第五章 反胶团萃取与双水相萃取1
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第五章 反胶团萃取与双水相萃取
一、反胶团萃取
反胶团溶液形成的条件和特性 反胶团萃取蛋白质的基本原理 影响反胶团萃取蛋白质的主要因素 反胶团萃取设备 反胶团萃取的应用
基本概念
何谓胶团、反胶团？
•
表面活性剂分子的两 亲性质使之在水溶液 中能自发形成结构有 序的多分子聚集体,通 常称为胶团。胶团具 有表面活性剂烷烃链 构成的疏水内核和亲 水基团包裹着的外壳, 即所谓的核-壳结构 。
中盐浓度较高时，无机盐对反胶团产生脱水作用，使
W0 下降，反胶团尺度减小，位阻效应加强，蛋白质的 萃取率明显降低。
影响反胶团萃取的主要因素
蛋白质的萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电 荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关，所以，任何 可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素， 都有助于蛋白质的萃取。
• 含有磷酯酶的发酵液 经过泵进入到陶瓷超 滤膜组件中，磷酯酶 被截留在膜内，萃余 相则返回到反应器， 从而实现磷酯酶的分 离。
（2） 中空纤维膜
中空纤维管是另一类被广泛用于液-液 分离的膜萃取器。它具有很大的比表面积， 且与反胶团技术相结合能减少蛋白质的失 活，是一项很有实用前景的生物分离技术。 将亲和配基（活性色素辛巴蓝）加入 到大豆卵磷酯-正已烷系统中，制成亲和反 胶团相，并将此胶团相固定于聚丙烯中空 纤维膜内，从而构建起亲和反胶团萃取膜 的分配色谱装置（AMPC）。
反胶团萃取的应用
蛋白质分离
反胶团萃取的应用
浓缩α-淀粉酶
• 用2个混合槽和2个澄清槽组成连续萃取/反萃取流程， 用 TOMAC/0.1%(v/v) 辛醇 - 异辛烷的反胶团体系循环萃 取分离α -淀粉酶，控制第一级水相中酶浓度在较低水 平上，使失活速度很小，将 α - 淀粉酶浓缩了 8 倍，酶 活力损失约30%。 • 对该过程优化，在反胶团中加入非表面活性剂，以提 高分配系数，同时加大搅拌速度，以提高传质速率， 第二级反萃液中 α - 淀粉酶的活力回收率为 84% ，浓缩
该表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基 团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所 形成的反胶束较大，半径为170 nm，有利于大分子蛋 白质进入。
反胶团溶液形成的条件和特性
阳离子表面活性剂
常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下： (1)CTAB(溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴)
反胶团溶液形成的条件和特性
4. 反胶团的制备
①注入法:将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面 活性剂的非极性有机溶剂中去，然后进行搅拌直到形成 透明的溶液为止。 ②相转移法：将酶或蛋白质从主体水相转移到含表面活 性剂的非极性有机溶剂中形成反胶团-蛋白质溶液，即 把含有表面活性剂的有机相和含有蛋白质的水相接触， 在缓慢的搅拌下，一部分蛋白质缓慢转入（萃入）有机 相。 ③溶解法：将含有反胶团（W＝3~30）的有机溶液与蛋 白质固体粉末一齐搅拌，使蛋白质进入反胶团中 。 用 于非水溶性蛋白质。
增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，
从而增大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂
浓度过高时，有可能在溶液中形成比较复杂的
聚集体，同时会增加反萃取过程的难度。因此，
应选择蛋白质萃取率最大时的表面活性剂浓度
为最佳浓度。
影响反胶团萃取的主要因素
助表面活性剂 助表面活性剂是一类能提高表面活性， 增强界面膜的流动性，使界面膜的弯曲
液pH值能决定蛋白质能否进入源自文库胶团。
反胶团萃取蛋白质的基本原理
影响蛋白质分子向反胶团中转移的因素
位阻效应
蛋白质等生物大分子的分子较大，当反胶团直径较小时， 会对蛋白质产生空间排阻作用，从而使蛋白质在反胶团 中的溶解度降低，这种现象称为位阻效应。 反胶团的“水池”直径受含水率 W0 的调节，当水溶液
了17倍。
反胶团萃取的应用
浓缩α-淀粉酶
反胶团萃取的应用
胞内酶的提取
思考题
1 临界胶团浓度、反胶团
2 反胶团形成的条件，反胶团和胶团
的比较 3 影响反胶团萃取蛋白质的主要因素
反胶团溶液形成的条件和特性
5. 反胶团的含水率、大小
Wo
C水 C表面活性剂
3WoVW R As
一般为10-100 nm
反胶团萃取蛋白质的基本原理
反胶团的溶解作用
由于反胶团内存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白 质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。 因此反胶团萃取特别蛋适合白质类生物大分子。
