银杏叶总黄酮提取工艺

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该提取方法操作简便对环境无污染提取成本较低结果准确可靠适宜于工业化生产为进一步研究银杏叶中总黄酮提取工艺提供了理论依银杏叶含有丰富的黄酮具有广泛开发和利用价值值得综合利用应该加强对其资源的开发
第 36 卷 第 5 期 201220年12 9年月9 月
山东中医药大学学报
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY OF TCM
总黄酮醇苷含量 =(槲皮素 + 山柰素 + 异鼠李 素)×2.51 2.3 溶液的制备 2.3.1 银杏叶提取物的制备 将采摘的新鲜银杏叶 自然晾干,粉碎后过 40 目筛。 取银杏叶粉末 10 g 置 于 1 000 mL 圆底烧瓶中,加不同浓度乙醇加热回流 提取,过滤。 滤液浓缩,回收乙醇至无醇味,减压干 燥,即得。 2.3.2 供试品溶液的制备 将干燥后所得的粉末, 精密称取 35 mg,加甲醇 - 25%盐酸(4∶1)的混合溶液 25 mL,至水浴中恒温加热回流 30 min,迅速冷却至 室温,转移至 50 mL 容量瓶中,用甲醇稀释至刻度, 摇匀,用微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。 2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素 1.65 mg、 山柰素 1.57 mg、异鼠李素 1.18 mg,置于 50 mL 容量 瓶中,加入甲醇定容至刻度,摇匀,得浓度为每 1 mL 中含有 30,30,20 μg 的标准储备液。 2.4 标准曲线的 制备 精密吸取对照品溶液 100, 200,400,500,600 μL 分 别 置 于 编 号 1、2、3、4、5 号 的 1 mL 容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。 以满 样进量法精密吸取 20 μL 进样,在波长 360 nm 处测 定峰面积。 以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,得槲 皮 素 回 归 方 程 :A=4×106C- 90933(r=0.9996);山 柰
Vol.36,No.5 第 36 S卷ep第.2051期2
银杏叶总黄酮提取工艺研究
王 心 1,李 峰 2
(1.山东中医药大学 2009 年级硕士研究生,山东 济南 250355; 2.山东中医药大学药学院,山东 济南 250355)
[摘要] 目的:筛选银杏叶总黄酮最佳提取工艺,以银杏叶总黄酮的提取率为指标进行研究。 方法:运用正交设
水平
1 2 3
表1 溶剂浓度 A
(%) 60 70 80
正交试验考察因素表
料液比 B
提取时间 C (t/h)
提取次数 D
1∶40
1
1
1∶50
2
2
1∶60
3
3
360 nm;进样量:20 μL;用高效液相色谱 法 测 定 ,以 甲醇 - 0.2%磷酸(52∶48,V/V)为流动相,在 360 nm 处 进 行 测 定 [7],以 槲 皮 素 的 塔 板 理 论 数 不 少 于 2 500, 测定总黄酮的含量。
0 0
0.1
Hale Waihona Puke 0.20.3 0.4
浓 度 (ρ/μg·mL-1)
图 2 山柰素标准曲线
峰 面 积 (A)
峰 面 积 (A)
1000000 800000 600000 400000 200000
0 0
0.1
0.2
0.3
0.4
浓 度 (ρ/μg·mL-1)
图 3 异鼠李素标准曲线
2.5 精密度考察 取同一浓度的标准品溶液,连续 6 次进样,测定含量,计算槲皮素、山柰素、异鼠李素 的精密度 RSD 分别为 1.71%,2.50%,1.70%。 结果显 示精密度良好。 2.6 稳定性考察 取同一浓度的供试品溶液,在 0, 2,4,6,8,10 h 下分别进样测定,结果测定的峰面积 基本不变,槲皮素、山柰素、异鼠李素的 RSD 分别为 1.61%,1.88%,2.38%,表 明 供 试 品 溶 液 至 少 在 10 h 内稳定。 2.7 重现性考察 取 6 份供试品溶液,分别测定含 量,得槲皮素、山柰素、异鼠李素的 RSD 分别为 1.7%,
计法,系统考察料液比、乙醇浓度、提取次数和提取时间 4 个因素对银杏叶总黄酮提取工艺的影响,并用高效液相
