仍采用。

AAS法针对Pt元素进行检测，几乎不受基质干扰，因此在生物体系中的应用很有优势，相关工作涉及血液［24，25］、组织［24］、尿液［26 28］、粪便［21，29］及胆汁［21，29］等生物样品。

例如，Bu等［24］利用一种钨涂层石墨管对癌症病人血液和组织中的顺铂进行了检测，涂层后的石墨管能有效地排除样品基质干扰，从而使得该方法更加灵敏、精确。

基于AAS灵敏度不太理想的问题，Ｒaghavan等［30］建立了一种更加有效的铂提取方法，采用塞曼原子吸收检测器，将总铂含量的检出限降低至0.5ng/mL。

需要指出，AAS只能检测Pt总量，而不能测定不同形态的Pt。

为此，Verschraagen等［27］用AAS与LC的离线联用来同时检测血液中顺铂及其一水合铂（Monohydrated Cisplatin）。

混合物样品先经LC分离，再经离线的石墨炉原子化方法检测，顺铂及其一水合铂的线性范围分别为60 600及87.5 700nmol/L，该工作应用于临床样品，得到较好的效果。

1.1.4傅里叶变换红外光谱法（FTIＲ）Pt-蛋白质与Pt-DNA复合物形成后，可通过FTIＲ对其变化和机理进行研究。

FTIＲ可用于研究Pt-蛋白质相互作用，通过与原蛋白溶液和文献参考值比较得到相关数据。

Neault等［31］采用该方法研究了顺铂-人血清蛋白（HAS）键合作用和蛋白质二级结构，其结果表明，在顺铂浓度高于0.001mmol/L时，通过蛋白质上的C O，C—N，S—H等供电子基团而大量形成了Pt-HSA复合物。

1.2电化学方法
早期用于检测顺铂的电化学方法具有样品沉积、基质干扰、重现性不佳等缺点［32］，但该方法在灵敏度方面有一定优势。

电化学方法的一个较大优势在于其灵活的电极材料及探针的设计，可特异性地对铂类化合物或其与DNA的相互作用等进行研究［33］，典型的工作包括Petrlova等［34］使用一种金属硫蛋白修饰的滴汞电极作为顺铂的电化学生物传感器，采用吸附转移溶出技术及示差微分脉冲技术对顺铂进行检测。

经过400s的作用时间，可获得0.5μmol/L的检测限；Zitka等［35］报道了分析顺铂-谷胱甘肽相互作用的电化学方法，该方法使用玻碳电极及流动注射分析技术分析顺铂与3种不同形态的谷胱甘肽的相互作用情况，检测限可达pg/mL量级。

1.3液相色谱法（LC）
在LC中，分析物通过在色谱分离通道中的吸附［36 38］、分配、离子交换［39 41］、体积排阻［42］或亲和配位等作用，与样品中的其他组分实现分离。

LC的众多检测形式都曾被用于铂类药物的相关检测，下面介绍几种主要的检测形式。

1.3.1UV-Vis检测铂族抗癌化合物的紫外吸收很有限，且最佳吸收波长在210nm以下。

此波长不仅受生物体系中各组分的干扰严重［43］，甚至制约了色谱流动相的选择。

因此，早期的LC-UV方法往往涉及样品的柱前或柱后衍生化。

柱前衍生方法，如Pt（II）与二水杨醛四甲基亚乙基二亚氨［44］、N，N-二亚水杨基-1，2-丙二胺［45］及2-乙酰基吡啶-4-苯基-3-硫代缩氨基脲［46］的反应等都显著提高了UV检测的灵敏度。

在柱后衍生方法中，亚硫酸氢钠是最常用的衍生试剂，相关的报道涉及顺铂的药代动力学、药代毒理学、肾毒性等方面，样品涵盖血液、尿液、肾组织等［47 49］。

其他柱后衍生试剂，如二硫代氨基甲酸二乙酯（DDTC）、重亚硫酸钠［50］、二甲基二硫代氨基甲酸钠［51］或亚硫酸氢钠/重铬酸钾［49］等也被用于铂类化合物的信号增强。

