新一代测序技术无创产前检测胎儿FGFR3基因突变

新一代测序技术无创产前检测胎儿FGFR3基因突变
任远;高雅;卢彦平;赵佳;李芮冰;刘弘泰;姜淑芳;谢一帆;周红辉;游艳琴;孟元光
【摘要】目的探讨新一代测序技术（next-generation sequencing,NGS）无创
产前筛查FGFR3相关疾病的可行性与准确率。

方法 4例软骨发育不全、2例致死性侏儒Ⅰ型胎儿基因组DNA（g DNA）片段化后,以相应母体产后血浆游离DNA
为背景,按照10%、6%、3%、1%、0.5%的浓度进行稀释,形成30例阳性模拟样本,建立孕妇血浆游离DNA模型,同时采集13例阴性对照孕妇血浆游离DNA,运用NGS技术分别检测FGFR3致病突变位点,计算检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。

结果 30例模拟样本中,胎儿g DNA浓度为10%、6%、3%、1%、0.5%时,突变检出例数分别为6/6、6/6、6/6、3/6、1/6,13例阴性突变检出例数
为0/13;胎儿g DNA浓度≥3%时,NGS的灵敏度为100%（95%CI：81.5%～100%）,特异度为100%（95%CI：75.3%～100%）,阳性预测值为100%
（95%CI：81.5%～100%）,阴性预测值为100%（95%CI：75.3%～100%）。

结论胎儿g DNA浓度≥3%时,NGS可以在孕妇血浆游离DNA模型中准确检出胎
儿FGFR3基因突变,提示基于NGS技术的无创产前检测在新发突变或父源遗传疾
病的产前诊断领域具有一定的应用前景。

【期刊名称】《解放军医学院学报》
【年(卷),期】2017(038)001
【总页数】6页(P14-18,21)
【关键词】新一代测序技术;无创产前检测;胎儿游离DNA;软骨发育不全;FGFR3基因
【作者】任远;高雅;卢彦平;赵佳;李芮冰;刘弘泰;姜淑芳;谢一帆;周红辉;游艳琴;孟元光
【作者单位】解放军总医院妇产科,北京100853
【正文语种】中文
【中图分类】R714.5
软骨发育不全(achondroplasia，ACH；OMIM编码100800)是最常见的胎儿非致死性骨骼畸形之一，年发病率为0.36～0.60/10 000[1]。

ACH因成纤维细胞生长因子受体-3(fibroblast growth factor receptor-3，FGFR3)编码基因
FGFR3(4p.16.3，OMIM编码134934)突变所致，患者中98%携带FGFR3
c.1138G＞A突变[2]，外显率100%，属于常染色体显性遗传疾病。

ACH胎儿多在孕25周后出现四肢长骨生长明显落后[3]，多数病例确诊时已进入孕晚期[4]，为临床处理带来诸多问题。

致死性侏儒(thanatophoric dysplasia，TD)是最常见的胎儿致死性骨骼畸形之一，发病率为0.21～0.30/10 000[1]，胎儿多在系统超声筛查时(孕20～24周)发现四肢长骨缩短、巨颅、前额突出、胸廓严重狭窄等异常，新生儿常因呼吸循环功能衰竭在出生后24 h内死亡[5]。

TD可分为TDⅠ型(TDⅠ，OMIM编码187600)，胎儿长骨短而弯曲，类似“听筒样”；TDⅡ型(TDⅡ，OMIM编码187601)，胎儿长骨短而直，头颅呈分叶状类似“三叶草”或“草莓样”改变。

TD同样由FGFR3突变引起：50%以上的TDⅠ型患者携带FGFR3 c.742C＞T突变，而几乎所有的TDⅡ型患者均携带FGFR3 c.1948A＞G 突变[6]，外显率均为100%，亦属于常染色体显性遗传疾病。

1997年，Lo等[7]在孕有男性胎儿的孕妇外周血浆游离DNA中检测到Y染色体性别决定区特异性片段，证明孕妇外周血中存在胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA，cff-DNA)。

在新
一代测序技术(next-generation sequencing，NGS)的推动下，无创筛查胎儿非
整倍体技术(non-invasive prenatal test，NIPT)已在国内外广泛应用。

cff-DNA
包含胎儿全基因组信息，无创产前检测理论上可从胎儿染色体异常扩展至单基因遗传疾病[8]。

孕妇游离血浆DNA中超过80%为孕妇来源[9]，目前技术难以将cff-DNA从中准确分离，因此NIPT主要用于鉴定新发突变或父源遗传物质的有无，
即父源常染体遗传疾病、性染色体遗传疾病以及自身突变所致遗传疾病。

