制备色谱应用ppt课件

本书旨在着重介绍各种色谱技术的应用，而非详细描 述这些技术的原理。书中所列举的大部分实例来自次生代 谢产物及天然产物。因为制备型色谱的主要作用是对该类 物质的分离。对于大分子的分离与纯化，色谱分离也用于 分离某些重要的药用生物活性蛋白 ( 包括利用重组技术获 得的蛋白 ) 、生物治疗品与诊断试剂，以符合高纯度的要 求。因此，用于生物大分子纯化的一些特殊分离技术，如 亲和色谱和分子排阻色谱等也在本书中作了介绍。光学纯 度的治疗药物是另一日益受到重视的研究领域，本书第九 章列入了有关手性分子的分离方法。
（1）溶剂法 水＞甲醇＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞苯＞石油醚 冷浸 煎煮 回流 渗漉 连续抽提 （2）水蒸气蒸馏法 （3）升华法
2.2溶剂的极性 溶剂的极性可以大体根据介电常数(ε)的大小来判断。常用溶剂的介电 常数及其极性排列如表1-5所示：
2.2.1 官能团的极性
(2) 化合物的极性则由分子中所含官能团的种类、数目及排 列方式等综合因素所决定。以氨基酸来说，分子结构中既 有正电基团，又有负电基团，故极性很强。高级脂肪酸， 如硬脂酸，虽也含有如羧基这样的强极性基团，但因分子 的主体乃由长链烃基所组成，故极性依然很弱。又如葡萄 糖，因分子中含有许多 -OH 基，故为极性化合物，但鼠李 糖(6-去氧糖)及加拿大麻糖(2，6-去氧糖)因分子中— CH20H及—CHOH分别脱去氧变为—CH3及—CH2，故极性 即随之降低。
溶剂混溶性表
中药化学成分提取基本方法 2．1 提 取
合理地选择单一或混合溶剂进行提取是保证正确的样品制备的第一步。 首先以低极性溶剂提取可得到亲脂性的组分，而用醇类溶剂提取则可得到 大量的极性与非极性物质。若开始阶段采用极性大的溶剂提取，则接着可 用溶剂分配方法将提取物分为极性不同的部位。 在提取操作的各种方法中，搅拌与机械振荡是常用的方法，此外还有渗 滤或加压固液提取等手段。在加压固液提取法中，将干燥的植物装在柱中 ，用泵加压使提取溶剂通过柱床。Dionex 公司生产的适用于该方法的一 种提取装置ASE 200(Accelerated Solvent Extraction)，据称每次提取只 需20min．提取温度也可调至高达200℃，并可选择三种不同大小的提取 器：11，22和33ml。尽管该仪器价格较高，却代表了提取技术方面的重 要进步。 在蛋白质的纯化过程中，提取物的制备是关键的一步，其中有些需要特 别注意之处，如有时可能需要加人缓冲溶液、洗涤剂、辅因子或其他一些 试剂。
一张圆滤纸可同时点上8～10个样品。 样品滴好后，将一小条滤纸芯插入滤纸 的中心小孔。移到盛有展开溶剂的直径 为12厘米的培养皿中，滤纸芯浸在溶剂 中，滤纸上再盖以同样直径的培养皿， 以进行层析(如图2所示)。溶剂的前沿达 到滤纸边缘后，取出滤纸，待溶剂挥发 后，根据情况，喷上显色剂。 如果要测定不同样品中同类成分的分 布情况，则可在一张圆形滤纸上分别滴 加各种中药(最多可滴加10种)的乙醇提 取液，用溶剂展开后喷同一种显色剂。 当欲观察一种样品中几种成分的分布情 况，则可滴加10个同一种中药的乙醇提 取液，经溶剂展开后，将滤纸剪为10份 ，分别喷以不同显色剂。
第一章 样品的制备与纯化
样品的制备对于复杂的分离与纯化非常重要。恰当的样品预处理可免去 后续操作过程中的许多麻烦，使分离纯化变得更为容易。无论样品是来源于 混有蛋白质的生物体、生产中混有残存催化剂的工业制品，或混有干扰杂质 的植物体，通过简单的预处理就可以除去其中大部分不需要的物质。 样品的预处理特别适用于需要使用昂贵的制备型高压液相色谱柱时。尽 管制备样品的目的不尽相同，但其中许多操作与分析型高压液相色谱中所采 用的一样。当处理生物样品时问题可能更加复杂，因为样品不仅可能含有复 杂的大分子，而且还可能混有前面纯化过程中残留的缓冲液、盐及洗涤剂。 因此，必须在预处理中去除上述污染物以免污染高压液相色谱柱。 在设计纯化方案时，通常先使用高效与低分辨率的预处理方法，其中包 括一些经典的方法，如选择性溶剂提取、过滤、沉淀、透析、离心及简单的 常压柱色谱分离等。而一些较新的方法，如超临界流体萃取、固相萃取等则 更具有快速、高效的优点。 生物分子(尤其是生物聚合体)与常见的次生代谢产物性质明显不同，需要 使用特殊的预处理方法。除常用的离心、沉淀(如用硫酸铵沉淀蛋白质)、离 子交换及凝胶过滤等方法(Wehr，1990)外，可用透析、超滤等专用方法。
