长期施肥对旱地土壤中氨氧化微生物丰度和分布的影响

长期施肥对旱地土壤中氨氧化微生物丰度和分布的影响
辛亮;武传东;曲东
【摘要】采用基于氨单加氧酶基因(amoA)的荧光定量PCR技术,以黄土高原旱地土为材料,研究长期施肥对土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度的影响,并分析环境因素与氨氧化菌丰度的关系.以不施肥土壤为对照(CK),设置3个施肥处理,分别为单施磷肥(P),氮、磷共施(NP)和氮、磷、有机肥共施(NPM)3个处理.结果表明,不同处理氨氧化菌amoA基因拷贝数为1.326×106～1.886×106 g1,各处理间氨氧化细菌丰度差异不显著;氨氧化古菌的arch-amoA基因拷贝数为1.329×106～
4.510×106 g-1,表现为处理NPM＞ NP＞CK＞P,NPM处理为对照的3.314倍,二者呈现显著性差异.采用DCCA法对4个处理进行环境相似度分类,结果显示,P和NPM处理、CK和NP处理分别构成了2个相似类群；4个处理和12个环境因子的关联(CCA)分析表明,不同处理中的氨氧化微生物活跃度以及氨氧化过程强度表现为处理NMP＞NP＞CK＞P;不同环境因子和不同施肥处理生境相似度分布存在不同的关系,其中反映氨氧化过程的硝态氮含量、氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度,以及代表微生物生长主要环境因素的pH值、含水量、全氮和有机碳含量与不同施肥处理导致的生境相似度的分布关系最为紧密.%Real-time PCR with primers targeting Ammonia monooxygenase subunit A gene iamoA) was performed to quantify abundance of ammonia-oxidizing bacteria (AOB) and ammonia-oxidizing ar-chaea (AOA) in dry highland soilt long-term fertilized, from Loess Plateau. We also investigated the relationship between environmental factors and abundance of ammonia-oxidizing organism. The treatments were no fertilizer (CK), phosphate (P), nitrogen/phosphate fertilizers (NP), and NP combined with organic
fertilizer (NPM). We found that fertilization caused no significant difference on the amoA gene copy numbers of AOB arranging from 1, 326× 106 to 1. 886 × 106 copies · g-1 dry soil. In contrast, abundance of arch-amoA gene was determined by different fertilizers, with copy numbers from 1.329×106 to 4. 510× 10s, in an decreasing order as NPM>NP>CK>P, while abundance of arck-amoA gene in NMP was 3. 314 times higher than that of CK, showing significant difference. De-trended canonical correspondence analysis (DCCA) was adopted to class treatments by their environmental similarities, which indicated that P and NPM, CK and NP were presented as two groups respectively; Canonical correspondence analysis (CCA) of 4 treatments and 12 environmental factors verified that the activity of ammonia oxidizer and ammonia oxidation in different fertilizations was or-dered as NPM>NP>CK>P. These findings represent that environmental factors reflecting ammonia oxidation like contend of nitrate nitrogen (NO3--N), abundance of AOA and AOB, and factors related to microbial growth conditions such as pH, moisture, total nitrogen and organic carbon content determined the environmental similarity ordination of the treatments.
【期刊名称】《西北农业学报》
【年(卷),期】2012(021)006
【总页数】6页(P41-46)
【关键词】旱地土壤;施肥;氨氧化菌;丰度;荧光定量PCR
【作者】辛亮;武传东;曲东
【作者单位】西北农林科技大学资源环境学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大
学资源环境学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学资源环境学院,陕西杨凌712100
【正文语种】中文
【中图分类】X172
土壤中的氮素循环主要靠硝化作用完成，氨氧化成羟胺是硝化作用的限速步骤，一直被认为由数量众多的氨氧化细菌（AOB）氨单加氧酶基因（amoA）控制［1］。

作为氨氧化过程的主要驱动者，氨氧化细菌已被作为环境微生物生态学研究的一种模式生物［2］。

随着环境微生物分子生态学技术的发展和研究的深入，发现了另一类具有氨氧化能力的微生物－氨氧化古菌（ammonia－oxidizing archaea，AOA）［3］。

