免疫化学法
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难以掌握好加入活性 炭的时间，时间长了 会使B分离
F和B分离不够完全， 结果的精密度和准确度 低于吸附法和双抗体法
吸附法 化学试剂 沉淀法
快速简单，可批 量处理样品
试剂价格低廉， 操作方便
双抗体法 固相分离 法
操作简便，稳定，可处 要制备第二抗体增加 理大量样品，应用广泛。 了实验难度，且沉淀 特异性。重现性好。 所需时间较长
定其中游离的（Ag*）或结合态的（Ag*-Ab）的
标记物浓度，间接求算被测药物Ag的含量。（直
接测定的是标记物浓度）
RIA原理示意图
1.5 具体测定的方法
固定Ag*和Ab的量，其他条件一定，标记药 物的平衡浓度（Ag*或Ag*-Ab）与Ag加入量具有 一定的相关性，通过测定一系列含已知加入量 的Ag的标准管中标记物的平衡浓度（Ag*或Ag*Ab），求得Ag浓度与标记药物平衡浓度间的函 数关系，（即通常定量中所谓标准曲线）。将 含被测药物Ag的样品管与标准管按相同条件操 作，测定样品管中标记物的平衡浓度，利用函 数关系（标准曲线）求得样品中Ag的浓度。
§3.抗体的制备及其质量评价
1.半抗原 2.抗体质量评价的三个指标
§4.放射免疫分析法
1 2 3 4 5 免疫化学法的分类 放射免疫分析（RIA）定义 RIA中的基本问题 具体操作步骤 RIA的优缺点
2 放射免疫分析（RIA）定义
根据放射性同位素检测的高灵敏性以及Ag-Ab 反应的高度特异性，利用放射性同位素标记抗 原或抗体的一种超微量分析方法。 (RIA测定的基本原理即竞争蛋白结合分析， 标
80年代初，Ngot建立了荧光免疫分析(FIA)。 90年代中期，全自动化学发光免疫分析，成为非 放射性免疫分析中最有前途的方法。 随着物理化学、生物化学、免疫学技术的进一步 发展与渗透，新的标记物和理化检测手段还在不 断出现，从而推动着免疫化学法向着更加专一， 灵敏及测定自动化的方向发展。
1968年，oliver等人首次用RIA测定体液中洋地 黄毒苷，奠定了免疫化学法测定体液药物浓度的 基础。
1.2 抗原抗体竞争反应
抗原抗体能够特异性结合是基于两种分
子间的结构互补性与亲和性，这是由抗原与
抗体分子的一级结构决定的。
抗原抗体竞争反应的两个阶段
第一阶段
抗原抗体发生特异性结合的阶段。此阶段 反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可 见反应。
第二阶段 可见反应阶段。Ag-Ab复合物在环境因素 (如电解质,PH,温度,补体)的影响下,进一 步交联聚合,表现为凝集、沉淀、溶解、 补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反 应.此阶段反应较慢,需数分钟至数小时.