法 (HPLC)测定银杏叶总黄酮的含量。 结果:以乙醇浓度 80%,料液比 1∶50,提取 1 次,每次提取 1 h 为最佳提取条件。
结论:该方法操作简便,结果准确可靠,成本低,毒性小,适用于工业化生产。
K2 0.939 1.029 1.011 0.975
K3 1.146 0.951 0.975 1.008
k1 0.306 0.341 0.339 0.340
k2 0.313 0.343 0.337 0.325
k3 0.382 0.317 0.325 0.336
R 0.076 0.024 0.014 0.015
[收稿日期] 2011- 12- 22
[基金项目] 济南市科技局高校院所自主创新计划项目(编号: 201004032)
[通 讯 作 者 ] 李 峰 (1957- ),男 ,山 东 安 丘 人 ,教 授 ,博 士 研 究 生 导 师,研究方向:中药质量控制研究,E- mail:ly0123@hotmail.com。
由 表 2 可 看 出 ,K1、K2、K3 表 示 各 个 因 素 分 别 取 3 个 水 平 时 相 应 的 试 验 结 果 之 和 ;k1、k2、k3 为 K1、K2、K3 的算术平均值;极差 R 是 k1、k2、k3 中最 大值与最小值之差,它反映了研究中各因素影响的 大小。 它们的大小顺序反映出相关因素分别取三个 水平时提取率的高低。 3.2 试 验 影 响 因 子 比 较 分 析 为 了 比 较 正 交 试 验 中 4 个试验因素对试验结果的影响,确定哪些或哪 个因素对研究提取结果的影响最显著或比较显著 的,进行方差分析,从而找出最佳研究条件。 结果见 表 3。
[关键词] 银杏叶;总黄酮;正交设计;高效液相色谱法
[中图分类号] R284.2
[文献标识码] A
[文章编号] 1007- 659X(2012)05- 0449- 03
银杏叶(Ginkgo biloba L.)为银杏叶科银杏叶属 植物银杏干燥的叶。 其主要成分为银杏酸、银杏内 酯 和 黄 酮 类 等 化 合 物 ,其 中 总 黄 酮 的 含 量 最 高 [1-3]。 银杏叶中黄酮类化合物具有保护血管、防止动脉硬 化、扩张毛细血管、活化大脑等功能,用于治疗心绞 痛、冠心病、高血压、支气管等疾病。 此外,在食品工 业上也应用广泛,可用作抗氧化剂、天然添加剂和功 能性食品的原料。 其提取方法常见报道,本实验经 参 考 相 关 文 献 [4-6],采 用 乙 醇 为 溶 剂 ,通 过 正 交 设 计 方法,考察提取物中总黄酮的含量,以确定银杏叶的 最佳提取工艺,为含有银杏叶提取物的饲料添加剂 建立相应质量标准提供可靠依据。 1 仪器与试剂 1.1 仪器 旋转蒸发器 RE- 52AA,SHZ- D(Ⅲ)循环 水式真空泵,电子天平 FA2004,电热恒温水浴锅,超 声 波 清 洗 器 KQ2200 , 减 压 干 燥 器 ,HSⅢ- 日 立 L- 2000 高效液相色谱仪,抽滤装置,万能粉碎机等。 1.2 试剂 银杏叶,槲皮素、山柰素、异鼠李素标准 品(中国食品药品检定研究院),无水乙醇(分析纯)、 甲醇(色谱纯、分析纯),磷酸水溶液,纯净水。 2 研究方法 2.1 研究因素及方案 参考相关文献研究结果,确 定了影响总黄酮提取率的 4 个考察因素,分别为溶 剂浓度 A、料液比 B、提取时间 C、提取次数 D,正 交试验考察因素见表 1。 考虑各种影响因素,选择 L9(34)的正交试验方案。 2.2 色 谱 及 检 测 条 件 色 谱 柱 :Agilent ZORBAX SB- C18;(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇 - 0.2% 磷 酸 (52/48,V/V); 流 速 :1.0 mL·min-1; 检 测 波 长 :
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2012 年 9 月
山东中医药大学学报
第 36 卷第 5 期
素 回 归 方 程 为 A=3×106C- 98967(r=0.9993);异 鼠 李素回归方程为 A=2×106C- 52648(r=0.9996)。 在 0.06~0.36 mg 范围内,槲皮素、山柰素、异鼠李素的 线性关系良好。 见图 1~3。
