激光共聚焦系统使用说明 Imager Vario LSM

共聚焦显微镜操作入门指南
(仅供内部使用)
文档作者：李宇(liyu@) 日期：2012-12-04
文档校对：李宇日期：2012-12-04
卡尔蔡司中国
版权所有不得复制
目录
1开机 (1)
1 .1接通总电源 (1)
1 .2打开激光器 (1)
1 .3打开控制器、主控电脑 (1)
2使用激光共聚焦扫描软件Zen 2010 (2)
2 .1打开软件 (2)
2 .2切换到明场观察模式（目镜筒） (2)
2 .3放入样品并在明场模式下找到焦平面 (3)
2 .4切换到共聚焦扫描模式 (6)
2 .5设置激光扫描参数，找到样品最亮的焦平面位置 (6)
2 .6设置Z-stack扫描上下限 (8)
2 .7开始扫描 (10)
2 .8分析扫描结果，进行三维观测 (11)
3关机 (15)
4附：目镜中，使用明场、暗场和偏光模式观察样品 (16)
4 .1明场模式 (16)
4 .2暗场模式 (17)
4 .3偏光模式 (17)
5附：使用相机（CCD）拍摄明场、暗场和偏光图 (18)
5 .1拍摄明场图 (18)
5 .2拍摄暗场图 (19)
5 .3拍摄偏光图 (19)
1 开机
1 .1接通总电源
图 1 从左至右依次为：墙体总电源、稳压器电源、激光器和电脑电源
1 .2打开激光器
图 2 转动激光器钥匙，打开激光器，LED指示灯亮
1 .3打开控制器、主控电脑
图 3 依次打开左图显微镜主机控制器电源、右图电脑主机电源
提示：当仅使用CCD拍图，或
者长时间不用机器时，建议关闭
激光器，以延长其寿命。

2 使用激光共聚焦扫描软件Zen 2010
2 .1打开软件
双击图标，然后点击“Start System ”进入软件。

2 .2切换到明场观察模式（目镜筒）
2 .2.1 在共聚焦软件中切换为明场观察模式：点击“
Locate ”标签，选择“Online ”，点击“BF ”（Bright Field 的缩写）。

此时系统打开卤素灯，并将明场光学模块转入光路。

图 4 切换为明场观察模式
提示：如果出现硬件通讯问题，软件左下角会弹出信息对话框，此时一般的解决方法是：1）重启Zen 软件；2）如果仍无效，
关闭整个系统，过5分钟后再重启系统。

2 .2.2 将拉杆推入，光束将会被导入到目镜筒，进入目镜筒明场观察模式：
2 .3放入样品并在明场模式下找到焦平面
2 .3.1 首先确保放入以及取出样品之前，确保转换为5x 物镜：
2 .3.2 物镜的转换可以通过：Zen 2010软件、显微镜TFT 控制屏、物镜转换快捷键实现：
图 5 显微镜主控台（包括TFT 控制屏，以及调焦旋钮）。

（建议在熟练之后，眼睛不离开目镜，通过物镜转换快捷键来转换物镜）
注意！一定要在5x 物镜下放、取样品，否则有撞坏物镜的风险！！！
物镜转换快捷
注意！在不熟练物镜转换快捷键时不建议使用，以免错误操作撞坏物镜！！！
2 .3.
3 通过Z-AXIS 控制面板的UP 和DOWN 按钮上下移动显微镜找焦平面，UP 方向将显微镜向上移，而
DOWN 方向反之（图 6），此过程中一定要同时通过目镜筒观察是否已经接近焦平面。

（图 6右图）。

图 6 Z-AXIS 控制面板
图 7 通过目镜筒确定是否到达焦平面
提示：如果此时通过目镜筒看不到任何光，请检查显微镜TFT 控制屏的光路切换窗口是否选择光路到达Tube （也就是目镜）（参看图 8）
注意！在使用控制面板UP 和DOWN 找焦平面时，眼睛一定要同时在目镜通中观察！
2 .3.4 通过在TFT 屏中点击
按钮，切换光路至Tube （目镜）或者Side Port （
相机CCD ）；
图 8 显微镜TFT 控制屏光路切换窗口（示意）：通过目镜观察或者激光扫描时，需要切换到
Tube （左图）；通过CCD 观察时，需要切换到Side Port （右图）。

2 .3.5 从低倍物镜依次转换到高倍物镜，并通过X.Y STAGE 的摇杆或微调旋钮找到感兴趣的样品区域。

图 9 显微镜主控台（包括TFT 控制屏，以及调焦旋钮）。

图 10 载物台方向(X-Y STAGE)控制面板
物镜转换快捷键
提示：为了便于在高倍下找到焦平面，强烈建议依次转换物镜，并在每次转换物镜后，通过调焦旋钮找到较清晰的焦
平面，之后再转换到下一物镜。

