多菌种发酵甜面酱工艺研究

表3－2 甜面酱感官评定评分表
项目 红褐色、鲜艳、 有光泽 20～18 酱香、酯香、 醇香浓郁、柔 和、无不良气 味 30～27 鲜味突出明显、 柔和、细腻、 咸甜适宜、无 异味 40 ～36 粘稠适度、均 匀，无杂质 10～9 总分 评分及分值范围 红褐色、有光 泽 17～15 酱香、酯香、 醇香浓郁、无 不良气味 26～23 鲜味醇厚、咸 甜适宜、无异 味 35 ～31 粘稠适度，无 杂质 8～7 红褐色、略有 光泽 14～11 有酱香、无不 良气味 22～19 有鲜味、无异 味 30 ～26 偏稀或偏甜， 无杂质 6～5 灰褐色、无光 泽 10～0 酱香味淡、有 异香味 18～0 有酸、苦、涩、 焦糊及其他异 味 25 ～0 偏稀或偏甜， 有杂质 4～0 得分
1.2 国内外的研究概况
1.2.1国内甜面酱的研究概况 国内对甜面酱生产的研究主要集 中在菌种、工艺、设备、新品开发等 几个方面。
1.2.2国外甜面酱的研究概况
国外对甜面酱的研究较多的国家主 要是日本，尤其在菌体数量的测定，制 曲设备的设计和多菌种发酵方面有较多 的文献报道。
1.3 国内甜面酱研究与生产中存在 的问题
1.4 立题意义
（1）甜面酱多由传统方法生产，产品香气醇厚， 风味俱佳，深受人们喜爱。但由于多为家庭式 生产，生产工艺落后，发酵周期长，原料及设 备利用率低，产品质量不稳定，不能满足市场 需要。 （2）随着人们生活水平的提高和甜面酱各种保 健功能的不断被发现，使这一古老的产品焕发 出新的活力，人们对甜面酱产品提出了越来越 高的要求。传统手工作坊式的生产已经不能满 足消费者的需求。
表4－1制曲正交试验设计方案
工艺条件 菌株比例 制曲湿度(%) 制曲时间(天) 制曲温度(℃) 因素 A B C D 实验水平 1 1：1 70 3 25 2 2：1 80 4 30 3 3：1 90 5 35
通过四因素三水平的正交试验来确定制曲工艺的最佳条件。
4.3 多菌种发酵工艺的研究
4.3.1分开制曲多菌种发酵工艺的优化 分开制曲多菌种发酵工艺条件主要包括 接种米曲霉曲和黑曲霉曲的比例、盐水浓 度、发酵时间、发酵温度等。采用四因素、 三水平正交试验表，以理化测定指标和感 官评定分值为指标，考察工艺条件的优选。 发酵工艺水平表见表4–2所示。
3.4 酱醅中总酯含量的测定
总酯用中和滴定法进行测定：先 用碱中和酱醅中的游离酸，再加一定量 的碱使酯皂化，过量的碱再用酸进行反 滴定。
3.5 还原糖含量的测定
本试验采用斐林氏法测酱醅中还原糖 的含量。 原理：还原糖在斐林氏甲、乙溶液中 把高价铜还原为低价铜，以次甲基蓝作指 示剂，用样品稀释液滴定定量的斐林氏甲 乙液，根据消耗量来计算还原糖含量。
3.6 黄曲霉毒素的检测
黄曲霉毒素（Aflatoxins）是在自然界存 在的一些结构特异的真菌的次生代谢产物， 是致癌能力（毒性）最强的毒素，其毒性比 氰化钾还高，被列为极毒。由于黄曲霉毒素 与环境因素密切相关，普通的食物处理方法 不会减少其含量，国际上对黄曲霉毒素的限 量要求也日益严格。因此，霉菌发酵性食品 一个非常重要的安全性指标就是在产品中不 得检出黄曲霉毒素。
1.5 本课题的主要研究内容
本课题的任务是研究用人工接种多菌种 发酵甜面酱代替传统的自然发酵甜面酱的可 能性，其主要内容包括： ①自然发酵生产甜面酱及人工接种制曲 发酵甜面酱曲种的制备 ②甜面酱人工接种单一菌种制曲及发酵 工艺的研究 ③甜面酱人工接种多菌种制曲及发酵工 艺的研究
第二章 自然发酵生产甜面酱及人工接 种制曲发酵甜面酱曲种的制备
表4－3 发酵工艺因素水平表
工艺条件 曲：盐水 盐水浓度(Be) 发酵时间(天) 发酵温度(℃) 因 素 A B C D 实验水平 1 2 3 1：1 1：1.5 1：2 13.5 14.5 15.5 15 25 25 35 35 45