更加容易，有利于微乳液的形成的物质。
常用的助表面活性剂有：中、高碳脂
肪醇，羊毛脂衍生物，胆甾醇，乙二醇
等。
反胶团萃取设备
要实现反胶团萃取的工业化，关键之 一是开发适用于反胶团萃取的高效分离 设备 1、膜萃取器 膜萃取器有管状超滤膜和中空纤维膜 两种。
（1）管状超滤膜
• 用管状陶瓷超滤膜截 留含有磷脂酶的反胶 团，实现了对生物产 品的部分分离。
基本概念
何谓胶团、反胶团 ？ • 反胶团是指当油相中 表面活性剂的浓度超 过临界胶束浓度后, 其 分子在非极性溶剂中 自发形成的亲水基向 内、疏水基向外的具 有极性内核(polarcore) 的多分子聚集体。
基本概念
反胶团萃取
• 反胶团是表面活性剂分子溶于 非极性溶剂中自发形成的聚集 体 ,其中表面活性剂的极性头 朝内而非极性头朝外与有机溶 剂接触。胶团内可溶解少量水 而形成微型水池，蛋白质进入 微水池中，可随反胶团转入有 机溶剂，但不与有机溶剂直接 接触，反胶团萃取就是利用这 一特性进行蛋白质分离的方法， 反胶团溶液是宏观上透明均一 的热力学稳定体系。
蛋白质溶入反胶束溶液主要受到表面活性剂与蛋白质 的静电作用、空间排阻作用的影响。
反胶团萃取蛋白质的基本原理
影响蛋白质分子向反胶团中转移的因素
静电作用力
在反胶团萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电的 分子，因此静电相互作用肯定是萃取过程中的一种推动 力。 由于蛋白质所带电荷与溶液pH值有直接关系，所以溶
表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极 性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性 剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂。
反胶团溶液形成的条件和特性
阴离子表面活性剂
在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表 面活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸－2－乙 基己基磺酸钠
反胶团溶液形成的条件和特性
3. 胶团、反胶团的形成
将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓 度(CMC)时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起 而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶 液中的胶束，称为胶团。 若将表面活性剂溶于 非极性的有机溶剂中， 并使其浓度超过临界胶 束浓度(CMC)，便会在 有机溶剂内形成聚集体， 这种聚集体称为反胶团。
(2)DDAB(溴化十二烷基二甲铵)
反胶团溶液形成的条件和特性
阳离子表面活性剂
常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下： (3) TOMAC(氯化三辛基甲铵)
反胶团溶液形成的条件和特性
2. 临界胶团浓度
要形成胶团或反胶团溶液，表面活性剂需达
到一定浓度。临界胶束浓度是形成胶团或反
胶团的表面活性剂的最低浓度，用CMC表示。
a
b
c
d
反胶团的溶解作用
反胶团萃取蛋白质的基本原理
蛋白质溶入反胶团的过程
反胶团萃取蛋白质的基本原理
反胶团萃取蛋白质的过程
蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶 剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层 ，同 邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形，接着两 界面形成含有蛋白质的反胶团 ，然后扩散到有机 相中 , 从而实现了蛋白质的萃取。改变水相条件 (如pH值、离子种类或离子强度 ) ,又可使蛋白质从 有机相中返回到水相中 ,实现反萃取过程。
2、离心萃取器
反胶团溶液-水-蛋白质所组成的萃取体 系，由于表面活性剂的存在，界面张力低， 易乳化。另外，由于萃取的目标产物是蛋 白质，易变性失活。为了尽量避免蛋白质 的变性，应尽量缩短操作时间，因而反胶 团离心萃取是一项很合适的蛋白质萃取分 离技术。
3、混合澄清槽 混合-澄清式萃取器是一种最常用的液 -液萃取设备，该设备由料液与萃取剂的混 合器和用于两相分离的澄清器组成，可进 行间歇或连续的液-液萃取。 但该设备最大的缺点是反胶团相与水 相相混合时，混合液易出现乳化现象，从 而增加了相分离时间。
反胶团萃取的特点
成本低 选择性高 操作方便 放大容易 萃取剂 (反胶团相 )可循环利用 蛋白质不易变性等优点
反胶团溶液形成的条件和特性
1. 表面活性剂
反胶团 (reversed micelle) 是表面活性剂分散于连续
有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体，所以表面活
性剂是反胶团溶液形成的关键。
影响反胶团萃取的主要因素
水相pH值对萃取的影响
影响反胶团萃取的主要因素
离子强度对萃取率的影响
