液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中4种尼泊金酯

液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中4种尼泊金酯
陈祥准;夏碧琪;沈祥茹;程洁;沈燕;韩超
【摘要】采用液相色谱-串联质谱建立了同时测定水产品(羊栖菜、紫菜、带鱼、
黄鱼)中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯4种尼泊金酯的分析
方法.样品用甲醇超声提取,提取液经离心过滤后用MCX固相萃取柱净化,采用Agilent ZOBRAX C18色谱柱(2.1mm×150 mm,5 μm)分离;以0.1％乙酸水溶液-乙腈作为流动相进行梯度洗脱,目标分析物在多反应监测(MRM)模式下进行定性分析,内标法定量.7 min内即可完成4种待测物的分离分析.在优化实验条件下,尼泊
金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯在5.0～100.0 ng·mL-范围内呈良好的线性关系,相关系数均不低于0.999 2,方法定量下限为10.0 μg·kg-1.在低、中、高3个加标水平下的平均回收率为75％～ 96％,相对标准偏差(RSD)不大于7.1％.本方法前处理简单、选择性好、灵敏度高,可用于水产品中尼泊金酯的测定.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2015(034)004
【总页数】5页(P443-447)
【关键词】水产品;尼泊金酯;固相萃取;液相色谱-串联质谱
【作者】陈祥准;夏碧琪;沈祥茹;程洁;沈燕;韩超
【作者单位】温州出入境检验检疫局,浙江温州325027;温州出入境检验检疫局,浙
江温州325027;温州出入境检验检疫局,浙江温州325027;温州出入境检验检疫局,
浙江温州325027;温州大学化学与材料工程学院,浙江温州325035;温州出入境检
验检疫局,浙江温州325027
【正文语种】中文
【中图分类】O657.63;F762.6
液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中4种尼泊金酯
陈祥准
1，夏碧琪
1，沈祥茹
1，程洁
1，沈燕
2，韩超
1*
(1.温州出入境检验检疫局，浙江温州325027; 2.温州大学化学与材料工程学院，浙江温州325035)
摘要:采用液相色谱-串联质谱建立了同时测定水产品(羊栖菜、紫菜、带鱼、黄鱼)中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯4种尼泊金酯的分析方法。

样品用甲醇超声提取，提取液经离心过滤后用MCX固相萃取柱净化，采用Agilent ZOBRAX C
18色谱柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)分离;以0.1％乙酸水溶液-乙腈作为流动相进行梯度洗脱，目标分析物在多反应监测(MRM)模式下进行定性分析，内标法定量。

7 min内即可完成4种待测物的分离分析。

在优化实验条件下，尼
泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯在5.0～100.0 ng·mL
-1范围内呈良好的线性关系，相关系数均不低于0.999 2，方法定量下限为10.0 μg ·kg
-1。

在低、中、高3个加标水平下的平均回收率为75％～96％，相对
标准偏差(RSD)不大于7.1％。

本方法前处理简单、选择性好、灵敏度高，可用于
水产品中尼泊金酯的测定。

关键词:水产品;尼泊金酯;固相萃取;液相色谱-串联质谱
中图分类号:O657.63; F762.6 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2015)04-0443-05
doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2015.04.012
收稿日期:2014-10-09;修回日期:2014-11-25
基金项目:检验检疫行业标准项目(2008B169);温州市科技局科技项目( G2*******，2013G0007);浙江省教育厅科技项目(Y201430915，Y201223773)
*通讯作者:韩超，博士，高级工程师，研究方向:食品质量分析与检测，
Tel**************，E-mail:*****************
Simultaneous Determination of Nipagin Esters in Aquatic Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
CHEN Xiang-zhun
1，XIA Bi-qi
1，SHEN Xiang-ru
1，CHENG Jie
1，SHEN Yan
2，HAN Chao
1*
(1.Wenzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Wenzhou 325027，China; 2.College of Chemistry and Materials Engineering，Wenzhou University，Wenzhou 325035，China)
Abstract:A liquid chromatography-tandem mass spectrometric(LC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of four nipagin esters，including methylparaben，ethylparaben，propylparaben and butylparaben in aquatic products samples(Sargassum fusiforme，porphyra，hairtail，yellow croaker).The samples were extracted by ultraphonic extraction with methanol.Extracting solution was filtered，then cleaned up with MCX solid phase extraction.The analysis was performed on an Agilent ZOBRAX C
18column(2.1 mm×150 mm，5 μm) using a gradient elution program with mobile phase of 0.1％ acetic acid and acetonitrile.The analytes were determined by an electrospray ionization tandem mass spectrometry in multiple reaction monitoring(MRM) mode，and quantified by internal standard method.The results indicated that a good separation
of four compounds was obtained in 7 min.The calibration curves for four nipagin esters were linear in the range of 5.0-100.0 ng·mL
-1with correlation coefficients not less than 0.999 2，and the limits of quantitation(LOQs) were all 10.0 μg·kg
-1.The average recoveries at three spiked levels ranged from 75％-96％ with RSDs not more than 7.1％.This method shows the advantages of simplicity，accuracy and sensitivity，and is suitable for the analysis of four nipagin esters in aquatic product samples.
Key words:aquatic products; nipagin esters; solid phase extraction; liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)
尼泊金酯(Nipagin esters)亦称对羟基苯甲酸酯类，是一类高效食品防腐剂，具有良好的抑制细菌繁殖、防止发酵能力，其抗细菌性能强于苯甲酸和山梨酸
［1-2］。

