绘制双倒数曲线
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生物化来自实验碱性磷酸酶Km值的测定
一、实验内容 二、实验报告要求
实验目的
1、掌握底物浓度对酶促反应速度的 影响
2、掌握米曼氏方程、Km值的意义及 双倒数作图求Km的方法。
一、实验内容
（一）实验原理 （二）实验操作
（一）实验原理
（磷酸苯二钠法 ）
O AKP
P ONa + H2O
O OH + HO P
管号
A510值
1
23
4567
8
空白 调零
【注意事项】
1、底物、血清取量务必准确。 2、 保温时间务必准确。 3、绘制双倒数曲线时，一定要过
原点
（二）721分光光度计的使用 （三）常规仪器的使用
2、数据结果计算
底物浓度(mmol／L) 3
4
5
6
8
12
16
0
1／[S]
1／v
（1／A510）
0.33 0.25 0.20 0.16 0.12 0.08 0.06
0.5mol／L NaOH（碱液）
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
1.0
4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
铁氰化钾
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
混匀，室温放置10min左右，以8号管空白调零，于510nm比色，记录 各管的吸光度。
①直线形状 ；②计算Km值
二、实验报告要求
（一）实验名称 （二）实验原理 （三）实验操作表、OD值纪录 （四）结果处理：作图
1、绘制矩形双曲线坐标图 2、绘制双倒数曲线坐标图、并求出Km值
ONa
ONa
ONa
磷酸苯二钠
苯酚
磷酸磷氢酸二钠
C6H5
C6H5
N
OH + H3C C
CO
K3Fe(CN )6
N H3C N C O
H3C C C NH2 碱性条件
H3C C C N
O
苯酚
4 －氨基安替比林
醌衍生物（红色化合物）
根据红色深浅就可测出醌衍生物的含量，从而反 映酶浓度一定时，底物浓度对酶的饱和效应 。
Vmax[S] V = Km+[S]
两边同取倒数
1/V=
Km Vmax
1/[S] + 1/Vmax
（林－贝氏方程）
（二）实验操作
1．取8支大试管，编号，按下表依次加入：
管号 试剂（ml）
1
2
3
4
5
6
7
8
0.04mol／L底物液
0.15 0.20 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00
3
0
0
7
5
3
3
-
-
3、作图要求：
（1）绘制矩形双曲线：
OD
纵轴 等距离吸光度标
（V）
识
横轴
等距离底物浓度 标识
曲线 各管吸光度连线
观察 曲线形状
[S]
（2）绘制双倒数曲线：
横轴
等距离底物浓度的倒数（1／[s] ）
纵轴（1/V）
等距离吸光度的倒数（1／A510）标 识
曲线
各管吸光度的倒数标识
观察
底物浓度对反应速度的影响： 呈矩形双曲线
V Vmax
[S]
Km值的推导：
当反应速度为最大反应速度一半时
V Vmax Vmax/2
Km
Vmax 2
＝
Vmax[S] Km + [S]
Km＝[S]
[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半 时的底物浓度，单位是mol/L。
双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称 为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法
0.1mol／L碳酸缓冲液 (pH10)
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
蒸馏水
0.85 0.80 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00
混匀后，37℃水浴，预热5min左右。
酶液
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
每管加入酶液后立即混匀（保持在37℃水浴中），反应开始，从 加入酶液起计时至下一步加入碱性溶液停止反应，各管反应时间准确 一致，为15min。
一、实验内容 二、实验报告要求
实验目的
1、掌握底物浓度对酶促反应速度的 影响
2、掌握米曼氏方程、Km值的意义及 双倒数作图求Km的方法。
一、实验内容
（一）实验原理 （二）实验操作
（一）实验原理
（磷酸苯二钠法 ）
O AKP
P ONa + H2O
O OH + HO P
管号
A510值
1
23
4567
8
空白 调零
【注意事项】
1、底物、血清取量务必准确。 2、 保温时间务必准确。 3、绘制双倒数曲线时，一定要过
原点
（二）721分光光度计的使用 （三）常规仪器的使用
2、数据结果计算
底物浓度(mmol／L) 3
4
5
6
8
12
16
0
1／[S]
1／v
（1／A510）
0.33 0.25 0.20 0.16 0.12 0.08 0.06
0.5mol／L NaOH（碱液）
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
1.0
4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
铁氰化钾
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
混匀，室温放置10min左右，以8号管空白调零，于510nm比色，记录 各管的吸光度。
①直线形状 ；②计算Km值
二、实验报告要求
（一）实验名称 （二）实验原理 （三）实验操作表、OD值纪录 （四）结果处理：作图
1、绘制矩形双曲线坐标图 2、绘制双倒数曲线坐标图、并求出Km值
ONa
ONa
ONa
磷酸苯二钠
苯酚
磷酸磷氢酸二钠
C6H5
C6H5
N
OH + H3C C
CO
K3Fe(CN )6
N H3C N C O
H3C C C NH2 碱性条件
H3C C C N
O
苯酚
4 －氨基安替比林
醌衍生物（红色化合物）
根据红色深浅就可测出醌衍生物的含量，从而反 映酶浓度一定时，底物浓度对酶的饱和效应 。
Vmax[S] V = Km+[S]
两边同取倒数
1/V=
Km Vmax
1/[S] + 1/Vmax
（林－贝氏方程）
（二）实验操作
1．取8支大试管，编号，按下表依次加入：
管号 试剂（ml）
1
2
3
4
5
6
7
8
0.04mol／L底物液
0.15 0.20 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00
3
0
0
7
5
3
3
-
-
3、作图要求：
（1）绘制矩形双曲线：
OD
纵轴 等距离吸光度标
（V）
识
横轴
等距离底物浓度 标识
曲线 各管吸光度连线
观察 曲线形状
[S]
（2）绘制双倒数曲线：
横轴
等距离底物浓度的倒数（1／[s] ）
纵轴（1/V）
等距离吸光度的倒数（1／A510）标 识
曲线
各管吸光度的倒数标识
观察
底物浓度对反应速度的影响： 呈矩形双曲线
V Vmax
[S]
Km值的推导：
当反应速度为最大反应速度一半时
V Vmax Vmax/2
Km
Vmax 2
＝
Vmax[S] Km + [S]
Km＝[S]
[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半 时的底物浓度，单位是mol/L。
双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称 为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法
0.1mol／L碳酸缓冲液 (pH10)
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
蒸馏水
0.85 0.80 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00
混匀后，37℃水浴，预热5min左右。
酶液
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
每管加入酶液后立即混匀（保持在37℃水浴中），反应开始，从 加入酶液起计时至下一步加入碱性溶液停止反应，各管反应时间准确 一致，为15min。