离子强度对萃取率 的影响主要从一下 几个方面： ①影响蛋白质与表 面活性剂极性基团 的静电作用； ②影响反胶团的含 水率； ③离子进入“微水 池”影响其他溶质 的进入。
影响反胶团萃取的主要因素
表面活性剂类型及浓度的影响
一、反胶团萃取
反胶团溶液形成的条件和特性 反胶团萃取蛋白质的基本原理 影响反胶团萃取蛋白质的主要因素 反胶团萃取设备 反胶团萃取的应用
基本概念
何谓胶团、反胶团？
•
表面活性剂分子的两 亲性质使之在水溶液 中能自发形成结构有 序的多分子聚集体,通 常称为胶团。胶团具 有表面活性剂烷烃链 构成的疏水内核和亲 水基团包裹着的外壳, 即所谓的核-壳结构 。
中盐浓度较高时，无机盐对反胶团产生脱水作用，使
W0 下降，反胶团尺度减小，位阻效应加强，蛋白质的 萃取率明显降低。
影响反胶团萃取的主要因素
蛋白质的萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电 荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关，所以，任何 可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素， 都有助于蛋白质的萃取。
• 含有磷酯酶的发酵液 经过泵进入到陶瓷超 滤膜组件中，磷酯酶 被截留在膜内，萃余 相则返回到反应器， 从而实现磷酯酶的分 离。
（2） 中空纤维膜
中空纤维管是另一类被广泛用于液-液 分离的膜萃取器。它具有很大的比表面积， 且与反胶团技术相结合能减少蛋白质的失 活，是一项很有实用前景的生物分离技术。 将亲和配基（活性色素辛巴蓝）加入 到大豆卵磷酯-正已烷系统中，制成亲和反 胶团相，并将此胶团相固定于聚丙烯中空 纤维膜内，从而构建起亲和反胶团萃取膜 的分配色谱装置（AMPC）。
反胶团萃取的应用
蛋白质分离
反胶团萃取的应用
浓缩α-淀粉酶
• 用2个混合槽和2个澄清槽组成连续萃取/反萃取流程， 用 TOMAC/0.1%(v/v) 辛醇 - 异辛烷的反胶团体系循环萃 取分离α -淀粉酶，控制第一级水相中酶浓度在较低水 平上，使失活速度很小，将 α - 淀粉酶浓缩了 8 倍，酶 活力损失约30%。 • 对该过程优化，在反胶团中加入非表面活性剂，以提 高分配系数，同时加大搅拌速度，以提高传质速率， 第二级反萃液中 α - 淀粉酶的活力回收率为 84% ，浓缩
该表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基 团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所 形成的反胶束较大，半径为170 nm，有利于大分子蛋 白质进入。
反胶团溶液形成的条件和特性
阳离子表面活性剂
常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下： (1)CTAB(溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴)
反胶团溶液形成的条件和特性
4. 反胶团的制备
①注入法:将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面 活性剂的非极性有机溶剂中去，然后进行搅拌直到形成 透明的溶液为止。 ②相转移法：将酶或蛋白质从主体水相转移到含表面活 性剂的非极性有机溶剂中形成反胶团-蛋白质溶液，即 把含有表面活性剂的有机相和含有蛋白质的水相接触， 在缓慢的搅拌下，一部分蛋白质缓慢转入（萃入）有机 相。 ③溶解法：将含有反胶团（W＝3~30）的有机溶液与蛋 白质固体粉末一齐搅拌，使蛋白质进入反胶团中 。 用 于非水溶性蛋白质。
增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，
从而增大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂
浓度过高时，有可能在溶液中形成比较复杂的
聚集体，同时会增加反萃取过程的难度。因此，
应选择蛋白质萃取率最大时的表面活性剂浓度
为最佳浓度。
影响反胶团萃取的主要因素
助表面活性剂 助表面活性剂是一类能提高表面活性， 增强界面膜的流动性，使界面膜的弯曲
液pH值能决定蛋白质能否进入源自文库胶团。
反胶团萃取蛋白质的基本原理
影响蛋白质分子向反胶团中转移的因素
位阻效应
蛋白质等生物大分子的分子较大，当反胶团直径较小时， 会对蛋白质产生空间排阻作用，从而使蛋白质在反胶团 中的溶解度降低，这种现象称为位阻效应。 反胶团的“水池”直径受含水率 W0 的调节，当水溶液
了17倍。
反胶团萃取的应用
浓缩α-淀粉酶
反胶团萃取的应用
胞内酶的提取
思考题
1 临界胶团浓度、反胶团
2 反胶团形成的条件，反胶团和胶团
的比较 3 影响反胶团萃取蛋白质的主要因素
反胶团溶液形成的条件和特性
5. 反胶团的含水率、大小
Wo
C水 C表面活性剂
3WoVW R As
一般为10-100 nm
反胶团萃取蛋白质的基本原理
反胶团的溶解作用
由于反胶团内存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白 质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。 因此反胶团萃取特别蛋适合白质类生物大分子。
更加容易，有利于微乳液的形成的物质。