尼泊金酯类防腐剂低毒，人类长期摄入尼泊金酯，其未被体
内组织酯酶水解成代谢产物对羟基苯甲酸的部分会直接被吸收储存在人体组织中，从而对人类健康造成严重影响
［3］。

研究表明尼泊金酯具有雌激素活性，在乳腺癌的产生过程中扮
演了重要角色
［4-5］。

国家标准GB2760-2011规定了蚝油、虾油、鱼露等产品中
尼泊金甲酯、尼泊金乙酯的最大使用量为0.25 g/kg，未规定水产品中尼泊金酯的最大限量。

目前，尼泊金酯的检测方法有高效液相色谱法
［6-11］、毛细管电泳法
［12］、紫外光谱法
［13］、气相色谱法
［14］、气相色谱-质谱法
［15-16］、液相色谱-质谱法
［17-20］等。

色谱法由于其高效、灵敏得到了广泛应用。

但液相色谱
法和气相色谱法在基质复杂的情况下定性困难，可能造成假阳性结果。

而在液相色谱法和气相色谱法基础上发展起来的液相色谱-串联质谱法和气相色谱-质谱法定性准确，具有更高的选择性和灵敏度。

目前国内外尚未见同时测定水产品中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯4种尼泊金酯含量的报道。

本研究采
用超声波萃取法提取样品，提取液经固相萃取后采用液相色谱-串联质谱法进行分析，建立了同时测定水产品中4种尼泊金酯的分析方法。

本方法采用同位素内标
法定量，灵敏度高，定性定量准确。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司); API 4000三重四极杆质谱仪(美国AB应用生物系统公司); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司);超声波清洗器(Elma P300 H，德国Elma公司)。

甲醇、乙腈均为色谱纯(德国Merck公司);甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵(美国Alfa Aesar公司); MCX SPE强阳离子交换固相萃取
柱(Waters公司，60 mg/3 mL); HLB SPE强阳离子交换固相萃取柱(Waters公司，60 mg/3 mL); ENVI C
18交换柱固相萃取柱(Superclean，60 mg/3 mL);其它试剂均为分析纯。

实验用水产品样品购自附近菜市场。

尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度≥98％;尼泊金丙酯-D7购自Toronto Research Chemicals Inc公司，纯度≥98％，均用甲醇配制成质量浓度
为200 μg·mL
-1的储备液。

使用时，用甲醇稀释上述标准储备液，配制成5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 ng·mL
-1的混合标准工作溶液，其中内标浓度均为20.0 ng·mL
-1。

1.2 色谱-质谱条件
1.2.1 液相色谱条件Agilent ZOBRAX C
18(2.1 mm×150 mm，5 μm);流动相:A为0.1％乙酸水溶液，B为乙腈。

梯度洗脱程序:0～2 min，30％～80％ B; 2～10 min，80％ B;流速:300
μL·min
-1;进样量10 μL，柱温30℃。

1.2.2 质谱条件电喷雾离子源:负离子扫描;离子源温度500℃;电喷雾电压5 000 V;雾化气(GS1)压力344.5 kPa;辅助气压力(GS2)275.6 kPa;气帘气压力68.9 kPa;
碰撞气(CAD)压力137.8 kPa。

监测模式:多反应监测(MRM)，质谱分析参数见表1。

1.3 样品处理与净化
1.3.1 提取称取样品约2 g(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管中，加入0.1 mL同位素内标溶液(1 000 ng·mL
-1)和20 mL甲醇，混匀后，于超声波清洗器中超声提取30 min，提
取温度为30℃，于4 000 r·min
-1离心5 min，过滤并用甲醇定容至25 mL容量瓶中，待净化。

1.3.2 净化从25 mL待净化液中取10 mL提取液，经40℃氮气吹至近干后，先用2 mL的1％乙酸水-甲醇溶液溶解残渣，再加入6 mL水，混匀后使该样液以
小于1 mL·min
-1的流速通过MCX强阳离子固相萃取柱。

样液全部流出后，先用6 mL 1％乙酸水溶液和6 mL 20％甲醇水溶液淋洗，负压抽干，再用4 mL甲醇和
2 mL的2％氨水甲醇依次洗脱，洗脱液在40℃用氮气吹干，以2 mL甲醇溶解残渣，过0.22 μm微孔滤膜后，供LC-MS/MS测定。

表1 化合物的多反应监测质谱参数
Table 1 Optimized MRM parameters for the determination of compounds
* quantitative ion
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化
将标准品配制成200 ng·mL
-1的溶液，通过流动注射泵连续进样，调谐质谱参数。