的免疫活性和稳定性。
标记抗原应具备的条件：
① 比放射性高，以保证方法的灵敏度；
② 免疫活性好； ③ 所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次 可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤 其重要；
④ 标记简便、易防护。
b．RIA中常用的放射性同位素
3H，14C，125I，131I, 75S e等
(Hale Waihona Puke Baidu中3H 和125I应用最多，且以125I应用最广泛)。
2.3 滴度（titer）
即能与定量药物产生一定程度结合的抗血清的最 大稀释度，是抗血清中抗体浓度的一种表达方式。
稀释倍数越大，表示滴度越高。
在实际工作中，多采用结合标记抗原50%时的抗
血清稀释度，过高或过低都影响方法的灵敏度。
小
结
§1.前言 四大标记免疫技术
§2.免化法的方法原理及特点 1.基本原理 2.分析系统中的三种基本成分 3.抗原抗体反应的特点 4.测定方法原理 5.方法特点
从药物半抗原制备抗原的两个主要问题： ① 载体的选择 关键： 应使药物与载体形成的结合物易溶解。
最常用的载体： 牛血清白蛋白(BSA)；兔血清白蛋白(RSA)
优点：价廉，免疫活性高，化学性质稳定， 溶解度好，连接基团多。
② 药物与蛋白质载体的结合 包括： a.结合位点 b.结合方式 c.每个蛋白分子所结合的药物分子数目
2 方法特点
2.1 灵敏度极高
最低检测浓度达10-9~10-12g/ml水平。 原因： ① 选用对药物具高度亲和性的抗体用结合蛋白使 含量极低的药物被抗体牢固结合，易于检出。 ② 引入了能够提供强检测信号的标记物，如：放 射性同位素标记,荧光标记，酶标记等，并采用 高灵敏的理化手段检测。
2.2 特异性（选择性）较高
1.3 抗原抗体反应的特点
①特异性
抗原抗体的结合实质上是抗原决定簇与抗体 超变区中抗原结合点之间的结合。由于两者在化学 结构和空间结构上的互补关系，所以呈现高度的特 异性。 如同钥匙和锁的关系，一把钥匙配一把锁。但 偶尔也会出现一把钥匙开几把锁的情况，比如有些 大分子的蛋白质常常含有多种抗原表位，如果两种 不同抗原分子上有相同的抗原表位，即可出现交叉 反应，也就是说同一抗体可结合不同抗原分子。
60年代末，创立了免疫放射分析（IRMA），灵 敏度、特异性和线性范围均优于RIA 。 70年代初，建立了酶标记免疫分析（EIA），其 标记物来源丰富，价格低，没有放射性污染， 有效期长，正常的保存期可超过一年。发展迅 速。但由于要测定酶的活性，涉及酶动力学， 比较复杂且灵敏度不及RIA。 70年代中期，首次报道用发光信号进行酶免分 析，灵敏度高，可达10-18mol，快速，发光信号 信息量大。
三种基本试剂
标记物 抗体 药物标准品（非标记物）
抗体质量的好坏直接影响到测定结果的灵敏 度和精密度。
1.1 从药物半抗原制备抗原 两个步骤
1.2 抗体的获得
1.1 从药物半抗原制备抗原
半抗原（hapten）：分子量小于1000的物 质，需要与蛋白质或多肽等载体物质结合 后，才能具有抗原性，并诱发特异性抗体 。这类小分子物质称为半抗原。（临床上 使用的药物大多数为半抗原）
§2.免化法的方法原理及特点
1 原理与方法 2 方法特点
1 原理与方法
1.1 基本原理
1.2 抗原抗体竞争反应 1.3 抗原抗体反应的特点 1.4 免化法测定原理 1.5 具体测定的方法
1.1 基本原理
竞争蛋白结合分析，即利用抗原抗体竞
争反应，作竞争免疫分析。
分析系统中三种基本成分 待测药物 ① 非标记药物（Ag） 药物标准品 ② 试剂中的标记药物（Ag*） ③ 特异性抗体（Ab）
发展至今，体内药分常用三大免疫标记抗 体技术为：
1.放射免疫分析
（radioimmunoassay，RIA）
2.酶免疫分析
（enzyme immunoassay , EIA） 3.荧光免疫分析 （fluorescence immunoassay，FIA）