三、展开溶剂 以甲醇或95％乙醇为展开溶剂。可采用重蒸馏的工 业规格的溶剂。
四、显色剂 优点是节省原料、试剂和时间，还可以防止试管反 应中由中药颜色造成的假阳性。
二．试管预试法 1．样品制备 （ 1 ） 酸 性 乙 醇 提 取 液 称 取 通 过 2 0 目 的 中 药 粉 末 1 0 g， 加 70ml0.5%的盐酸乙醇溶液，在水浴上回流加热10min，趁热滤过，得 酸性乙醇提取液。此滤液用以检查酚性成分、有Βιβλιοθήκη Baidu酸和生物碱。 （2）水提取液 称取通过20目的中药粉末10g，加水100ml，在室 温浸泡过夜，滤取10ml滤液，供检查氨基酸、多肽和蛋白质等。剩余 的药渣及浸液在60℃水浴中加热10min，立即过滤，此滤液供检查糖 、多糖、皂苷、苷类和鞣质等。 （3）甲醇提取液 称取通过20目的中药粉末10g，加入70ml甲醇， 在水浴上回流加热10min，趁热滤过，滤液供检查黄酮及其苷类、蒽 醌及其苷类、强心苷、香豆精及其苷类、内酯、挥发油、植物甾醇和 油脂类等。 （试管反应因中药颜色深，容易造成假阳性） 中药化学成分系统预试法 1．单项预试即直接寻找生物碱、苷、、、。 2．系统预试法 常用递增极性溶剂法
一些有关生物活性(或其他)物质的具体的提取分离方法的综述文章分别发 表 在 ‘ ‘ Joumal of Chromatography”，“Joumal of Liquid Chromatography and Related Technologies”，“Analytical Chemistr，’， “Natural Product Reports'’，“Phytoehemical Analy‘s∥．“LC-GC Magazine'’及其他各种专业杂志上。另外一些有价值的关于天然产物分离的 论 述 可 参 见 E．L．Ghisalberti 发 表 在 “ Bioactive Natural Products： Detection，Isolation and structural De—termination'’(eds S M Colegate，R J Molyneux，CRC Press，Boca Raton。1993)，T A Van Beek发表在“Chemie~s from Plants”(ed N J Walton，World Scientific Publishing，London，1 997) 及 “ Ad—vances in Natural Products Chemistry：Extraction and Isolation ofBiologically Active Compounds'’(eds S Natori，N Ikekawa和MSuzuki，John Wiley，New York，1981)中的有关章节。(中文专著有徐任生，陈仲良主编的《中草药有 效成分提取与分离》，第二版，上海科学技术出版社，1983年，1989年第 二次印刷——译者注。)
再如，从黄花夹竹桃果仁中曾分出下列七种成分。(表1-4)。
其中，与黄夹次甙相比，黄夹甙A、B因为分子中多出2个glc，故极性要 大得多，并以甙A(R=CHO)>甙B(R=CH3)。 五种黄夹次甙中， A～D的结构差别仅在 R 不同，故极性大小即取决乎 R 的种类，并排成下列顺序： 次甙D(—COOH)>C(CH2OH)>A(CHO)>B(CH3) 又，单乙酰黄夹次甙B与黄夹次甙B比较，--OH变为—OCOCH3，故极性 还要降低。 综上，黄花夹竹桃中七种强心甙的极性将按下列顺序排列。甙A> 甙B> 次甙D>次甙c>次甙A>次甙B>单乙酰次甙B。 上述极性强弱顺序决定着这些化合物在硅胶上的吸附行为及柱层析时的 洗脱规律。 应当强调指出，酸性、碱性及两性有机化合物的极性强弱及吸附行为主 要由其存在状态(游离型或解离型)所决定，并受溶剂pH韵影响。以生物碱而 言，游离型为非极性化合物，易为活性炭所吸附，但解离型则不然，为极性 化合物，不易为活性炭所吸附。因此实践中常可通过改变溶剂pH以改变酸 性、碱性及两性化合物的存在状态，进而影啊其吸附或层离行为达到分离精 制的目的。
乙醚：氯仿液 2%碳酸钠溶液提取 乙醚氯仿液
盐酸酸化 乙醚提取 3/4量 1/4量 乙醚液 水蒸气蒸馏 部分甲 水溶性成分（糖、蛋白 碱性成分（生物碱 脱水、回收 不挥发部分 馏出液 （中性成分） 质、皂苷、鞣质及其他 和其他胺类成分 部分乙 乙醚提取 乙醚提取 水、溶性高分子化合物、 酸性成分 部分甲b 部分甲a 各种亲水性苷、水溶性 （有机酸及其他酸性成分）（中性非挥发性成分 中性挥发性成分 生物碱） 油脂、蜡、 树脂、甾萜、 酚类、 植物色素等）