经衍生化后的样品的信号响应通常在较大波长处为好，因此使得该方法有较强的抗生物基质干扰能力，能胜任生物体系的分析［52 54］。

值得指出的是，衍生化常常涉及高温［55］等过程，对铂类化合物尤其是其生物大分子加合物的稳定性不利，极可能带来大量信息的丢失。

由于信号增强过程的存在，LC-UV可达约20ng/mL的检出限［53，56］。

在定量研究医药器材上残留的顺铂含量的工作中［30，57］，除部分沿用以上方法外，另引入了改进的样品前处理过程，将方法的线性范围降至0.5 20ng/mL，检出限降至0.2 0.3ng/mL。

当然，如无需检出单一铂类化合物，而是分析其与生物大分子的加合物，则不需考虑UV吸收过弱的问题，因DNA、蛋白质等生物分子的UV吸收足以满足一般分析的要求。

在这些情况下，未经衍生化的样品可直接进行UV检测［58］，不过方法灵敏度十分有限，约在μg/mL量级。

1.3.2电化学检测电化学检测将电分析的高灵敏度引入到HPLC分析当中，不过它同时也将电化学检测器的平衡耗时长、易钝化等缺点带了进来。

一个典型的例子是Treskes等［40］建立的以LC在线还原电化学检测分析顺铂的方法。

该工作色谱柱为加载了十六烷基三甲铵的反相柱，流动相为5mmol/L柠檬酸盐（pH6.5）。

通过与滴汞电极和NH+4-增强催化质子还原联用，可获得10－8mol/L的检出限。

1.3.3电感耦合等离子体原子发射光谱检测（ICP-AES）反相离子对色谱在线ICP-AES方法曾被用于顺铂及相关物质的分析研究［59］，分析对象包括水溶液中的顺铂、其水解产物以及2个甲硫氨酸-铂复合物。

该方法的线性范围可达3个数量级，检出限为35ng/mL。

该方法还被用于人类及大鼠的顺铂生物转化产物研究中。

1.3.4电感耦合等离子体质谱检测（ICP-MS）放射标记的ICP-MS被认为是目前最灵敏的检测铂类化合物的方法［60］，检测限在pg/mL ng/mL量级［61 63］；而非放射性的ICP-MS在检测灵敏度上也明显优于其他技术［61］。

该技术的其他优势，如快速的分析过程及简易的数据处理等，都使其在单一铂类化合物分析中成为较理想的LC检测器。

遗憾的是，ICP-MS属无机质谱，由于ICP离子源使元素得到或丢失电子产生原子，只能对药物体系进行元素分析，故其定性能力有限。

在药物-生物分子作用体系不太复杂时，这种有限的定性能力可通过与具有高分离效率的LC联用得以弥补，因此LC-ICP-MS可以对一些简单混合物中的不同铂物种加以区分。

但总体来讲，该技术的定性能力并不尽如人意。

因此，该技术常被用于对单一铂化合物的检测，包括生物样品［64，65，72］及环境样品［63］等；或研究水溶液中的含Pt物种与其他分子，包括L-甲硫氨酸［66］、含组氨酸的多肽［67］、DNA［68］及其他杂交分子等的相互作用动力学。

针对Pt-生物加合物的检测的报道通常只能对几种简单的加合物进行指认［69］，相关工作包括血液中顺铂及其水合物的分离检测［70］、铂类化合物与核苷酸或DNA的相互作用研究［66，71 73］、铂类抗癌药物与蛋白质的相互作用研究等［41，74 77］。

各种LC新技术也应用于LC-ICP-MS。

例如，Esteban-Fernandez等［42］建立了二维液相色谱（2D-LC）分离测定肾脏及内耳细胞液中Pt-生物分子复合物的方法；Sar等［78］使用毛细管LC-ICP-MS方法对顺铂-DNA加合物进行了研究；Nygren及Hemstrom等［79，80］利用亲水作用色谱的HILIC-ICP-MS方法对顺铂及其水解产物进行了系统研究；Vacchina等［62］报道了以LC-ICP-MS方法对一类三铂抗癌化合物BBＲ3464的高选择性分离分析；Martincic等［81］建立了CIM-DEAE整体柱与IPC-MS在线联用方法用以研究顺铂在血清中的分布等。

1.3.5其他质谱检测电喷雾离子化（ESI）是目前LC-MS联用技术最常用的离子化技术，但在ESI电离源中，由于顺铂溶解性很低且不易挥发，使用普通的MS检测Pt（II）有机金属化合物并非易事。