4 5
接种单
产品指标 理 化 指 标
多菌种
国家标准 ≥ 0.3 ≥7 ≤ 2.0 ≤ 50
（3）目前许多企业都在不断的开发酱的品种， 然而新开发的酱类产品，基本上都是在原有 的产品的基础上进行加工或精加工，没有开 发出工艺变革的新产品。 （4）为了我国传统天然发酵甜面酱的生产工 艺加以改革，提高甜面酱的科技含量，对传 统甜面酱发酵过程进行分析，筛选出适合发 酵的典型菌株，进行人工接种发酵，以保证 产品质量，缩短产品的生产周期，从而实现 传统天然发酵甜面酱的规模化生产，满足市 场的需要。
产品
传统法 单菌接种
国家标准
传统法
多菌接种
≥20 卫 生 指 标 菌 菌 (As) (Pb) ≤5 ≤1 ≤5 ≤30
前期工作
1.收集省内农村制作的甜面酱成品，并详细了解农村 制酱的工艺流程和一些需要注意的事项。 2.将收集来的样品进行成分分析，并测定其各种成分 含量，以便后期工作参考。 3.从收集来的甜面酱中分离米曲霉和黑曲霉菌株，并 用分离出的纯种曲霉菌株制作曲种，为后面制曲和 发酵工艺研究做准备。 4.用制作的曲种分别研究单菌种接种制曲和发酵工艺， 初步确定出甜面酱单菌种制曲和发酵的最佳工艺条 件。
多菌种发酵甜面酱生产 工艺研究
第一章 绪论 1.1 甜面酱简介
甜面酱又称面酱或甜酱，是以面粉为主要原料经 过制曲和保温发酵酿制而成的一种酱类风味食品，因其 味咸中带甜而得名。它滋味香甜，鲜味独特，色泽诱人。 它既可作为美味的菜点直接食用，也可用于酱爆、酱烧 及凉拌等多种烹饪方式，同时也是酱制各种酱腌菜的主 要辅料。甜面酱因其独特的口感和风味而深受广大消费 者的喜好和青睐。该产品目前在中国、日本及泰国等东 南亚国家具有巨大的消费市场，在欧美等国也具有一定 的消费市场。
第三章 甜面酱人工接种单一菌种 制曲及发酵工艺的研究
3.1 蛋白酶活力的测定
蛋白酶活力的测定采用福林–酚试剂法。根据 福林（Folin）试剂（磷钼酸和磷钨酸混合物）， 在碱性情况下极不稳定，可被酚类化合物还原而呈 蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质分 子中含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸及苯丙 氨酸等），能使蛋白质或其水解产物也呈蓝色反应， 于是就可利用这个原理来测定蛋白酶活力的强弱。
3.8.3 湿度对优选菌株产酶的影响 将两种曲种分别接种小麦，通过控制不 同的培养湿度，然后每天测量酱曲中蛋白酶 和淀粉酶活力的大小，确定两种曲种制曲的 最适产蛋白酶和产淀粉酶湿度。
3.9 优选菌株发酵工艺的研究
3.9.1 发酵工艺条件优化的正交试验 甜面酱发酵工艺条件主要包括接种菌 的接种量、发酵时间、发酵温度、盐水浓 度等。采用四因素、三水平正交试验表， 即L9（34）进行正交试验，以总酸、氨基酸 态氮、还原糖、总酯含量的测定和感官评 定分值为指标，考察工艺条件的选用。发 酵工艺因素水平表见表3–1所示。
色泽
香气
滋味
体态
第四章 甜面酱人工接种多菌种制 曲及发酵工艺的研究
4.1 多菌种制曲方法 多菌种制曲方法有两种，一种是分开 制曲（即同单菌种制曲一样，最后将不同菌 种制得的曲按一定的比例混合），另一种是 混合制曲。
4.2 多菌种制曲工艺的优化 分开制曲工艺的优化前一章已经研究过， 在这里主要讨论的是混合制曲。 为了确定所要接种的菌株的比例，以及最 佳制曲条件，以蛋白酶活力和糖化型淀粉酶活 力为指标，设计了如下表4–1的四因素三水平L9 （34）正交试验。
表4－2发酵工艺因素水平表
工艺条件 米曲：黑曲 盐水浓度(Be) 发酵时间(天) 发酵温度(℃) 因 素 A B C D 实验水平 1 1：1 13.5 15 25 2 2：1 14.5 25 35 3 3：1 15.5 35 45