近年进展： 第四免疫标记技术出现—— 化学发光免疫分析 （chemolumminescence immunoassay, CLIA ） 该技术的应用使免疫化学法在灵敏 度和特异性两方面得到进一步发展,被认 为是很有前途的方法之一。
a.结合位点
蛋白质到底连接到半抗原分子上的哪个位置？ 一般认为，理想的人工抗原是使蛋白质联接在 半抗原分子上对免疫识别最不重要的区域，也 就是勿使半抗原的结构特点（免疫决定簇）被 掩盖。
b.结合方式
药物与载体蛋白的结合通常是通过共价键或配 位键联接。药物本身有活性官能团，如-COOH， -NH2，-OH，-C=O等，可采用适当的偶联试剂与 蛋白结合；若药物本身无适当的活性官能团， 可以经化学处理使其产生活性基团，然后与蛋 白结合，或将药物结构稍加改变，加入活性基 团后与蛋白结合。
2.抗体质量的评价
从三个方面进行评价:
2.1 特异性（specificity） 2.2 亲和力（affinity） 2.3 滴度 （titer）
2.1 特异性 （specificity）
①抗体与标记及非标记药物的结合能力
（要求：对标记及非标记药物有同等结合力，以 便有效抑制） ②抗体与同特定抗原相似物质的结合能力，即交 叉反应的程度
1.4 免化法测定原理
测定系统中，Ag*与Ab的量固定，Ag浓度↑，
将抑制Ag*和Ab的结合，Ag*-Ab的数量↓，从而
形成竞争结合。反应达平衡时，反应体系中有两 种 形 式 的 标 记 物 存 在 ， 即 游 离 的 Ag* 和 复 合 物 Ag*-Ab。根据标记物的理化特性（如：放射性、 光吸收、荧光等），采用一定的理化分析手段测
交叉反应（Cross Reaction）
──由共同抗原刺激机体产生的抗体分子可以和不
同生物间相同或相似的抗原决定簇结合。
交叉反应示意图
②可逆性
抗原抗体反应遵循生物大分子热动力 学反应原则：
其反应式为：
k1为正反应速度常数，k2为逆反应速度 常数，K是反应平衡时的速度常数。由上式可 知，K值是反映抗原抗体结合能力的指标，所 以抗体亲和力通常以K值表示。
（要求：抗体与标记药物的结合力不被交叉反应
所抑制）
2.2 亲和力（affinity）
即抗体对抗原吸引力的大小及抗原抗体结合的 牢固度。 用抗原抗体反应常数K表示： K=[Ag-Ab]/[Ag][Ab] K值大，亲和力强，测定结果的重观性越好。一 般K值达到109-1012mol/L 才适合用于放免分析。
记药物所用的试剂为放射性同位素)。
3 RIA中的基本问题
3.1 抗体的制备 3.2 标记药物的制备 3.3 结合标记药物与游离标记药物的分离 3.4 放射性强度测定 3.5 标准曲线的绘制及样品测定
3.2 标记药物的制备
a．对同位素的要求
用作标记药物的放射性同位素，须有较高的 放射性比度和纯度，且标记后的药物保持原有
操作简便，易于 自动分析
固相载体本身吸附游 离标记物，误差较大
双抗体法
（double antibody method）
是分离B和F的一种有效的方法。一般的抗原 抗体反应中，生成的抗原抗体结合物因分子量小， 不足以生成沉淀而处于“溶解”状态。通常这种 抗体叫做第一抗体，若将第一抗体再作为新的抗 原注射入较大动物（如羊、马、牛等），则可获 得第二抗体。第二抗体可以与第一抗体-抗原结 合物形成相应的结合物，使分子体积变大而形成 沉淀，达到B和F的分离。
体内药物分析
第五章 免疫化学法
§1.前言 §2.免化法的方法原理及特点 §3.抗体的制备及其质量评价 §4.放射免疫分析法
§1 前言
免疫化学法的发展概况：
1950年，两位美国免疫学家成功地用碘的放射 性同位素标记抗原，开创了放射免疫研究的先 河。 1959年，Yalow和Berson建立了胰岛素放免分 析测定糖尿病病人血浆中胰岛素浓度，放射免 疫分析法创立。两人获得诺贝尔奖。 60年代中期 ，固相抗体分离方法建立。
原因： 选用的抗体对被测药物具高度的专一性，能 够与被测药物进行选择性的结合。
说明：
由于交叉反应的存在，使免化法的特异性不 如色谱法高。
2.3 所需样品量少，且样品前处理过程 简单，常常不需要任何前处理。
§3.抗体的制备及其质量评价
1.抗体的制备 2.抗体质量的评价
1.抗体的制备
任何免疫分析法都必须具备三种基本试剂，即：