现已证明，AOA 广泛分布于海洋、土壤、温泉和湿地等各种类型
的生态系统中，表明，氨氧化古菌也是环境中最丰富的氨氧化微生物之一［4］。

Leininger等［5］比较了土壤中细菌和古菌的氨单加氧酶基因（amoA）的相对
丰度，发现土壤中硝化古菌可能是细菌的3 000倍，暗示古菌可能在硝化作用中
具有潜在重要作用，并由此促使人们对细菌和古菌在硝化作用中的贡献率以及影响氨氧化菌群落结构和丰度的环境因素等开展了一系列的研究［6－10］。

量化微生物群落的组成，确定微生物类群的丰度，在微生物生态学的许多研究领域都非常必要。

然而许多环境微生物是不可培养的，这给研究带来了一些障碍。

近年来，包括PCR在内的许多分子生物学方法，提供了不依赖于培养的新技术，使人
们对环境微生物群落组成和丰度有了进一步了解。

实时荧光定量PCR技术作为一
种核酸定量的手段，以其高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性等优点，在微生物生态学中逐渐得到广泛应用［11］。

与其他的分子生物学技术联合应用，不仅可以定性，也可以定量研究微生物群落结构组成及数量变化，深入探索微生物群落与环境因子间的相互作用及其动态变化过程。

鉴于目前对于黄土高原地区，长期定位施肥土壤中氨氧化菌群落多样性变化特征的相关研究甚少，笔者于2010年，首次报道了陕西长武长期施肥生态试验站的黄土高原试验区土壤氨氧化细菌群落结构特点［12－13］，并开展氨氧化古菌群落结构和丰度的相关研究［14］。

本试验以长期定位施肥土壤为研究对象，采用基于氨氧化菌氨单加氧酶基因amoA的荧光定量PCR技术，探讨长期施用磷肥以及与氮肥和有机肥配施对氨氧化菌丰度的影响，分析环境因素与土壤氨氧化作用的相关性，为进一步研究黄土高原地区土壤长期施肥过程中，氨氧化菌与土壤硝化作用的关系及其贡献率提供必要的理论基础。

1 材料与方法
1.1 土样采集及处理
土壤样品采自黄土高原农业生态站长期施肥试验区。

该站位于黄土高原中南部陕甘交界处的陕西省长武县，北纬35°12′，东经107°40′，海拔1 200m，属暖温带半湿润大陆性季风气候；年均降水584mm，年均温9.1℃，无霜期171d，地下水埋深50～80m，无灌溉条件，为典型的旱作雨养农业区。

长期施肥始于1984年，土壤属黑垆土，母质是深厚的中壤质马兰黄土，全剖面土质均匀疏松，通透性好。

试验设4个处理：无肥（不施肥种植，CK）、单施磷肥（P）、氮肥＋磷肥（NP）、氮磷肥＋有机肥（NPM）。

各处理肥料施入量为：氮肥（尿素）120kg· hm－2，磷肥（过磷酸钙）60kg·hm－2，有机肥（牛粪）7 500kg·hm－2。

氮、磷和有机肥播前一次性施入，连作冬小麦，田间管理同当地大田。

试验小区面积65m2（10m×6.5m），小区间距0.5m，区组间距1m，采
用完全随机区组排列，3次重复。

土壤样品采集于2009－01－08，采用蛇形布点法采集5～20cm深度的耕层土壤，5～7个点混合成一个土壤样品，剔除沙砾和植物残根等杂物，取1kg土壤样品于4℃保存。

土壤样品理化性质见表1。

1.2 土壤总DNA提取
采用SoilMaster TM DNA Extraction Kit（EPICENTRE Biotechnology）进行土壤微生物总DNA的提取，DNA样品－20℃冰箱保存待用。

1.3 氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度分析
以土壤中氨氧化细菌amoA基因和氨氧化古菌arch－amoA基因的拷贝数分别表示氨氧化细菌和氨氧化古菌的丰度。

