侧柏叶总黄酮提取物质量标准研究

侧柏叶总黄酮提取物质量标准研究
王莲萍;张莲珠;李庆杰;袁媛;赵全成
【摘要】[Objective] To establish the quality control standards for CACUMEN PLATYCLADI flavone. [Method] The total flavone contentrnin CACUMEN PLATYCLADI and the content of biflavone in Amentotaxus argotaenia were determined with UV and HPLC. [ Result] The linearrnrelationship of quercetin was good when quercetin was at the range of 0. 002 08 -0. 020 8 mg/ml (r = 0. 999 3) , the average recovery wasrn98. 00% and RSD was 1.98% (n =6). The linear relationship of amentoflavone was good when amentoflavone was at the range of 0. 13 -1.rn3 μg (R = 0. 999 7) , the average recovery was 99. 266% and RSD was 1.46% ( n = 6 ). [ Conclusion ] The method is simple and accuraternwith good reproducibility, it can be used for the quality control of CACUMEN PLATYCLADI flavone.%[目的]建立侧柏叶总黄酮的质量控制标准.[方法]分别采用
紫外分光光度法和高效液相色谱法对侧柏叶总黄酮中的总黄酮含量及穗花杉双黄酮的含量进行测定.[结果]在0.00208～0.020 8 mg/ml范围内槲皮苷浓度与吸光度
具有良好的线性关系,R=0.9993,平均加样回收率为98.00％,RSD为1.98％(n=6);
在0.13 ～1.3 μg范围内穗花杉双黄酮浓度与吸光度具有良好的线性关
系,R=0.9997,平均加样回收率为99.266％,RSD为1.46％(n=6);[结论]该方法简便、精确、重现性好,可作为该制剂的质量控制标准.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2012(040)024
【总页数】3页(P11996-11997,12010)
【关键词】侧柏叶总黄酮;质量标准;UV;HPLC
【作者】王莲萍;张莲珠;李庆杰;袁媛;赵全成
【作者单位】吉林农业大学中药材学院,吉林长春130118;长春中医药大学附属医院,吉林长春1301171;长春中医药大学附属医院,吉林长春1301171;吉大白求恩制药厂,吉林长春130012;吉林农业大学中药材学院,吉林长春130118
【正文语种】中文
【中图分类】S132
侧柏叶(CACUMEN PLATYCLADI)为柏科(Cupressaceae)植物侧柏(Platycladus orientalis(L.)Franco)的干燥枝梢及叶［1］。

其性味苦涩、性寒，具有凉血止血、镇咳、平喘和杀菌等作用［2］。

其中的黄酮类成分被认为是侧柏叶的主要有效成分之一。

目前侧柏叶总黄酮提取物在医药品、保健用品和保健食品领域中的应用广泛。

最近研究证实，侧柏叶总黄酮具有α-糖苷酶抑制剂作用，是很有前途的Ⅱ型糖尿病降糖新药。

前期试验对侧柏叶中总黄酮进行提取纯化工艺研究，并确定了“侧柏黄酮”的提取工艺。

笔者主要对“侧柏黄酮”质量标准进行研究，以期为侧柏叶的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。

侧柏叶，购自长春市宏检药材公司。

1.1.2 主要仪器。

UV-1701紫外可见分光光度计和SHIMADZU 2010高效液相色谱仪，均购自日本岛津公司。

1.1.3 主要试剂。

槲皮苷对照品，购自中国生物制品检定所;甲醇为色谱纯，购自美国Fisher公司;水为纯净水，购自杭州娃哈哈集团有限公司;穗花杉双黄酮对照品，自制，面积归一化法计算其纯度为99.64%，批号20080701;其他试剂为分析纯，购自北京化工厂。