c.每个蛋白分子所结合的半抗原分子数目
载体蛋白分子上结合的半抗原数目常常影响诱 发动物抗体的产生，数目过多或过少，均可使
诱发能力降低。一般每个蛋白质分子上结合的
半抗原分子以10个左右为宜。
1.2 抗体的获得
将经纯化、冻干的药物——载体蛋白结合物悬混于 弗氏完全佐剂 （Freund’s complete adjuvant） 中，配成1mg/ml的混悬液，用皮下或皮内注射的方 式注入免疫动物体内（常用家兔、山羊、豚鼠）， （也可采用股淋巴结直接注射），数月后可诱发得 到所需抗体。当免疫动物血液中抗体达到一定量后 ，及时采血，分离血清（或血浆）。便可获得能对 特定药物专一性结合的特异性抗体。
125I标记药物的常用方法：氧化法
常用氧化剂有H2O2，ICL，氯胺T
3.3 结合标记药物与游离标记药物的分离
RIA属非均相免疫分析，须将游离标记物与结合 态标记物分离后才能测定各自的放射性强度。 *双抗体法 固相法 常用的分离技术 吸附法 化学试剂沉淀法
游离药物和结合药物的分离方法
分离方法 优点 缺点
抗原决定簇 （antigenic determinant ）
是存在于抗原分子表面，决定抗原特异性的特殊 化学基团，一般由5～8个氨基酸残基、短寡糖
残基、核苷酸残基组成。抗原决定簇是被免疫
细胞和抗体分子识别的标志，是免疫反应具有
特异性的物质基础。
共同抗原(common antigen)
──两种不同生物间存在相同或相似的抗原决定 簇，称为共同抗原。
F和B分离不够完全， 结果的精密度和准确度 低于吸附法和双抗体法
吸附法 化学试剂 沉淀法
快速简单，可批 量处理样品
试剂价格低廉， 操作方便
双抗体法 固相分离 法
操作简便，稳定，可处 要制备第二抗体增加 理大量样品，应用广泛。 了实验难度，且沉淀 特异性。重现性好。 所需时间较长
定其中游离的（Ag*）或结合态的（Ag*-Ab）的
标记物浓度，间接求算被测药物Ag的含量。（直
接测定的是标记物浓度）
RIA原理示意图
1.5 具体测定的方法
固定Ag*和Ab的量，其他条件一定，标记药 物的平衡浓度（Ag*或Ag*-Ab）与Ag加入量具有 一定的相关性，通过测定一系列含已知加入量 的Ag的标准管中标记物的平衡浓度（Ag*或Ag*Ab），求得Ag浓度与标记药物平衡浓度间的函 数关系，（即通常定量中所谓标准曲线）。将 含被测药物Ag的样品管与标准管按相同条件操 作，测定样品管中标记物的平衡浓度，利用函 数关系（标准曲线）求得样品中Ag的浓度。
§3.抗体的制备及其质量评价
1.半抗原 2.抗体质量评价的三个指标
§4.放射免疫分析法
1 2 3 4 5 免疫化学法的分类 放射免疫分析（RIA）定义 RIA中的基本问题 具体操作步骤 RIA的优缺点
2 放射免疫分析（RIA）定义
根据放射性同位素检测的高灵敏性以及Ag-Ab 反应的高度特异性，利用放射性同位素标记抗 原或抗体的一种超微量分析方法。 (RIA测定的基本原理即竞争蛋白结合分析， 标
80年代初，Ngot建立了荧光免疫分析(FIA)。 90年代中期，全自动化学发光免疫分析，成为非 放射性免疫分析中最有前途的方法。 随着物理化学、生物化学、免疫学技术的进一步 发展与渗透，新的标记物和理化检测手段还在不 断出现，从而推动着免疫化学法向着更加专一， 灵敏及测定自动化的方向发展。
1968年，oliver等人首次用RIA测定体液中洋地 黄毒苷，奠定了免疫化学法测定体液药物浓度的 基础。
1.2 抗原抗体竞争反应
抗原抗体能够特异性结合是基于两种分
子间的结构互补性与亲和性，这是由抗原与
抗体分子的一级结构决定的。
抗原抗体竞争反应的两个阶段
第一阶段
抗原抗体发生特异性结合的阶段。此阶段 反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可 见反应。
第二阶段 可见反应阶段。Ag-Ab复合物在环境因素 (如电解质,PH,温度,补体)的影响下,进一 步交联聚合,表现为凝集、沉淀、溶解、 补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反 应.此阶段反应较慢,需数分钟至数小时.