ACH、TD均为常染色体显性遗传，多数为自身突变，存在致病热点突变，使其无创产前检测成为可能。

本文通过构建孕有ACH、TD胎儿的孕妇血浆游离DNA模型，并运用NGS技术进行相关致病位点检测，探讨孕中期无创产前筛查ACH与TD的
可行性与准确率。

1 研究对象 2015年1月- 2016年4月共有17例孕妇因孕期超声提示胎儿四肢短小疑似ACH，或因既往ACH胎儿生育史就诊于本院产前诊断中心，就诊孕周
30+4周(IQR，29+1～32周)。

另有2名孕妇因系统超声检查(分别为孕22+6、21+2周)提示胎儿股骨短而弯曲、巨颅、胸廓狭窄疑似TD就诊于我院。

所有孕妇均为正常个体，无ACH、TD异常表型，就诊时均无妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、糖尿病合并妊娠、妊娠期急性脂肪肝等妊娠期合并症或并发症，肝肾功能未见异常；全部胎儿均依据孕妇末次月经时间及11～13+6周超声中胎儿顶臀长核
算孕周。

本研究经解放军医学院伦理委员会批准，所有实验对象均签署知情同意书。

2 羊膜腔穿刺及产前诊断对于17例ACH高风险胎儿，超声引导下羊膜腔穿刺采
集羊水，采用QIAamp® DNA Mini Kit试剂盒(Qiagen)提取胎儿基因组
DNA(genome DNA，gDNA)，通过Sanger测序行FGFR3 c.1123、c.1138、c.1130位点检测[10]。

其中4例胎儿检出FGFR3 c.1138G＞A杂合突变，确诊ACH患者；13例胎儿未检出ACH相关突变。

2例疑似TD胎儿，采用目标外显
子捕获及新一代测序技术检测骨骼畸形相关基因，采用Sanger测序对可疑突变位
点进行验证[11]：2例胎儿分别携带FGFR3 c.742C＞T、c.1118A＞G杂合突变，确诊TDⅠ。

以基因检测明确携带致病突变的胎儿作为阳性病例，以基因检测未检出致病突变的胎儿作为阴性对照。

3 产妇gDNA提取及Sanger测序 1)4例ACH胎儿、2例TDⅠ胎儿孕妇于分娩
或引产24 h后行妇科超声检查未见异常，产后42 d产妇外周血HCG检测均＜5 U/L，随后使用Cell Free DNA BCT® Blood Collection Tube(Stre ck)采集产妇
外周血20 ml。

13例阴性对照孕妇均于羊膜腔穿刺前或分娩前留取外周血20 ml，采集孕周32+2(IQR，27+2～33+6周)。

所有样本采用ID号码进行标识，不告知实验人员及数据分析人员胎儿最终诊断结果。

2)全部样本均于采集8 h内送至实验室处理：全血1 600 g 4℃低温离心10 min，吸取血浆，16 000 g 4℃低温离心
血浆10 min，取上清，转移至2 ml Eppendorf® LoBind无菌离心管内[12]。

采用QIAamp® CircμLating Nucleic A cid Kit试剂盒(Qiagen)提取血浆游离DNA，使用40μl缓冲液进行洗脱和回溶，-80℃保存备用。

3)ACH、TDⅠ胎儿母体产后血浆分离后，留取血沉棕黄层，用QIAamp® DNA Mini Kit试剂盒(Qiagen)提
取母体gDNA，行Sanger测序均未发现母体携带胎儿相应致病突变。

4 胎儿gDNA片段化采用Covaris E210共聚焦超声波DNA破碎仪，对ACH、TD胎儿gDNA进行片段化，目标片段150～200 bp。

采用AxyPrepTMMag PCR Clean-Up磁珠(Axygen)对打断产物进行纯化，使用40μl 缓冲液回溶，完成片段选择，随后使用实时定量PCR(real-time quantitative PCR，RTQ-PCR)与Agilent Bioanalyzer 2100生物分析系统对片选后DNA片段长度进行检测。

5 模拟样本制备采用Qubit® dsDNA HS Aaasy Kit(invitrogen)、Qubit® 2.0
荧光定量仪(Invitrogen)，对ACH、TD胎儿gDNA及相应母体产后血浆游离DNA进行定量。

根据定量结果以母体血浆游离DNA为背景，对相应胎儿gDNA
按照10%、6%、3%、1%、0.5%的浓度进行稀释。

计算公式为VF=Q·PF/CF，
VM=Q·(1-PF)/CM，其中Q代表混合体系中DNA总量(6～8 ng)，VF、VM分别代表胎儿gDNA与母体血浆游离DNA的体积，CF、CM分别代表胎儿gDNA与母体血浆游离DNA的浓度，PF代表胎儿gDNA的目标稀释浓度。