利用荧光定量PCR（Real－time PCR）技术检测ampA 和arch－amoA基因拷贝数。

PCR引物和扩增条件见表2，每个样品重复3次。

采用SYBR®Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司）试剂盒于荧光定量PCR仪（CFX96型，Bio－Rad公司）上进行绝对定量PCR分析。

Real－time PCR反应体系为25μL，其中2μL为稀释5倍的DNA模板，23μL为反应液，反
应液包括12.5μL SYBR®Premix Ex TaqTM（2×）、0.5μL ROX ReferenceDyeⅡ（50×）、上下游引物各1μL、8μL超纯水。

分别以含有氨氧化细菌amoA基因和氨氧化古菌arch－amoA 基因的重组
pGEM®－T载体为标准质粒。

计算出标准质粒的拷贝数，按10倍梯度稀释，以10－1～10－8梯度的标准质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，反应程序见表2。

设置阴性对照。

以标准质粒拷贝数的对数值作为纵坐标，不同浓度质粒的Ct值作为横坐标，建立标准曲线。

表1 供试土壤的基本理化性质Table 1 Physical and chemical properties of the soil tested处理Treatments pH含水量／（g·kg－1）Moisture content有机碳／（g·kg－1）Soil organic matter全N／（g·kg－1）Total N全P／（g·kg－
1）Total P全K／（g·kg－1）Total K有效P／（mg·kg－1）Available phosphorus速效K／（mg·kg－1）Available potassium NO3－N／（mg·kg
－1）NH4＋－N／（mg·kg－1）83 8.333 18.84 P 8.35 159.2 5.741 0.758
0.311 21.81 6.511 44.96 4.688 17.08 NP 8.35 162.1 7.047 0.862 0.271 19.95 2.224 36.05 11.55 17.16 NPM 8.34 173.9 10.44 1.213 0.420 21.78 10.59 13 CK 8.37 160.3 5.627 0.789 0.194 20.54 0.311 34.4.9 18.01 17.16
表2 amoA基因和arch－amoA基因的Real－time PCR扩增引物及反应条件Table 2 Primers and Real－time PCR conditions of amoAgene and arch－amoAgene used in the studyPCR condition amoA 基因引物序列［15］Primer sequence of amoAgene项目Item PCR引物和条件反应上游引物为amoA－1F（5′－GGG GTT TCT ACT GGT GGT－3′），下游引物为amoA－2R （5′－CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC－3′［K＝G or T；S＝G or C］）。

amoA 基因的PCR扩增片段为491bp。

arch－amoA 基因引物序列［16］Primer sequence of arch－amoAgene Real－time PCR 反应程序 Thermal profile for real－time PCR上游引物为arch－amoAF（5′－STA ATG GTC TGG CTT AGA CG－3′，［S＝G or C］），下游引物为arch－amoAR（5′－GCG GCC ATC CAT CTG TAT GT－3′）。

arch－amoA 基因的PCR扩增片段为
635bp。

95℃预变性4min，95℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸45s，扩
增40个循环；72℃延伸10min，溶解曲线循环为：65～95℃，每5s升高0.5℃。

1.4 数据处理
采用除趋势典范对应分析（Detrended canonical correspondence analysis，DCCA）对不同处理进行分类。

采用典范对应分析（Canonical correspondence analysis，CCA）不同处理的生境相似度以及与环境因子的关系［17－18］。

DCCA 和CCA排序采用国际通用软件CANOCO4.5完成。

2 结果与分析
2.1 不同处理总DNA提取和氨氧化菌amoA基因PCR扩增
采用SoilMaster TMDNA Extraction Kit法从供试土样中提取土壤微生物总DNA。

由图1可以看出，所获得的DNA条带清晰，没有大量的弥散。

以上述总DNA为模板，分别用amoA－1F／amoA－2R 和arch－amoAF／arch－amoAR 引物对，经PCR扩增得到氨氧化细菌和氨氧化古菌的氨单加氧酶基因amoA和arch
－amoA片段，与预期大小一致，且没有非特异性扩增（图2）。