因此，对铂类抗癌药物进行ESI-MS分析需额外引入帮助离子化的质子传递添加剂以增加含Pt物种的离子化效率，否则其灵敏度难以满足分析要求。

相关的ESI工作包括Cui等［82］使用LC-ESI-MS方法测定了顺铂及其水合物的理化性质、Mandal 等［83］报道的将纳喷雾-四级杆飞行时间质谱（nanoES-Q TOF MS）与LC-ICP-MS联合使用实现了对血色素（Hemoglobin，Hb）与顺铂作用后的结构变化情况的监测；Chiavarino等［84］报道的对草酸铂-DNA链内交联的LC-ESI MS/MS分析、Yaroshenko等［85］报道的以LC-ESI-IT-QTOF-MS对血浆里的顺铂的检测等。

除ESI接口外，其他工作包括nano-LC与离线基质辅助激光解吸（MALDI）-TOF/TOF-MS技术对顺铂造成的Jurkat T淋巴细胞凋亡进行了定量研究［86］、LC-AMS（Accelerator MS）对草酸铂-DNA损伤及修复的相关研究［87］、nLC-ESI-LTQ-FTMS/MS对药物-蛋白相互作用的分析［88］等。

1.4气相色谱（GC）
GC方法在铂类化合物的分析中并不常见，其主要限制因素仍是样品的挥发性问题。

因此，对铂类抗癌药物进行GC分析之前，需要对样品进行衍生化处理。

比较典型的工作包括Khuhawar等［89］报道的将顺铂经二（异戊酰基丙酮）亚乙基二亚氨衍生化并由氯仿提取后的溶液进行了GC分离，用火焰离子化检测器（FID）检测。

该方法被成功应用于顺铂药物制备及用药癌症患者血样检测；Laghari等［90］建立起对化疗病人血浆及尿液中顺铂分析的GC方法，通过使用DB-1701色谱柱及FID检测器，Pt（II）可与Cu（II）、Ni（II）、Co（III）、Mn（II）、Fe（III）、Zn（II）及VO（II）完全分离，其检测不受其他离子影响，方法线性范围为1 30μg/mL，检测限可达300ng/mL；他们从化疗后的病人的血清及尿液中将含Pt化合物通过Pt（II）二硫代氨基甲酸吡咯烷酯螯合物的形式检出，等等。

1.5毛细管电泳（CE）
CE在生物分析中有明显的优势，有大量报道致力于铂类抗癌药物的CE方法建立。

Hartinger等［20］综述了2003 2007年间CE在抗癌药物分离分析中的进展；Timerbaev等［18］综述了CE在金属药物分析方面的应用进展；Timerbaev等［19］总结CE在金属药物研制过程与质量控制中的应用，特别强调了CE 与元素专一或分子专一的选择性MS检测在这一领域的独特优势。

Sharma等［91］于1995年首次利用CE的高分离效率对Pt-DNA加合物进行了分离分析，该报道采用胶束电动色谱-激光诱导荧光检测（MEKC-LIF），样品使用丹磺酰氯进行柱前衍生。

CE-MS联用方法可避免传统检测方法对Pt-DNA加合物结构上的依赖性。

Qiang等［92］报道了以CE-ESI-MSn方法对抗癌药物SM54111及其降解产物的分离分析。

Warnke等［93］使用CE-MS方法研究了抗癌药物与核酸加合物的结构及动力学。

此外，MEKC与ICP-MS技术的联用［94］及CE-ICP-MS［95，96］也已用于Pt类药物与蛋白质相互作用的研究。

ICP-MS的使用可有效克服CE因分离通道尺寸及进样量限制而导致的灵敏度问题，因此CE-ICP MS在药物机理研究方面得到了很好的应用［97］。

CE方法的一个热点应用是对铂类化合物在水溶液中的行为或与生物分子的结合行为进行监控及
解释。

例如，Wenclawiak等［98］采用以十二烷基硫酸钠（SDS）为表面活性剂的MEKC方法分离分析了几种铂族抗癌化合物，并研究了水溶液中Pt复合物的稳定性；Zenker等［99，100］报道了顺铂及2种水解产物的成功分离，并在模拟生理溶液中考察了Pt（II）、顺铂及其水解产物与5’-GMP的加成反应动力学；Grabmann等［101］报道了CE-ESI-MS方法对铂类抗癌药dihalidobis（2-propanone oxime）platinum（II）的顺、反两种形式的水解行为的研究等（图2）。