1.86%,2.13%。 结果表明重现性较好。 2.8 加 样 回 收 率 考 察 精 密 称 取 同 一 已 知 含 量 的 样品 6 份,分别加入适量槲皮素、山柰素、异鼠李素 标准物,依法测定,计算回收率。 分别得平均回收率 为 97.3% ,RSD=1.07% ;98.1% ,RSD=1.13% ;96.8% , RSD= 1.21%。 3 结果与分析 3.1 研 究 结 果 分 析 按 照 正 交 试 验 方 案 对 总 黄 酮 提取条件进行了研究,结果见表 2。
表 4 稳定性考察结果
总 黄 酮 含 量 (m/mg)
平 均 含 量 (m/mg)
1.5464
1.5165
1.5177
1.4903
4 讨论 以银杏叶总黄酮提取液在 360 nm 波长处的峰
面积为参考指标,通过总黄酮提取工艺的正交试验
研究,确定了从银杏叶 中 提 取 总 黄 酮 的 最 佳 条 件 为 : 乙 醇 浓 度 80%, 料 液 比 1∶50, 提 取 1 次 , 每 次 提 取 1 h。 通过稳定性考察,确定总黄酮至少在 24 h 内是 稳定的。 该提取方法操作简便,对环境无污染,提取 成本较低,结果准确可靠,适宜于工业化生产,为进 一步研究银杏叶中总黄酮提取工艺提供了理论依 据。 银杏叶含有丰富的黄酮,具有广泛开发和利用 价值,值得综合利用,应该加强对其资源的开发。
450
2012 年 9 月
王心等:银杏叶总黄酮提取工艺研究
第 36 卷第 5 期
表 3 正交试验方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F 值 F 临界值 显著性
溶剂浓度 0.043
2 48.60 4.460 P< 0.05
料液比
0.029
2 34.00 4.460 P< 0.05
提取时间 0.005
2
2.00 4.460
提取次数 0.016
2 16.00 4.460
误差
0.002
2
80%乙醇 500 mL 加热回流提取 1 次,每次 1 h;过滤。 滤液浓缩,回收乙醇至无醇味,减压干燥,即得银杏 叶提取物。 按 2.3.2 中供试品的制备方法制得供试 品溶液,并进行检测。 数据见表 4。
试验号 1 2 3
表 2 正 交 试 验 设 计 及 试 验 结 果 分 析 L9(34)
试验号 A
B
C
D
总黄酮含量 (m/mg)
1
1
1
1
1
0.320
2
1
2
2
2
0.329
3
1
3
3
3
0.359
4
2
1
3
3
0.305
5
2
2
2
1
0.384
6
2
3
1
2
0.286
7
3
1
2
3
0.403
8
3
2
3
1
0.310
9
3
3
1
2
0.306
K1 0.918 1.023 1.017 1.02
[4] 韩桂荣,刘秀英. 银杏叶总黄酮提取研究[J]. 中国药理学通报, 2008,4(2):23- 25.
由表 3 方差分析可知,各因素影响的顺序为:A (溶剂浓度)> B(料液比)> D(提取次数)> C(提取时 间 ),即 乙 醇 的 浓 度 对 提 取 率 的 影 响 最 大 , 提 取 时 间 影响最小。 以乙醇浓度 80%,料液比 1∶50,提取 1 次, 每次提取 1 h 的组合为最佳。 3.3 研 究 结 果 的 稳 定 性 验 证 将 采 摘 的 新 鲜 银 杏 叶自然晾干,粉碎后过 40 目筛。 取银杏叶粉末 10 g 置 于 1 000 mL 圆 底 烧 瓶 中 ,按 最 佳 提 取 条 件 加 入
[参考文献]
[1] 陈登丰,李烈辉,罗茂玉. 正交设计法优选银杏叶 黄 酮 类 化 合 物 提取工艺的研究[J]. 中国当代医药,2010,17(16):134- 135.
[2] 朱平华. 银杏叶总黄酮类化合物的提取工艺研究[J]. 化工生产 与技术,2006,13 (6):25- 27.
[3] 张 喜 梅 ,李 琳 ,陈 玲 ,等. 葛 根 总 黄 酮 提 取 工 艺 研 究 [J]. 现 代 食 品科技,2008(1):42- 45.
峰 面 积 (A)
1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000
0
0
0.1
0.2
0.3 0.4
浓 度 (ρ/μg·mL-1)
图 1 槲皮素标准曲线
1600000 1400000 1200000 1000000
800000 600000 400000 200000
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