图1 土壤微生物总DNA的电泳检测Fig.1 Agarose electrophoresis of total soil DNA1.CK；2.P；3.NP；4.NPM；M.DL2000DNA Marker
2.2 不同处理氨氧化菌丰度分析
依据标准曲线，发现用Real－time PCR技术获得的不同处理氨氧化细菌amoA
基因拷贝数为1.326×106～1.886×106 g－1，氨氧化古菌archamoA基因拷贝
数为1.329×106～4.510×106 g－1，结果见图3。

不同处理土壤的氨氧化细菌amoA基因拷贝数变化不大，NPM处理的amoA基因拷贝数高于其他处理，每
克风干土拷贝数为1.886×106个，P和NP处理与CK相近。

与氨氧化细菌不同，氨氧化古菌arch－amoA基因拷贝数在各处理中变化较大，NPM处理最高，每
克风干土拷贝数为4.510×106个，为对照的3.314倍，呈现显著性差异。

不同处理土壤的氨氧化古菌的arch－amoA 基因拷贝数变化趋势为处理NPM＞NP＞CK ＞P。

各个处理的arch－amoA 基因拷贝数与amoA基因拷贝数比值分别为
1.029（CK）、1.002（P）、1.413（NP）和
2.392（NPM）。

2.3 不同处理分类及特征
不同处理的环境相似度分类DCCA排序结果见图4，前2个排序轴的特征值分别
是0.009和0.001。

4个处理没有表现出明显的高度相似类群，但仍可看出，处理P和NPM、处理CK和NP分别构成了相似类群，反映了不同处理所形成的生境
相似度。

2.4 不同处理与环境因子的CCA分析
采用典范对应分析（CCA）对所调查的4个处理和12个环境因子进行关联分析，环境因子包括：pH 值、土壤含水量（MC）、总有机碳含量（TOC）、全氮含量（TN）、全磷含量（TP）、全钾含量（TK）、有效磷含量（AP）、速效钾含量（AK）、硝态氮含量（NO3－N）、铵态氮含量（NH4＋－N）、氨氧化细菌丰
度（AOB）和氨氧化古菌丰度（AOA）。

图2 amoA（A）和arch－amoA（B）PCR片段电泳检测Fig.2 Agarose electrophoresis of PCR fragments of amoA（A）and arch－amoA（B）1.CK；
2.P；
3.NP；
4.NPM；M.DL2000DNA Marker
图3 amoA和arch－amoA基因拷贝数Fig.3 The gene copies of amoAand arch－amoA
图4 不同处理环境DCCA分类Fig.4 Treatment environment DCCA classification
由图5可见，前2个排序轴的特征值分别为0.009和0.002，共同解释了不同施
肥处理分布特征的98.5%。

2个环境排序轴的相关系数为0，表明排序结果可靠，能够较好地反映不同处理分布与环境因子的关系。

与CCA排序图中第1排序轴相关系数较高的是pH值（r＝0.935 6）、全磷含量（r＝－0.955 5）、有效磷含量（r＝－0.961 7）和铵态氮含量（r＝0.836 3），说明，第1排序轴从左至右表示涉及pH值、磷含量和铵态氮含量变化的强度增加；与第2排序轴的相关性较高的是硝态氮含量（r＝－0.904 2）、含水量（r＝－0.743 9）、有机碳含量（r＝－0.728 6）、全氮含量（r＝－0.752 0）、氨氧化细菌丰度（r＝－0.709 5）和氨
氧化古菌丰度（r＝－0.725 4），说明，第2排序轴自下而上基本反映了不同处理所形成生境中氨氧化菌生长活动的强度，其中，含水量、有机碳、全氮构成了微生
物生长的生境条件集合，硝态氮含量、氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度反映了氨氧化过程。

从这一角度可以看出，不同处理中的氨氧化微生物活跃度以及氨氧化过程强度表现为处理NMP＞NP＞CK＞P。

从图5还可以看出，不同环境因子和不同施肥处理生境相似度分布存在不同的关系，其中反映氨氧化过程的硝态氮含量、氨氧化细菌和古菌丰度，以及代表微生物生长主要环境因素的pH值、含水量、全氮和有机碳含量与不同施肥处理导致的生境相似度的分布关系最为紧密。