图2cis-/trans-二卤合（2-丙酮肟）铂（II）水解体系中各物种的萃取离子电泳图［101］
Fig．2EICs of the degradation products of cis-/trans-dihalidobis（2-propanone oxime）platinum（II）［101］
A cis-dihalidobis（2-propanone oxime）platinum（II）（m/z500）；［Pt2（ox）4Br（OH）-3H］－（m/z776，）；［Pt2（ox）4Br2-3H］-（m/z839）；
B trans-dihalidobis（2-propanone oxime）platinum（II）（m/z500）；［Pt2（ox）4Br2-3H］－（m/z839）；［Pt（ox）2Br（HPO4）］－（m/z517，+）
在实际生物体系分析中，CE表现了抗基质干扰能力和高分离能力。

Huang等［102］使用MEKC-UV 建立起人体血清内顺铂的无损检测方法，铂族化合物的检出限可达2 3μmol/L。

此外，CE-ICP-MS被应用于Pt族化合物-HAS相互作用的研究［103］。

相关报道使用CE方法对顺铂、卡铂及类似化合物与核酸的相互作用进行了系统研究［99，100，104，105］，包括CE-UV和CE-ESI-MS方法，均可以实现核酸加合物与未修饰的核酸之间的分离。

在药物与生物分子相互作用研究领域，CE也发挥了很大的作用。

Ｒudnev等［106］建立起顺铂和草酸铂与转运蛋白作用研究的亲和毛细管电泳（ACE）方法；Ｒappel等［107］报道了分析抗癌Pt（II）化合物的微乳电动色谱（MEEKC）方法，实现了顺铂及其他8种新型铂族抗癌化合物非对映体的分离，并通过将辛醇-水分配系数与MEEKC偶联的方法，研究了这些铂族抗癌化合物的辛醇-水分配系数；Aleksenko 等［108］采用CE方法研究了铂类化合物在模拟生理条件（pH7.4，100mmol/L氯化物，37ħ）下与SA的相互作用；Lemma等［109］以人类血色素A（0）为模型分析物，建立起分析铂族抗癌化合物的毛细管等点聚焦（CIEF）-全柱成像检测（WCID）方法；Bruchert等［110］则用凝胶电泳（GE）-电感耦合等离子体-扇形场（sector field）MS（ICP-SFMS）联用方法研究了顺铂-核酸的相互作用。

1.6质谱（MS）
近年来，LC-ESI-MS逐渐发展成为一项高灵敏度和高选择性的铂族化合物研究技术。

然而，在选择LC流动相时，铂族化合物及其水解产物的化学反应性必须加以考虑，以避免对检测结果的干扰。

磷酸盐、乙酸盐及乙腈等亲核试剂对Pt（II）中心的亲核作用是不可忽视的，而这些化合物正是LC的常用流动相。

此外，LC-MS的另一不足在于，ESI源与LC联用时，化学背景噪音相对较大，因此，直接使用MS 技术就成为解决这一问题的方法之一。

直接MS分析技术在研究药物与生物分子相互作用方面的应用十分广泛。

虽然铂类抗癌药物的细胞毒性大部分来自于其与DNA的相互作用［111］，但在药物摄入、转运、靶标识别的过程中，会与生物体中各种蛋白，如金属硫蛋白（MT）及谷胱甘肽（GSH）等，进行结合，这些相互作用不仅与药物副作用有关，也与细胞耐药性有关。

Xu等［112］系统比较了6种MS/MS方法在Pt-DNA加合物分析中的利弊，发
现深紫外光解离（UVPD）及红外多光子解离（IＲMPD）2种技术最适于该体系的研究。

Hartinger等［113］比较了ESI和MALDI技术在Pt-泛素相互作用研究中的优势和不足，表明nESI-Q TOF在对一些一水合物及二水合物的分析中并不能获得清晰的结构信息，nESI-IT MS可得到比TOF更佳的灵敏度，而MALDI可获得更多的碎片结构信息。