的免疫活性和稳定性。
标记抗原应具备的条件：
① 比放射性高，以保证方法的灵敏度；
② 免疫活性好； ③ 所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次 可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤 其重要；
④ 标记简便、易防护。
b．RIA中常用的放射性同位素
3H，14C，125I，131I, 75S e等
(Hale Waihona Puke Baidu中3H 和125I应用最多，且以125I应用最广泛)。
2.3 滴度（titer）
即能与定量药物产生一定程度结合的抗血清的最 大稀释度，是抗血清中抗体浓度的一种表达方式。
稀释倍数越大，表示滴度越高。
在实际工作中，多采用结合标记抗原50%时的抗
血清稀释度，过高或过低都影响方法的灵敏度。
小
结
§1.前言 四大标记免疫技术
§2.免化法的方法原理及特点 1.基本原理 2.分析系统中的三种基本成分 3.抗原抗体反应的特点 4.测定方法原理 5.方法特点
从药物半抗原制备抗原的两个主要问题： ① 载体的选择 关键： 应使药物与载体形成的结合物易溶解。
最常用的载体： 牛血清白蛋白(BSA)；兔血清白蛋白(RSA)
优点：价廉，免疫活性高，化学性质稳定， 溶解度好，连接基团多。
② 药物与蛋白质载体的结合 包括： a.结合位点 b.结合方式 c.每个蛋白分子所结合的药物分子数目
2 方法特点
2.1 灵敏度极高
最低检测浓度达10-9~10-12g/ml水平。 原因： ① 选用对药物具高度亲和性的抗体用结合蛋白使 含量极低的药物被抗体牢固结合，易于检出。 ② 引入了能够提供强检测信号的标记物，如：放 射性同位素标记,荧光标记，酶标记等，并采用 高灵敏的理化手段检测。
2.2 特异性（选择性）较高
1.3 抗原抗体反应的特点
①特异性
抗原抗体的结合实质上是抗原决定簇与抗体 超变区中抗原结合点之间的结合。由于两者在化学 结构和空间结构上的互补关系，所以呈现高度的特 异性。 如同钥匙和锁的关系，一把钥匙配一把锁。但 偶尔也会出现一把钥匙开几把锁的情况，比如有些 大分子的蛋白质常常含有多种抗原表位，如果两种 不同抗原分子上有相同的抗原表位，即可出现交叉 反应，也就是说同一抗体可结合不同抗原分子。
60年代末，创立了免疫放射分析（IRMA），灵 敏度、特异性和线性范围均优于RIA 。 70年代初，建立了酶标记免疫分析（EIA），其 标记物来源丰富，价格低，没有放射性污染， 有效期长，正常的保存期可超过一年。发展迅 速。但由于要测定酶的活性，涉及酶动力学， 比较复杂且灵敏度不及RIA。 70年代中期，首次报道用发光信号进行酶免分 析，灵敏度高，可达10-18mol，快速，发光信号 信息量大。
三种基本试剂
标记物 抗体 药物标准品（非标记物）
抗体质量的好坏直接影响到测定结果的灵敏 度和精密度。
1.1 从药物半抗原制备抗原 两个步骤
1.2 抗体的获得
1.1 从药物半抗原制备抗原
半抗原（hapten）：分子量小于1000的物 质，需要与蛋白质或多肽等载体物质结合 后，才能具有抗原性，并诱发特异性抗体 。这类小分子物质称为半抗原。（临床上 使用的药物大多数为半抗原）