1.2 方法
1.2.1 总黄酮的含量测定。

1.2.1.1 对照品溶液的制备。

取槲皮苷对照品，精密称定，加无水甲醇制成浓度为
0.1 mg/ml的对照品溶液。

1.2.1.2 供试品溶液的制备。

称取侧柏叶总黄酮50 mg，至50 ml量瓶中，加无水甲醇溶解，定溶至刻度，摇匀滤过，取续滤液即得。

1.2.1.3 检测波长的选择。

槲皮苷对照品溶液经显色后，进行紫外扫描，在200～400 nm进行紫外扫描，选择最佳测定波长。

1.2.1.4 方法学考察。

①线性关系的考察。

分别吸取不同浓度的槲皮苷对照品溶液，显色后，在428 nm波长处测定吸光度，以吸光度对质量浓度进行线性回归，计
算回归方程。

②精密度的考察。

取样品溶液显色后连续进行7次测定，记录吸光
度值，以吸光度值计算RSD。

③稳定性的考察。

取样品溶液显色后，分别于0、10、20和30 min处测定，记录吸收值，计算其RSD。

④重现性考察。

对同1批样品，独立进行6次测定，计算其RSD。

⑤回收率试验。

取已知含量样品6份，
加入对照品适量，计算其平均回收率和RSD。

1.2.1.5 样品的含量测定。

精密量取对照品溶液及供试品溶液各1 ml，分别放入
10 ml容量瓶中，加入1 ml浓度10%的三氯化铝甲醇溶液，用无水甲醇定容至刻度，摇匀后于428 nm波长下测定吸光度，并计算含量。

1.2.2 穗花杉双黄酮含量测定。

1.2.2.1 色谱条件。

色谱柱为Agela C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相为无
水甲醇－水(60∶40，V/V);流速为 1.0 ml/min;检测波长为330 nm;柱温为30℃;进样量为10 μl。

1.2.2.2 对照品溶液制备。

取穗花杉双黄酮对照品，精密称定，加无水甲醇制成浓
度为0.5 mg/ml的对照品溶液，取1 ml置10 ml容量瓶中加无水甲醇定溶至刻度，得浓度为0.05 mg/ml的对照品溶液。

1.2.2.3 供试品溶液的制备。

取40 mg侧柏叶总黄酮，置50 ml容量瓶中，加无
水甲醇适量，超声处理10 min，并用无水甲醇定容至刻度，摇匀，再吸取1 ml
置10 ml容量瓶中，加无水甲醇定溶至刻度，摇匀滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.2.2.4 方法学考察。

①专属性考察。

取溶剂甲醇作为阴性对照溶液，在以上条件下，分别进样穗花杉双黄酮对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，进行专属性试验。

②线性关系的考察。

分别吸取浓度为0.5 mg/ml的对照品溶液各2.5、2.0、1.5 和1.0 ml，分别置 10 ml量瓶中，加无水甲醇至刻度，依次得到A、B、C和D，从D中吸取5 ml至10 ml量瓶，加无水甲醇定溶得E，再从E中吸取5 ml
至10 ml量瓶，加无水甲醇定溶得F，吸取上述对照品溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪测定，记录色谱图，测定其峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，穗花杉双黄
酮进样量为横坐标(X)，绘制标准曲线，并计算回归方程。

③重复性考察。

对同1
批样品照供试品制备方法操作，独立进行6次测定，计算RSD。

④精密度的考察。

取样品40 mg，按供试品制备方法，分别于0、2、4、8、12、24和48 h依法
测定，记录峰面积，计算RSD。

⑤回收率试验。

取同1批样品6份，每份20 mg，置50 ml容量瓶中，精密加入浓度为1.001 mg/ml的穗花杉双黄酮对照品溶液
10 ml，按按供试品制备方法操作，得供试品溶液，测定，计算其平均回收率和RSD。