4.3.1混合制曲多菌种发酵工艺的优化 混合制曲多菌种发酵工艺条件主要有 曲与盐水的比例、盐水浓度、发酵时间、 发酵温度等。采用四因素、三水平正交试 验表，以理化测定指标和感官评定分值为 指标，考察工艺条件的优选。发酵工艺水 平表见表4–3所示。
3.8 甜面酱单菌种制曲工艺的研究
3.8.1 温度对优选菌株产酶的影响 将前面制得的两种曲种分别接种小麦， 通过每天测量酱曲中蛋白酶和淀粉酶活力大 小，确定两种曲种的最适产蛋白酶和淀粉酶 温度。
3.8.2 时间对优选菌株产酶的影响 将两种曲种分别接种小麦，通过每天测 量酱曲中蛋白酶和糖化型淀粉酶活力的大小， 确定两种曲种制曲产蛋白酶和产淀粉酶活力 达到最大值时的时间。
2.1甜面酱自然制曲发酵工艺 浸小麦→常压蒸麦→自然接种制面酱 曲→晒干粉碎→加盐水发酵→后发酵
2.2 成品甜面酱中菌种的分 离纯化
分别对甜面酱成品进行取样，采用 稀释涂布平板法和挑取单菌落到斜面上， 对样品进行分离、纯化。直至最后得到 纯的米曲霉和黑曲霉斜面。
2.3 甜面酱曲种的制备
将前面分离纯化得的纯的米曲霉和黑曲 霉分别接到蒸熟后摊凉的小麦上,待其培养4 至5天后（长满孢子）,放入45℃ 烘箱中干 燥24小时,然后放入4 ℃左右的冰箱中保存 备用。
表3－1发酵工艺因素水平表
工艺条件 盐水浓度(Be) 曲与盐水比 例 发酵时间(天) 发酵温度(℃) 因 素 A B C D 实验水平 1 2 3 13.5 14.5 15.9.2 发酵工艺的考察
3.9.2.1 酱醅中各种成份指标的测定 总酯、氨基酸态氮、还原糖含量的测 定（测定方法见上面） 3.9.3.2 感官评价 邀请10名学生组成评价小组，对不同 工艺最后所得的甜面酱进行色、香、味， 体进行评价，并进行综合打分。
3.2 糖化型淀粉酶活的测定
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀 粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4葡萄糖 苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基, 能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠酸化后 析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算 出酶活力。
3.3 氨基酸态氮的测定
氨基酸具有酸性的－COOH基和碱性的－ NH2基。它们互相作用而使氨基酸成为中性 的内盐。当加入甲醛溶液时，－NH2基与甲 醛结合，从而使碱性消失。这样就可以用 强碱标准溶液来滴定－COOH基，并采用间 接的方法测定氨基酸的总量。 本试验氨基酸态氮测定采用双指示剂甲 醛滴定法。
⑴对发酵菌种未作系统性的研究，相关发 对发酵菌种未作系统性的研究， 对发酵菌种未作系统性的研究 酵机理不明确 ⑵发酵酱制品生产工艺落后，工业化程度 发酵酱制品生产工艺落后， 发酵酱制品生产工艺落后 较低 ⑶新型、高附加值产品较少，竞争力不强 新型、 新型 高附加值产品较少， ⑷科技创新投入不足，科技创新及转化能 科技创新投入不足， 科技创新投入不足 力较弱 ⑸品牌不响，企业不强 品牌不响， 品牌不响
本试验中分离得到的米曲霉和黑曲霉均属 于黄曲霉菌群，也存在产生毒性产物的可能性。 因此，必须对菌株能否产生黄曲霉毒素进行检 测，以确保人工接种发酵产品的安全性。 黄曲霉毒素的检测方法包括：薄层层析法、 高效液相色谱法、酶联免疫吸附免疫法、免疫 亲和层析柱净化法等。本试验黄曲霉毒素检测 采用薄层色谱法。