6 引物设计采用Primer Premier软件设计5对正向、反向引物，用于扩增目标DNA序列，覆盖引起ACH、TDⅠ、TDⅡ在内的19个FGFR3突变位点，30种
突变。

7 多重PCR反应通过聚合酶链反应(polymerase chain reation，PCR)对目标DNA片段进行扩增。

PCR工作体系：2×KAPA HiFi HotStart Ready
Mix(Kapabiosystems)12.5μl，引物1μl，模板DNA 1μl(10 ng)，H2O 10.5 μl，最终体系25 μl；PCR工作条件：98℃变性2 min，随后98℃ 10 s，60℃15 s，72℃ 30 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min。

PCR完成后、采用AxyPrepTM磁珠进行0.8×+ 0.7×两步骤纯化，获得目标扩增子。

8 文库制备和DNA测序根据Ion Proton技术标准操作构建DNA文库，首先对PCR产物进行末端修复，使用1.8×体积AxyPrepTM磁珠纯化反应产物；然后在DNA片段的平末端添加接头和标签，随后使用用1.5×体积AxyPrepTM磁珠纯化反应产物；对添加接头的DNA片段进行PCR反应，使用1.5×体积AxyPrepTM
磁珠纯化反应产物，最终得到富集的测序文库。

采用RTQ-PCR和Agilent Bioanalyzer 2100生物分析系统检测文库浓度及文库片段大小，质控标准：文库
片段为100～500 bp。

采用ProtonTM测序平台对质控合格的文库进行高通量测序。

测序完成后，对测序reads进行质控，去掉长度＜40 bp的reads，生成样品对应的astq文件；使用Tmap对生成的fastq文件进行比对，得到bam格式的
比对结果；使用mtools软件的sort模块对结果文件进行排序；使用iTools软件Xamtools模块进行统计，得到比对区域所有位点的4种碱基深度；提取各样本目标SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)位点4种碱基深度，
取最大深度和次大深度当作样品的两个基因型深度，并计算MAF，当MAF＜0.01时，认为是纯合位点。

9 统计学分析使用SPSS16.0统计软件，计量资料采用M(IQR)描述；计数资料采用率(%)描述；以胎儿基因组DNA Sanger测序作为金标准，计算NGS检测方法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及其95%置信区间。

1 胎儿基因组DNA片段化效果检测 ACH、TDⅠ胎儿gDNA片段化产物集中在143.5(136.5 ～148) bp，与生理条件下cff-DNA的分布波峰143 bp基本吻合[8]。

见图1。

2 DNA文库质检结果质检结果显示文库片段位于200～300 bp，主要集中在260～270 bp，符合Proton质控标准。

见图2。

3 Proton测序结果 1)胎儿gDNA浓度为10%、6%、3%时均检出相应突变；胎
儿gDNA浓度为1%时，2例TD、1例ACH未检出相应突变；胎儿gDNA浓度
为0.5%时，仅1例ACH检出相应突变，见表1。

2)图3为1例ACH模拟样本的碱基变异分布图，FGFR3 c.1138(Chr4 1806119)位点以外突变峰均＜1%，或来
源于PCR扩增或NGS测序过程；样本T1-T4(胎儿gDNA浓度分别为10%、6%、3%、1%)c.1138位点突变峰明显高于其他位点，应来源于胎儿，即胎儿携带FGFR3 c.1138 G＞A突变；而样本T5(胎儿gDNA浓度为0.5%)c.1138位点突变峰和其他位点接近，可能与胎儿gDNA浓度过低有关，无法判断胎儿是否携带致
病突变。

胎儿浓度≥3%时，灵敏度为100%(95% CI：81.5% ～100%)；阴性对照均未检出FGFR3致病突变，特异度为100%(95% CI：75.3%～100%)；检测方法的阳性预测值为100%(95% CI：81.5%～100%)，阴性预测值为100%(95% CI：75.3%～100%)。

见表2。

本研究通过建立孕妇血浆游离DNA模型，初步探讨了运用NGS无创产前检测胎
儿FGFR3突变的可行性及检测准确率。

实验结果显示当胎儿gDNA浓度≥3%时，
NGS可以在模拟样本中准确检出胎儿致病突变。

ACH胎儿在11～13+6周NT超声及20～23+6周系统产前超声检查时多无异常，多数在孕晚期超声检查时偶然发现胎儿长骨生长速度明显落后，因此ACH的产前诊断时间主要集中在孕29～35周，个别病例在孕37周后甚至出生后才被确诊[4]。