在使用ESI-MS技术研究Pt-蛋白质相互作用方面，Peleg-Shulman等［114］进行了开创性的工作。

此后，关于药物-蛋白质加合物的MS研究逐渐增多。

研究范围从药物转运过程中结合态及相关行为的研究［115，116］，到药物与泛素［113］及细胞色素c［117，118］的相互作用，再到对药物与蛋白交联作用［119］及作用位点［120］的研究等，大量工作表明，直接MS分析技术在结构分析、动力学监控中都具有相当的优势。

当然，ESI-Q TOF-MS等软电离技术在直接MS分析中可能受样品基质干扰严重。

高强不对称场离子迁移谱检测技术（FAIMS）通过将分析物与基质在气相实现分离的方式，可有效地解决背景干扰的问题。

Cui等［121］对顺铂及其水解产物的研究表明，经ESI-FAIMS-ITMS技术的分析，样品化学背景得到较好的抑制，信噪比可比常规ESI-MS方法提高30倍。

除此之外，FT-ICP-MS因较强的电离能量，在样品基质干扰的抑制方面也效果显著。

利用该技术高灵敏度的特点，人们将其用于生物样品中的痕量Pt的定量分析（检出限为pg/mL量级）［122］、DNA与Pt结合总量的检测［110］、Pt与DNA［123］及蛋白［118，119］的相互作用研究等。

1.7核磁共振（NMＲ）
NMＲ因能提供液态样品的详细结构信息而成为药物-DNA相互作用的主要研究手段之一，尤其是早期在对顺铂的反应位点及空间构型的研究中发挥了重要作用［124］。

通过对195Pt、1H、15N、13C等NMＲ谱的采集，1D及2D NMＲ方法在药物晶体结构［128］、药物-DNA相互作用［125 127，104］、药物-蛋白质相互作用［128］、药物-脂质相互作用［129］、药物与细胞内其他生物分子的相互作用［130，131］等方面贡献突出。

随着NMＲ探针技术及联用技术的不断发展，目前已可实现快速、高通量的分析及细胞水平的分析［130］等。

LC-NMＲ技术的发展也通过样品的预分离而提高了NMＲ的分析速度及效率，降低了NMＲ数据分析的复杂性，保证了数据分析的准确度［130］。

关于NMＲ技术在铂类抗癌药物中的应用现状及发展方向，详见相关综述［16，130］。

1.8其他方法
除了以上检测技术外，基于X-射线衍射技术（XＲD）的方法因在结构检测上的优势而被用于固态样品结构的分析。

相关报道包括XＲD法对药物-DNA相互作用的研究［132，133］、XＲD对药物-蛋白质相互作用的研究［134，135］、X射线光电子能谱（XPS）对药物-DNA相互作用的研究［136］等。

由于原理限制，该技术很难实现对生理条件（溶液）下药物行为的观测，致使其应用范围受到限制。

其他分析手段还有，例如，利用薄层色谱（TLC）、薄层电泳（TLE）以及两者的联用对铂类化合物在溶液中的水解行为的研究［137 139］，以吸附溶出伏安法（ASV）及中子活化分析（NAA）对临床样品中的铂类抗癌药物及其代谢物的检测［140］，圆二色谱法（CD）［141］对反铂对血清蛋白的影响的研究［141］，以分子信标对顺铂造成的DNA损伤的分析［142］，以红外多光子解离谱（IＲMPD）对药物与鸟嘌呤及腺嘌呤的加合作用的研究［84］等。

2结论及展望
作为目前临床应用最广泛的癌症治疗用药，铂族化合物的作用机理、毒副作用、耐药性等备受关注。

此外，由于这些铂族抗癌药物及其一水合物易与生物体内的N、S、O等元素反应，药物在进入体内后可能产生种类繁多的Pt化合物，其与生物分子的结合方式、产物、转换传递及相关网络可能比我们已知的要复杂很多。

鉴于此，对药物作用后的生物体实现原位、实时、灵敏、精确的含Pt（II）物种的监测有着重要的临床意义。

同时，对铂类抗癌药物的作用机理的全面理解和把握，也对新型的靶向化学药物的研发有着理论指导作用。

生物基质的干扰是目前大多数检测技术面临的一大难题。

为避免Pt与血浆中的蛋白反应，血浆蛋白通常通过溶剂沉析和超滤的方法除去。

尽管如此，超滤液或萃取液中仍含多种铂类化合物，且超滤的方法耗时较长，选择性低（其选择性很大程度上取决与使用的滤膜的选择性）。

因此，建立起种类专一。