使用ESI源在正、负离子模式下进行全扫描，以选择适当的定性、定量离子和电离方式。

结果表明:
在ESI源的负离子模式下，尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯和同位素内标呈现出最佳响应，准分子离子［M-H］
-是响应强度最高的离子。

确定母离子后，采用子离子扫描方式进行二
级质谱分析。

分别选取丰度较强的主要碎片离子作为定量离子和辅助定性离子。

并进一步优化碰撞能量、透镜电压等质谱参数，使各分析化合物的响应最大。

优化的
质谱参数及母离子和子离子见表1，其总离子流图见图1。

图1 4种尼泊金酯的总离子流色谱图
Fig.1 TIC chromatogram of four nipagin esters
1.methylparaben，
2.ethylparaben，
3.propylparaben，
4.butylparaben
2.2 流动相的选择
分别考察了以甲醇-水和乙腈-水混合溶剂体系为流动相以及在流动相中分别添加甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵等溶液时对目标物色谱行为和离子化程度的影响。

结果发现，在乙腈-水体系中添加乙酸可显著改善4种待测物的灵敏度，其灵敏度高于纯水和加入甲酸的体系，而加入甲酸铵或乙酸铵时峰形展宽，故最终选择0.1％乙酸-乙腈溶液为流动相，进行梯度洗脱。

为提高样品中4种待测物的分离度，去除杂质干扰，获得较好的色谱峰形，结合C
18色谱柱的分离特性，在梯度开始时应用较高比例的水相以获得较高的分离效率，随后采用较高比例的有机相以尽快去除杂质并获得较好的色谱峰形［21］。

2.3 固相萃取吸附剂的选择
样品提取过程中的基质杂质可能会影响待测物的定性和定量分析结果，故需要对提
取液进行净化。

分别考察了不同SPE柱(Waters Oasis HLB，Waters Oasis MCX，Superclean ENVI C
18)的萃取效率。

结果发现，Waters Oasis MCX SPE柱的净化效果较好，其加标回收率为78％～94％，回收率结果满足要求。

Waters Oasis HLB和Superclean ENVI C
18柱的回收率为72％～83％。

因此，采用Waters Oasis MCX SPE
柱进行净化处理。

考察了不同配比的甲醇-水淋洗液，结果发现20％甲醇-水溶液
不能将4种尼泊金酯洗脱下来，因此将其作为淋洗液。

随后采用4 mL甲醇和2 mL的2％氨水甲醇作为洗脱液将4种尼泊金酯完全洗脱。

2.4 方法的线性范围与相关系数
尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯为同系化合物，其结构相近，故在定量分析时选择尼泊金丙酯-D7作为内标物。

在优化条件下，以定量离子峰
面积(y)对质量浓度(x，ng· mL
-1)绘制标准曲线，结果显示，4种待测物均在5.0～100.0 ng·mL
-1范围内具有良好线性关系，相关系数均不低于0.999 2。

线性方程分别为y =0.030 5x-0.006 79(r
2=0.999 7)，y =0.033 1x+0.000 724(r
2=0.999 6)，y =0.057 6x+0.093 7(r
2=0.999 6)，y =0.041 9x-0.006 1(r
2=0.999 2)。

2.5 方法的定量下限与回收率
以10倍信噪比(S/N =10)确定方法的定量下限(LOQ)，尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、
尼泊金丙酯和尼泊金丁酯的定量下限均为10.0 μg·kg
-1。

与文献［1，3，11］相比，本方法的定量下限更低。

分别在4种空白基质(羊栖菜、紫菜、带鱼、黄鱼)中添加10，20，100 μg·kg
-13个水平的4种尼泊金酯类化合物，平行测定6次，回收率与相对标准偏差结果列于表2。

由表2可知，各化合物的平均回收率在75％～96％之间，RSD不大于7.1％，方法显示了较好的回收率与精密度。

空白样品和样品加标的MRM图谱见图2和图3。

图2 黄鱼空白样品的MRM图谱
Fig.2 MRM chromatogram of a blank yellow croaker sample
图3 10.0 μg/kg黄鱼样品加标的MRM色谱图
Fig.3 MRM chromatograms of 10.0 μg/kg spiked yellow croaker sample
表2 样品中4种尼泊金酯类化合物的加标回收率及相对标准偏差(n =6)
Table 2 Recoveries and RSDs of four nipagin esters in real samples(n =6)
(续表2)
2.6 实际样品的测定
应用本方法对市售10种水产品样品进行了分析测定，未检出该4种尼泊金酯类化合物残留。

3 结论
本文建立了液相色谱-串联质谱技术同时测定水产品中4种尼泊金酯类防腐剂(尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯)的分析方法。

样品经甲醇超声提取后进行MCX净化，净化液上机分析，平均加标回收率为75％～96％，相对标准偏差不大于7.1％。

该方法简便、准确、灵敏，满足水产品中4种尼泊金酯类防腐剂同时定性定量分析的要求。

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