基于酶吸附-催化耦合技术的低聚木糖制备研究

基于酶吸附－催化耦合技术的低聚木糖制备研究

顾峰源，蒋倩倩，姚自选，潘　艳，常思源

（南京科技职业学院，江苏南京　２１００４８）

摘　要：利用酶吸附－催化耦合技术酶法生产低聚木糖，优化了融合酶吸附及水解玉米芯固体残渣的条件。结果表明：融合蛋白吸附玉米芯固体残渣最佳条件为底物浓度５％，ｐＨ值７．０，温度２０℃，吸附时间３０ｍｉｎ。在最佳条件下融合蛋白的吸附率达９０．３％。酶解最佳条件为ｐＨ值７．０，温度５０℃，反应时间２４ｈ，低聚木糖得率４７．７％，平均聚合度２．３。ＴＬＣ分析结果表明：酶解液中含有木二糖、木三糖、木四糖、木五糖。ＨＰＬＣ定量结果表明酶解产物中木二糖和木三糖的含量分别为４５．２％和３６．７％。

关键词：低聚木糖；酶吸附－催化耦合；融合蛋白；条件优化

中图分类号：ＴＱ９１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００３－３４６７（２０２０）１０－００１０－０５

ＳｔｕｄｙｏｎＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＸｙｌｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓＢａｓｅｄｏｎＥｎｚｙｍｅ

ＡｄｓｏｒｐｔｉｏｎＣａｔａｌｙｓｉｓＣｏｕｐｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ＧＵＦｅｎｇｙｕａｎ，ＪＩＡＮＧＱｉａｎｑｉａｎ，ＹＡＯＺｉｘｕａｎ，ＰＡＮＹａｎ，ＣＨＡＮＧＳｉｙｕａｎ

（ＮａｎｊｉｎｇＰｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００４８，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｘｙｌｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｅｎｚｙｍｅａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｃａｔａｌｙｔｉｃｃｏｕｐｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅｃｏｎ ｄｉｔｉｏｎｓｏｆａｄｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｃｏｒｎｃｏｂｓｏｌｉｄｒｅｓｉｄｕｅｂｙｆｕｓｉｏｎｅｎｚｙｍｅａｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｃｏｒｎｃｏｂｓｏｌｉｄｒｅｓｉｄｕｅｂｙｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎａｒｅ５％ｏｆｓｕｂｓｔｒａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａ ｔｉｏｎ，７．０ｏｆｐＨｖａｌｕｅ，２０℃ｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，３０ｍｉｎｏｆａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｔｉｍｅ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｒｅａｃｈｅｓ９０．３％．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｉｓ７．０ｏｆｐＨｖａｌｕｅ，５０℃ｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，２４ｈｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｘｙｌｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｓ４７．７％，ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｄｅｇｒｅｅｏｆｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｉｓ２．３．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＴＬＣａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓｌｉｑｕｉｄｃｏｎ ｔａｉｎｓｘｙｌｏｂｉｏｓｅ，ｘｙｌｏｔｒｉｏｓｅ，ｘｙｌｏｔｅｔｒａｏｓｅ，ｘｙｌｐｅｎｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．ＴｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＨＰＬＣｓｈｏｗｓｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｘｙｌｏｂｉｏｓｅａｎｄｘｙｌｏｔｒｉｏｓｅａｒｅ４５．２％ａｎｄ３６．７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｘｙｌｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｅｎｚｙｍｅａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ－ｃａｔａｌｙｔｉｃｃｏｕｐｌｉｎｇ；ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

低聚木糖是由２～７个木糖分子以β－１，４糖苷键结合而形成的功能性低聚糖，是目前所有功能低聚糖中性能最稳定、功能性最强、摄入量最少的益菌因子，其甜味纯正，增值双歧杆菌的功效是其他功能性寡糖类２０倍以上。同时，难以被人体消化吸收，能量值几乎为零。因此，低聚木糖在食品、医药和饲料等领域有着广阔的应用前景［１－２］。

玉米芯中木聚糖含量高达３５％～４０％，是制备低聚木糖的首选原料。目前，低聚木糖的工业化生产基本是采用木聚糖酶酶解玉米芯的方法。木聚糖酶的发酵生产过程中，产生了大量的杂质且组分复杂，所以在低聚木糖制品生产过程中，酶的纯化和产品的精制是下游产品分离必不可少的步骤，这将会大大增加低聚木糖的生产成本。因此，简化木聚糖酶纯化以及产品精制的步骤是降低生产成本的有效手段。

收稿日期：２０２０－０６－１８

基金项目：２０１８年江苏省大学生创业训练计划（２０１８１２９２００１２Ｙ）；南京科技职业学院校级人文课题（ＮＪＰＩ－２０２０－ＳＺＹＢ－１１）；南京科技职业学院校级科研课题（ＮＨＫＹ－２０１９－１８）

作者简介：顾峰源（１９９９－），男，大专在读，研究方向为生物产品分离提取；联系人：常思源（１９８５－），男，讲师，研究方向为生物产品分离提取，电话：１８８５１６１０３３０。