此外，胎儿四肢长骨短小有多种原因，仅凭超声报告难以将ACH与其他骨骼畸形、染色体异常、胎儿生长受限、正常小于孕龄儿相鉴别[13]。

TD多在孕中期系统超
声检查时出现影像学异常，部分胎儿在孕11～13+6周NT超声检查时即可发现
异常NT增厚、胸廓狭窄、四肢短小)[14]，但因表现无特异性同样难以鉴别诊断；TD属于致死性骨骼畸形，诊断明确后应尽早引产，如能提前诊断，将在一定程度上减轻孕妇痛苦。

FGFR3相关疾病另一显著特征是父龄效应：致病突变多为新发突变，几乎全部来
自父方，当父亲年龄＞35岁时，生育患病后代风险增加。

以ACH为例，与25岁以下组相比父亲生育年龄为25～29岁、30～34岁、35～39岁、≥40岁时，后
代发病风险比值比分别为2.8(95% CI：1.2～6.7)、2.8(95% CI：1.0～7.6)、
4.9(95% CI：1.7～14.3)、
5.0(95% CI：1.5～1
6.1)[1]。

随着国内二胎政策全面放开以及高龄生育人群的增加，包括ACH、TD在内的多种FGFR3相关疾病发病率可能上升。

早前对于疑似ACH、TD胎儿，确诊需采用侵入性产前诊断，胎儿丢失率为
0.5%～1%[15]，难以被部分孕妇特别是珍贵儿孕妇所接受。

基于NGS与cff-DNA的无创产前筛查胎儿非整倍体技术(non-invasive prenatal test，NIPT)因其安全、准确的优势，在全球广泛应用。

无创产前检测ACH、TD等FGFR3相关疾
病已有文献报道，包括聚合酶链式反应-限制性酶切技术[16]、高分辨率溶解曲线[17]、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱[18]等多种方法，均成功在孕妇外周血中检出胎儿FGFR3突变。

但是上述基于图形判读的方法在一定程度上受实验者主
观因素的影响，特别是在cff-DNA浓度较低时，容易得出假阴性的结论，降低检
测准确率。

而NGS数字化的输出形式可以使结果判读更加客观准确，在cff-DNA 浓度较低时优势更加突出。

ACH、TD发病率均在1/10 000左右，而cff-DNA在胎盘娩出后迅速降解，标本采集时间窗口较短，因此孕妇血浆游离DNA十分珍贵。

本研究通过制备模拟样本，完成了实验条件的摸索与优化。

胎儿cff-DNA与母体血浆游离DNA片段分布各
有特点，cff-DNA集中在143 bp左右，而母体血浆游离DNA集中在166 bp左右[8]；我们通过片段化阳性胎儿gDNA，使其片段分布尽可能接近cff-DNA分布规律；相应孕妇均无肝肾功能异常，引产或分娩后妇科超声检查、绒毛膜促性腺激素检查未见胎盘残留，排除了干扰cff-DNA降解的可能因素，产后42 d cff-DNA 已完全降解，此时留取产妇外周血，可以保证母体背景不受干扰；FGFR3相关疾
病属于常染色体显性遗传，致病突变100%外显，阳性胎儿孕妇全部为正常个体，理论上均不携带相应胎儿致病突变，本研究通过检测母体产后gDNA，进一步排
除了母体携带致病突变的可能；通过以上多个环节，保证了混合样本可以最大程度地接近孕有ACH、TD胎儿孕妇外周血的真实情况。

针对胎儿非整倍体的NIPT最早可在孕9周进行，多数实验室将cff-DNA浓度下
限设置在4%[19]，我们在模拟样本中设置了3%的胎儿浓度，与孕早期cff-DNA
浓度相对应：如能在3%的模拟样本中成功检出胎儿致病突变，就有可能在孕早期孕妇外周血中检出胎儿突变，将ACH、TD的产前诊断提前至孕早中期，避免诊断时间滞后带来的处理困难；并且有望与现有NIPT平台融合，进一步降低检测成本。

不仅如此，NIPT本身具有筛选高龄生育人群的作用，在NIPT同时进行胎儿FGFR3基因突变检测，可增加患病胎儿检出率，最大程度减少患儿的出生。

本研究中模拟样本数量较少，仍然需要真实样本进行验证；但实验结果初步证明了NGS技术能够在孕妇外周血模拟样本中检出胎儿FGFR3致病突变，并具有相当的
准确率，提示无创产前检测在单基因遗传疾病产前诊断领域具有良好的应用前景。

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