§2.免化法的方法原理及特点
1 原理与方法 2 方法特点
1 原理与方法
1.1 基本原理
1.2 抗原抗体竞争反应 1.3 抗原抗体反应的特点 1.4 免化法测定原理 1.5 具体测定的方法
1.1 基本原理
竞争蛋白结合分析，即利用抗原抗体竞
争反应，作竞争免疫分析。
分析系统中三种基本成分 待测药物 ① 非标记药物（Ag） 药物标准品 ② 试剂中的标记药物（Ag*） ③ 特异性抗体（Ab）
发展至今，体内药分常用三大免疫标记抗 体技术为：
1.放射免疫分析
（radioimmunoassay，RIA）
2.酶免疫分析
（enzyme immunoassay , EIA） 3.荧光免疫分析 （fluorescence immunoassay，FIA）
近年进展： 第四免疫标记技术出现—— 化学发光免疫分析 （chemolumminescence immunoassay, CLIA ） 该技术的应用使免疫化学法在灵敏 度和特异性两方面得到进一步发展,被认 为是很有前途的方法之一。
a.结合位点
蛋白质到底连接到半抗原分子上的哪个位置？ 一般认为，理想的人工抗原是使蛋白质联接在 半抗原分子上对免疫识别最不重要的区域，也 就是勿使半抗原的结构特点（免疫决定簇）被 掩盖。
b.结合方式
药物与载体蛋白的结合通常是通过共价键或配 位键联接。药物本身有活性官能团，如-COOH， -NH2，-OH，-C=O等，可采用适当的偶联试剂与 蛋白结合；若药物本身无适当的活性官能团， 可以经化学处理使其产生活性基团，然后与蛋 白结合，或将药物结构稍加改变，加入活性基 团后与蛋白结合。
2.抗体质量的评价
从三个方面进行评价:
2.1 特异性（specificity） 2.2 亲和力（affinity） 2.3 滴度 （titer）
2.1 特异性 （specificity）
①抗体与标记及非标记药物的结合能力
（要求：对标记及非标记药物有同等结合力，以 便有效抑制） ②抗体与同特定抗原相似物质的结合能力，即交 叉反应的程度
1.4 免化法测定原理
测定系统中，Ag*与Ab的量固定，Ag浓度↑，
将抑制Ag*和Ab的结合，Ag*-Ab的数量↓，从而
形成竞争结合。反应达平衡时，反应体系中有两 种 形 式 的 标 记 物 存 在 ， 即 游 离 的 Ag* 和 复 合 物 Ag*-Ab。根据标记物的理化特性（如：放射性、 光吸收、荧光等），采用一定的理化分析手段测
交叉反应（Cross Reaction）
──由共同抗原刺激机体产生的抗体分子可以和不
同生物间相同或相似的抗原决定簇结合。
交叉反应示意图
②可逆性
抗原抗体反应遵循生物大分子热动力 学反应原则：
其反应式为：
k1为正反应速度常数，k2为逆反应速度 常数，K是反应平衡时的速度常数。由上式可 知，K值是反映抗原抗体结合能力的指标，所 以抗体亲和力通常以K值表示。
（要求：抗体与标记药物的结合力不被交叉反应
所抑制）
2.2 亲和力（affinity）
即抗体对抗原吸引力的大小及抗原抗体结合的 牢固度。 用抗原抗体反应常数K表示： K=[Ag-Ab]/[Ag][Ab] K值大，亲和力强，测定结果的重观性越好。一 般K值达到109-1012mol/L 才适合用于放免分析。
记药物所用的试剂为放射性同位素)。