酶吸附－催化耦合技术是近年来针对不溶性底物的酶催化反应发展起来的一种新思路，即利用底物在酶发酵液中特异性的吸附目标酶，而后进行酶催化反应。该耦合过程能有效降低目标酶的分离成本，易于产物有效分离，甚至能一步获得高纯度的产品，从而显著降低产品的生产成本。ＺＨＡＮＧ等［３］将吸附－催化耦合技术用于Ｎ－乙酰氨基葡萄糖的生产，酶解壳聚糖的产率近１００％，Ｎ－乙酰氨基葡萄糖产品纯度高达９８％。然而，用于低聚木糖生产的木聚糖酶通常来自Ｇ１１家族，由于缺少底物结合域，Ｇ１１家族木聚糖酶难以紧密地吸附于底物木聚糖上。来自枯草芽孢杆菌的扩张蛋白（Ｅｘｐａｎｓｉｎ）与植物的扩张蛋白高度同源，不仅能够松散木质纤维素的天然结构，还能够紧密地吸附于木质纤维素［４］。因此，在前期工作中，构建了扩张蛋白－木聚糖酶的融合蛋白（ＥＸＬＸ：ＸＹＮ）［５］。本研究对融合蛋白吸附和酶解玉米芯的条件进行优化，以期对吸附－酶解耦合制备低聚木糖提供参考依据。

１　材料与方法

１．１　材料和仪器设备

融合蛋白生产工程大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１）为本实验室前期构建所得。木糖（Ｘ１）、木二糖（Ｘ２）、木三糖（Ｘ３）、木四糖（Ｘ４）以及木五糖（Ｘ５）购自Ｓｉｇｍａ公司。

恒温培养箱（ＢｉｏｌｏｇＭｉｃｒｏｓｔａｔｉｏｎ，ｓｙｓｔｅｍ４．２）、紫外分光光度计（ＵＮＩＣＯ，ＵＶ－２１０１Ｃ）、高速离心机（ＨＩＴＡＣＨＩ，ＣＲ２１Ｇ）、压力蒸汽灭菌锅（ＨＩＲＡＹＡ ＭＡ，ＨＶＥ－５０）、高效液相色谱（ＨＰＬＣ，ＤＩＯＮＥＸ，Ｕｌ ｔｉＭａｔｅ３０００）。

１．２　酶液制备

摇瓶ＬＢ培养基：胰蛋白胨１０ｇ／Ｌ、酵母粉５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ，初始ｐＨ值７．０。固体培养基再加入２０ｇ／Ｌ的琼脂。温度１２１℃灭菌３０ｍｉｎ。从抗性平板挑菌接种至１０ｍＬ液体培养基，温度３７℃，１８０ｒ／ｍｉｎ培养过夜。然后按２％的接种量转接至４０ｍＬ的三角瓶中。培养２ｈ后加入诱导剂４０μＬ，１００ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ。３０℃诱导８ｈ后，菌液离心去上清，加等体积缓冲（ｐＨ值＝６．５）重悬。重悬菌体经超声破碎后离心，破碎上清液即为粗酶液，４℃保存。酶活力测定：酶活力单位为每分钟由底物产１μｍｏｌ还原糖所需的酶量定义为一个活力单位（Ｕ）［６］。１．３　融合蛋白对玉米芯固体残渣吸附

玉米芯预处理参照ＡａｃｈａｒｙａｎｄＰｒａｐｕｌｌａ的碱预处理方法［７］。融合蛋白吸附反应为２０ｍＬ体系，包含２０００Ｕ的重组融合蛋白破碎上清粗酶液和适量的玉米芯于缓冲液中搅拌吸附。对吸附过程四个重要参数进行优化，优化参数为不同玉米芯浓度（１％、２％、５％、１０％和２０％），ｐＨ值（５．０、６．０、７．０、８．０和９．０），温度（４、２０、３０、４０、５０℃），时间（３０、６０、１２０、１８０、２４０ｍｉｎ）。吸附性能通过比较吸附反应前后上清液中木聚糖酶活力，蛋白浓度和还原糖量的变化。聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）表征融合蛋白对玉米芯的吸附效率。

１．４　吸附融合蛋白的玉米芯直接酶解工艺研究吸附有融合蛋白的玉米芯进行直接酶解。对ｐＨ值（５．０、６．０、７．０、８．０和９．０），温度（３０、４０、５０、６０℃），时间（１２、２４、３６、４８、６０ｈ）等酶解条件进行优化。酶解结束后立即煮沸１０ｍｉｎ终止反应，４５００ｇ离心３０ｍｉｎ，上清液即为酶解液。测定酶解液中总糖含量和还原糖含量，分析低聚木糖得率和平均聚合度（ＤＰ）。通过薄层层析（ＴＬＣ）和高效液相色谱（ＨＰＬＣ）对酶解液中低聚木糖组成和含量进行分析。

１．５　分析方法

１．５．１　蛋白质浓度测定

蛋白质含量的测定参照Ｂｒａｄｆｏｒｄ法，以牛血清白蛋白（ＢＳＡ）为标准蛋白绘制蛋白质浓度标准曲线。

１．５．２　还原糖含量测定

３，５－二硝基水杨酸法（ＤＮＳ）测定酶解产物中的还原糖含量。

１．５．３　总糖含量测定

取１０ｍＬ酶解液，加入１０ｍＬ体积分数８％的硫酸，混匀后煮沸２ｈ，待冷却至室温后用质量分数２０％的ＮａＯＨ中和至ｐＨ值为７．０，定容至５０ｍＬ后用滤纸过滤，再用ＤＮＳ法测定滤液中的还原糖含量。

１．５．４　薄层层析条件

ＴＬＣ所用展层剂为正丁醇∶乙酸∶水以３∶２∶１（体积比）混合，室温下展层两次，显色剂为浓硫酸与乙醇以体积比１∶９混合，显色温度为１２０℃，时间５ｍｉｎ。

１．５．５　ＨＰＬＣ色谱条件

ＨＰＬＣ分析检测所用色谱柱为ＫｒｏｍａｓｉｌＮＨ

２

柱