氯仿液氢氧化铵碱化氯仿提2碳酸钠溶液提取碱性水液氯仿溶液乙醚氯仿液盐酸中和浓缩脱水回收溶剂盐酸酸化部分丁部分丙乙醚提取34量14量乙醚液水蒸气蒸馏部分甲水溶性成分糖蛋白碱性成分生物碱脱水回收不挥发部分中性成分质皂苷鞣质及其他和其他胺类成分部分乙乙醚提取乙醚提取水溶性高分子化合物酸性成分部分甲b部分甲a各种亲水性苷水溶性有机酸及其他酸性成分中性非挥发性成分中性挥发性成分生物碱油脂蜡树脂甾萜13溶剂混溶性表14中药化学成分提取基本方法21合理地选择单一或混合溶剂迚行提取是保证正确的样品制备的第一步
系统预试流程图
中药粉末（6g干品或12g鲜品） 甲醇60ml，温浸过夜，滤过 中药残渣 滤液
回收甲醇 2%醋酸，15ml温浸20-3-min， 滤过 提取物 中药残渣 酸液 合并加醋酸调pH5-6，用乙醚：氯仿（1：1）提取3次
酸水液 氢氧化铵碱化氯仿提 碱性水液 盐酸中和浓缩 部分丁 氯仿溶液 脱水回收溶剂 部分丙 水液
制备色谱应用
目前，有关分析方法方面的文献有很多，但专门论述制备型色谱技术 的著作还很少。本书试图填补这方面的缺憾，在分离方法的设计方面向 读者提供一些指导。 自本书第一版于1986年发行以来，天然产物的研究又取得了重大进展 。谱学技术的迅速发展，如二维核磁共振技术的应用、仪器自动化程度 的提高及X单晶衍射技术的常规化，都极大地简化了天然产物的结构解析 工作。因而，如何有效地从有机体(植物、动物和微生物)中提取具有生物 活性的纯化合物已成为研究的主要课题。活性物质的极性可能很高或很 低，它们在色谱分离过程中可能会经常失去生物活性，因此，一定要采 用温和的分离条件，并需要引入各种新的以及已改进的色谱分离方法来 解决工作中遇到的问题。本书在第一版的基础上归纳并选择性地整理了 近期发表的各种新的色谱技术与应用实例，以供读者选 用，同时在各章后列出了主要参考资料。 本书的第一部分叙述样品预处理的主要方法，色谱分离之前的预处理 可以节省许多后续纯化所花费的时间。其次论述液一固色谱分离方法， 并着重介绍各种加压色谱方法。此后介绍各种液一液色谱技术及其在分 离不稳定化合物中的优越性。大分子及手性物质的分离在本书中被分别 列为一章来介绍。这两章的内容对于新型药物、基因产品乃至初级代谢 产物的分离都十分重要。本书的最后一章论述的是设计分离路线的策略 。
1．中药化学成分概述 成分分类 生物碱 有机胺类 吡咯类 吡啶类 莨菪烷类 喹啉类 异喹啉类 菲啶类 丫啶酮类 吲哚类 咪唑类 喹唑酮类 嘌呤类 甾体类 帖类 大环类 其他类 苷类 黄酮苷 蒽醌苷 皂苷 强心苷 香豆精苷 挥发油 有机酸 蛋白质 氨基酸 树脂 糖类 鞣质
中药化学成分预试
圆形滤纸层析预试法 一、样品的制备 取通过20目筛的中草药粉末5 克，加入 50 毫升 95 ％乙醇，在 水浴上回流加热10分钟。过滤， 滤液浓缩至 1/2 量，得“乙醇提 取液”备用，此提取液浓度为每 5毫升相当于1克生药。 二、操作方法 取直径12．5厘米的普通圆形 滤纸(新华牌或其他牌号，要求 质地较细)一张，滤纸中心处打 一小孔、备插入滤纸芯之用，将 O．1毫升乙醇提取液仔细滴加 在距纸中心约1厘米处(如图1所 示)。
第一章 引
言
色谱方法的起源与天然产物的研究工作密切相关。继1906年Tswett的开 创性工作之后，首次真正意义上的制备型液相色谱分离是于20世纪30年代 对植物代谢产物——色素，如叶绿素及胡萝卜素等的分离。天然产物的研 究与色谱方法持续保持紧密的关系，每当提及各种生物分子纯化方法的进 展时，都不能不考虑到色谱方法。仅就高压液相色谱技术而言，其应用就 涉及到制药工业、生物技术、生物医学及生物化学研究、能源、食品、化 妆品、环境科学、药物及维生素等许多领域。随着从微生物、海洋及陆地 高等生物体中发现新的先导化合物的工作日益引起广泛的兴趣，人们经常 需要从大量或少量的混合物中以有效、快速、低成本的方法分离出纯化合 物。通常的色谱分离方法很少能同时满足上述三个要求，因此，如何选择 正确的分离方法无疑非常重要。本书的第一版(1986)旨在集合各种制备型 的分离方法供读者参考。近年，各种色谱仪器及其新的应用又有了快速的 发展。因此，提供一本新的、包括目前正飞速发展的生物分子的分离技术 的参考书显然十分重要。