3 RIA中的基本问题
3.1 抗体的制备 3.2 标记药物的制备 3.3 结合标记药物与游离标记药物的分离 3.4 放射性强度测定 3.5 标准曲线的绘制及样品测定
3.2 标记药物的制备
a．对同位素的要求
用作标记药物的放射性同位素，须有较高的 放射性比度和纯度，且标记后的药物保持原有
操作简便，易于 自动分析
固相载体本身吸附游 离标记物，误差较大
双抗体法
（double antibody method）
是分离B和F的一种有效的方法。一般的抗原 抗体反应中，生成的抗原抗体结合物因分子量小， 不足以生成沉淀而处于“溶解”状态。通常这种 抗体叫做第一抗体，若将第一抗体再作为新的抗 原注射入较大动物（如羊、马、牛等），则可获 得第二抗体。第二抗体可以与第一抗体-抗原结 合物形成相应的结合物，使分子体积变大而形成 沉淀，达到B和F的分离。
体内药物分析
第五章 免疫化学法
§1.前言 §2.免化法的方法原理及特点 §3.抗体的制备及其质量评价 §4.放射免疫分析法
§1 前言
免疫化学法的发展概况：
1950年，两位美国免疫学家成功地用碘的放射 性同位素标记抗原，开创了放射免疫研究的先 河。 1959年，Yalow和Berson建立了胰岛素放免分 析测定糖尿病病人血浆中胰岛素浓度，放射免 疫分析法创立。两人获得诺贝尔奖。 60年代中期 ，固相抗体分离方法建立。
原因： 选用的抗体对被测药物具高度的专一性，能 够与被测药物进行选择性的结合。
说明：
由于交叉反应的存在，使免化法的特异性不 如色谱法高。
2.3 所需样品量少，且样品前处理过程 简单，常常不需要任何前处理。
§3.抗体的制备及其质量评价
1.抗体的制备 2.抗体质量的评价
1.抗体的制备
任何免疫分析法都必须具备三种基本试剂，即：
c.每个蛋白分子所结合的半抗原分子数目
载体蛋白分子上结合的半抗原数目常常影响诱 发动物抗体的产生，数目过多或过少，均可使
诱发能力降低。一般每个蛋白质分子上结合的
半抗原分子以10个左右为宜。
1.2 抗体的获得
将经纯化、冻干的药物——载体蛋白结合物悬混于 弗氏完全佐剂 （Freund’s complete adjuvant） 中，配成1mg/ml的混悬液，用皮下或皮内注射的方 式注入免疫动物体内（常用家兔、山羊、豚鼠）， （也可采用股淋巴结直接注射），数月后可诱发得 到所需抗体。当免疫动物血液中抗体达到一定量后 ，及时采血，分离血清（或血浆）。便可获得能对 特定药物专一性结合的特异性抗体。
125I标记药物的常用方法：氧化法
常用氧化剂有H2O2，ICL，氯胺T
3.3 结合标记药物与游离标记药物的分离
RIA属非均相免疫分析，须将游离标记物与结合 态标记物分离后才能测定各自的放射性强度。 *双抗体法 固相法 常用的分离技术 吸附法 化学试剂沉淀法
游离药物和结合药物的分离方法
分离方法 优点 缺点
抗原决定簇 （antigenic determinant ）
是存在于抗原分子表面，决定抗原特异性的特殊 化学基团，一般由5～8个氨基酸残基、短寡糖
残基、核苷酸残基组成。抗原决定簇是被免疫
细胞和抗体分子识别的标志，是免疫反应具有
特异性的物质基础。
共同抗原(common antigen)
──两种不同生物间存在相同或相似的抗原决定 簇，称为共同抗原。