其余环境因子对不同施肥处理生境相似度的贡献基本相同。

图5 不同施肥处理与环境因子的二维排序Fig.5 Bioplot of CCA ordinations for treatments with different fertilizations and environmental factors
3 讨论
土地不同利用方式和管理制度直接影响土壤微生物的数量和种类［19］。

关于无机氮肥对土壤氨氧化菌群落结构和丰度影响的报道较多，且主要集中在长期施用氮肥导致土壤pH值改变，进而影响氨氧化菌的群落结构和丰度等。

Di等［20］研究表明，高施尿素种植牧草的土壤中存在高丰度氨氧化古菌，氨氧化细菌在高氨环境下生长，而氨氧化古菌在低氨、不利的或贫瘠的环境中占主导地位。

Wang等［21］对中国4种富氮湿地土壤中氨氧化菌的多样性和丰度的研究显示，高铵的表层土壤中氨氧化古菌数量明显低于氨氧化细菌，并且受土壤pH影响较大。

Wertz等［22］认为，施用氮肥没有增加林地土壤氨氧化古菌丰度。

对酸性土壤和碱性土壤做同样的施肥处理，发现在碱性土壤中，只有氨氧化细菌的群落结构发生了变化，而在酸性土壤中只有氨氧化古菌的群落结构发生了变化［7－8］。

对酸性土壤施肥实验中，土壤pH和氨氧化细菌、氨氧化古菌的丰度呈现正相关［7］。

碱性土壤pH变化与氨氧化细菌的丰度存在负相关［8］。

Nicol等［9］的研究表明，随着酸性土壤pH上升，古菌amoA基因和转录丰度降低，而细菌amoA基因丰度降低，但是转录丰度则增加。

本试验的供试土样属于弱碱性的黑
垆土，长期施肥对土壤pH影响不大。

单施磷肥、氮磷共施和氮磷有机肥共施处理的土壤pH分别为8.35、8.35和8.34，与对照的相近，但是，NPM处理的氨氧化古菌丰度明显高于对照，表明，土壤pH不是影响本试验中土壤氨氧化古菌丰度变化的主要原因。

Shen等［8］通过研究河南封丘碱性潮土土壤中氨氧化菌的丰度表明，古菌丰度是细菌丰度的10倍左右，在长期无肥 CK、NP、1／2NPM 和NPM处理中，氨氧化古菌amoA基因拷贝数为1.54×107～4.25×107，而氨氧化细菌变化显著，为1.24×105～2.79×106。

与NP处理相比，1／2NPM和NPM处理中，氨氧化菌丰度变化不显著。

本试验中供试土壤氨氧化古菌和细菌比值为1.002～2.392，古菌丰度比河南封丘碱性潮土低10倍，细菌与其相近。

土壤的氨氧化细菌amoA 基因拷贝数变化不大，而氨氧化古菌丰度变化比较显著，其中，NPM处理的丰度显著增加。

造成上述不同结果的原因，可能是因为，本试验供试土壤的土壤类型为碱性黑垆土，跟封丘潮土土壤类型有差别。

这些结果也表明，决定氨氧化菌丰度的因素除了施肥方式外，土壤类型等因素也可能起决定性作用。

采用不同施肥处理导致了不同生境形成，生境差异在影响微生物栖居上是重要的，从而影响到微生物所参与的生化反应过程，即其生态功能的发挥。

本试验中不同施肥处理的DCCA分类结果反映了通过施肥能够创造不同的生境类群。

施肥处理与环境因子的CCA分析，进一步证实，不同施肥处理中的氨氧化细菌和古菌的活跃度以及氨氧化过程的强度有明显差异。

P处理中的氨氧化菌活跃程度和氨氧化过程强度小于CK处理，显示施加磷肥阻碍了氨氧化过程，很可能是影响到氨氧化细菌和古菌的生长所致。

目前，关于磷肥对氨氧化作用及其影响的报道很少，需要加强此类研究。

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