1.2.3 含量测定。

对3批样品中总黄酮含量和穗花杉双黄酮含量进行测定。

2 结果与分析
2.1 总黄酮的含量测定
2.1.1 测定波长的选择。

计算得在波长428 nm为有最大吸收，故选择该波长进行测定。

2.1.2 方法学考察。

①线性关系的考察。

计算得回归方程为 Y=62.25X+0.018
6(R=0.999 3)。

试验结果表明，在0.002 08～0.020 8 mg/ml范围内槲皮苷浓度与吸光度的线性关系良好。

②精密度的考察。

计算得吸光度的RSD为0.85%，表明该法重复性良好，方法稳定、可行。

③稳定性的考察。

计算得吸收值的RSD为0.73%，表明在30 min内，供试品溶液稳定性良好。

④重现性考察。

计算得吸收值的RSD为1.69%，表明方法重现性良好。

⑤回收率试验。

计算得平均回收率为98.00%，RSD为1.98%，表明该方法准确可靠，可用于侧柏叶中总黄酮的含量测定。

2.1.3 含量测定。

由表1可知，3批样品的总黄酮的平均含量为 65.67%。

2.2 穗花杉双黄酮含量测定
2.2.1 方法学考察。

①专属性考察。

图1～3表明，在此条件下，穗花杉双黄酮峰
分离良好，阴性对照液在相应位置无干扰。

②线性关系的考察。

计算得回归方程为:Y=4 000 000X－16 844，R=0.999 7。

试验结果表明，在 0.13～1.3 μg/ml
范围内，穗花杉双黄酮浓度与峰面积呈良好的线性关系。

③重复性考察。

计算得RSD为1.37%，表明方法重现性良好。

④精密度的考察。

计算得RSD为0.44%，表明在48 h内，供试品溶液稳定性良好。

⑤回收率试验。

计算得平均回收率为99.266%，RSD为1.48%，表明该方法准确可靠，可用于侧柏叶中穗花杉双黄酮
的含量测定。

图1 穗花杉双黄酮对照品溶液的HPLC色谱图
图2 供试品溶液的HPLC色谱图
图3 阴性对照溶液的HPLC色谱图
2.2.3 含量测定。

由表1可知，3批样品的穗花杉双黄酮150.967 mg/g。

表1 样品含量测定批号总黄酮含量∥% 穗花杉双黄酮含量∥mg/g 20110901 64.5 152.4 20110902 63.9 149.7 20111001 66.8 150.8
3 讨论
目前侧柏叶黄酮被应用于药品、保健品以及日化等许多方面，对其提取工艺和质量标准等方面的研究也有很多，但大多以槲皮苷和芦丁为测定指标［3］。

槲皮苷是侧柏叶黄酮中重要的组成部分，以其作为测定指标是比较合理的。

侧柏叶中含有一定量的双黄酮成分，穗花杉双黄酮是其代表成分［4－5］，具有很强的生物活性［6－7］，所以可以讲其作为侧柏叶黄酮提取物的质量判定指标之一。

参考文献
［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:第一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.
［2］徐振文，鲍世兰，赵娟娟，等.侧柏叶止血成分的研究［J］.国中药杂志，1983，8(2):30 －32.
［3］丁航，梁统，周克元，等.高效液相色谱法及紫外可见分光光度法测定侧柏叶中黄酮含量的比较［J］.广东医学院学报，2002，20(6):422－423.
［4］江苏新医学院.中药大辞典:下册［K］.上海:上海人民出版社，1975:1375。

［5］单鸣秋，钱雯，高静，等.UPLC-MS分析侧柏叶中黄酮类化合物［J］.中国中药杂志，2011，36(12):1626 －1629.
［6］郑晓坷，魏悦，冯卫生，等.穗花杉双黄酮体外降糖活性研究［C］//王继峰.中医药生物化学与分子生物学通讯.郑州:［出版者不详］，2008:178－182. ［7］许兰，尹明浩.卷柏穗花杉双黄酮的舒张血管作用实验研究［J］.延边大学医
学学报，2009，32(4):246－248.。