常用的助表面活性剂有：中、高碳脂
肪醇，羊毛脂衍生物，胆甾醇，乙二醇
等。
反胶团萃取设备
要实现反胶团萃取的工业化，关键之 一是开发适用于反胶团萃取的高效分离 设备 1、膜萃取器 膜萃取器有管状超滤膜和中空纤维膜 两种。
（1）管状超滤膜
• 用管状陶瓷超滤膜截 留含有磷脂酶的反胶 团，实现了对生物产 品的部分分离。
基本概念
何谓胶团、反胶团 ？ • 反胶团是指当油相中 表面活性剂的浓度超 过临界胶束浓度后, 其 分子在非极性溶剂中 自发形成的亲水基向 内、疏水基向外的具 有极性内核(polarcore) 的多分子聚集体。
基本概念
反胶团萃取
• 反胶团是表面活性剂分子溶于 非极性溶剂中自发形成的聚集 体 ,其中表面活性剂的极性头 朝内而非极性头朝外与有机溶 剂接触。胶团内可溶解少量水 而形成微型水池，蛋白质进入 微水池中，可随反胶团转入有 机溶剂，但不与有机溶剂直接 接触，反胶团萃取就是利用这 一特性进行蛋白质分离的方法， 反胶团溶液是宏观上透明均一 的热力学稳定体系。
蛋白质溶入反胶束溶液主要受到表面活性剂与蛋白质 的静电作用、空间排阻作用的影响。
反胶团萃取蛋白质的基本原理
影响蛋白质分子向反胶团中转移的因素
静电作用力
在反胶团萃取体系中，表面活性剂与蛋白质都是带电的 分子，因此静电相互作用肯定是萃取过程中的一种推动 力。 由于蛋白质所带电荷与溶液pH值有直接关系，所以溶
表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极 性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性 剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂。
反胶团溶液形成的条件和特性
阴离子表面活性剂
在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表 面活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸－2－乙 基己基磺酸钠
反胶团溶液形成的条件和特性
3. 胶团、反胶团的形成
将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓 度(CMC)时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起 而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶 液中的胶束，称为胶团。 若将表面活性剂溶于 非极性的有机溶剂中， 并使其浓度超过临界胶 束浓度(CMC)，便会在 有机溶剂内形成聚集体， 这种聚集体称为反胶团。
(2)DDAB(溴化十二烷基二甲铵)
反胶团溶液形成的条件和特性
阳离子表面活性剂
常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下： (3) TOMAC(氯化三辛基甲铵)
反胶团溶液形成的条件和特性
2. 临界胶团浓度
要形成胶团或反胶团溶液，表面活性剂需达
到一定浓度。临界胶束浓度是形成胶团或反
胶团的表面活性剂的最低浓度，用CMC表示。
a
b
c
d
反胶团的溶解作用
反胶团萃取蛋白质的基本原理
蛋白质溶入反胶团的过程
反胶团萃取蛋白质的基本原理
反胶团萃取蛋白质的过程
蛋白质进入反胶团溶液是一协同过程。在有机溶 剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层 ，同 邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形，接着两 界面形成含有蛋白质的反胶团 ，然后扩散到有机 相中 , 从而实现了蛋白质的萃取。改变水相条件 (如pH值、离子种类或离子强度 ) ,又可使蛋白质从 有机相中返回到水相中 ,实现反萃取过程。
2、离心萃取器
反胶团溶液-水-蛋白质所组成的萃取体 系，由于表面活性剂的存在，界面张力低， 易乳化。另外，由于萃取的目标产物是蛋 白质，易变性失活。为了尽量避免蛋白质 的变性，应尽量缩短操作时间，因而反胶 团离心萃取是一项很合适的蛋白质萃取分 离技术。
3、混合澄清槽 混合-澄清式萃取器是一种最常用的液 -液萃取设备，该设备由料液与萃取剂的混 合器和用于两相分离的澄清器组成，可进 行间歇或连续的液-液萃取。 但该设备最大的缺点是反胶团相与水 相相混合时，混合液易出现乳化现象，从 而增加了相分离时间。
反胶团萃取的特点
成本低 选择性高 操作方便 放大容易 萃取剂 (反胶团相 )可循环利用 蛋白质不易变性等优点
反胶团溶液形成的条件和特性
1. 表面活性剂
反胶团 (reversed micelle) 是表面活性剂分散于连续
有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体，所以表面活
性剂是反胶团溶液形成的关键。
影响反胶团萃取的主要因素
水相pH值对萃取的影响
影响反胶团萃取的主要因素
离子强度对萃取率的影响
离子强度对萃取率 的影响主要从一下 几个方面： ①影响蛋白质与表 面活性剂极性基团 的静电作用； ②影响反胶团的含 水率； ③离子进入“微水 池”影响其他溶质 的进入。
影响反胶团萃取的主要因素
表面活性剂类型及浓度的影响