调焦旋钮
微调
粗调
粗调速度控制
2 .4切换到共聚焦扫描模式
2 .4.1 在共聚焦软件中切换为共聚焦观察模式：点击“Locate”标签，选择“Online”，点击“Confocal”按钮。

此时系统将关闭卤素灯，将明场光学模块转出光路，确保激光不会反射进入目镜筒。

图11 进入共聚焦扫描模式
2 .4.2 将切换拉杆拉出，保证激光将到达样品。

2 .5设置激光扫描参数，找到样品最亮的焦平面位置
2 .5.1 进入“Acquisition”标签，设置如下参数：
1. “Z-Stack”打钩选中（该选项位置在Start Experiment左边）
2. Acquisition Mode → Frame size: 512 X 512
Speed: 8
3. Channels → Laser 405 选中
405nm激光强度: 5%
Pinhole: Max
Gain (Master) : 500
Digital Offset: 2
图12 激光扫描参数设置界面
(或直接可以点击快捷方式，一键直接完成以上参数的自动设置：)
1.点击Acquisition Mode
2.点击load acquisition configuration；
3.选中configuration；
然后，2.5.1中的参数会自动完成设置。

2 .5.2 点击Live按钮，进入预览状态，并激活“Range Indicator”选项。

预览图像中出现的红点表示曝光过度的区域，蓝点表示曝光不足的区域。

设置：
Channels Pinhole: 0.3AU （该选项可以保证最高的分辨率，适用于较平的样品！如果样品表面
粗糙度比较高，可适当调大Pinhole孔径的大小）
Gain (Master) : 减小，直到刚刚不出现红点；
图13 调节Gain值设置
2 .5.
3 上下调焦，确保在样品最高点和最低点之间所有的位置都不会出现曝光过度，以及曝光不足的现象，最好是刚刚没有红点，也刚刚没有蓝点，即表明扫描参数设置合适。

图14 上下调焦的两种方式：左图为在软件中调节，右图为在TFT中调节
2 .6设置Z-stack扫描上下限
2 .6.1 顺时针调节调焦旋钮（参看图9），直到预览图像刚变成全黑，此时焦平面刚高于样品的最高点。

点击“Set First”按钮。

图14 设置扫描First位置
2 .6.2 逆时针调节调焦旋钮，直到预览图像刚变成全黑，此时焦平面刚刚低于样品的最低点。

点击“Set Last”按钮。

图15 设置扫描Last位置
2 .6.
3 点击Stop停止预览模式，点击“optimal”自动设置优化扫描步长。

图16 设置优化扫描步长
2 .7开始扫描
2 .7.1 点击“Start Experiment”开始激光共聚焦扫描。

此时切忌碰到防震台，否则出现震动条纹！
图17 开始扫描
2 .7.2 在扫描过程中，可以选择进入Gallery 标签，并激活“Range Indicator ”，以便直观显示扫描进度。

图 18 Gallery 视图
2 .8分析扫描结果，进行三维观测
2 .8.1 扫描结束后，进入“Topo ”标签，进行三维观测。

需要设置以下参数（请参看下面的屏幕截图）：
Dimensions → Channels → Ch1 → LUT → Rainbow2 （可选） Display → Filter → Average Pixels
→ 5或7 （值越大平滑去噪效果越好，但细节损失。

建议选5或7）
Generate → Z-Range … → Automatic 选中 （一般缺省选中，同下） Invert 选中（一般缺省选中，但如果误操作取消后，结果即不对） Fill holes 选中（一般缺省选中，同上） Tilt … → Pitch : 0 （一般缺省选中，同上）
Tile … → Yaw: 0 （一般缺省选中，同上）
点击 选中Range Indicator
2 .8.2 三维视图控制：可以通过三维图左边和下边的滑轮来调节三维视图缩放、视角等：
图19 三维视图控制
2 .8.
3 粗糙度测量、体积测量等
2 .8.4 轮廓线测量工具等
2 .8.5 导出结果：
1. 3D图片：
选择主菜单File → Export，然后选择：
Format → Tagged Image Fille
Data → Contents of image window – single plane （三维图）
2.原始.czi格式文件（可以用ZEN软件打开，进行测量等），选中要保存的图片，点击保存即可
3.保存3D图原始数据：点击3D标签→选中Grid→右键单击图像，选择Export grid
3 关机
以开机的反顺序，依次关闭软件、电脑、显微镜主机控制器电源、载物台控制器电源、激光器钥匙，并待激光器冷却约5分钟后，再关闭激光器电源，以及总电源。

4 附：目镜中，使用明场、暗场和偏光模式观察样品
4 .1 明场模式
4 .1.1 首先确定TFT显示屏的光路和拉杆位置分别如下图：
4 .1.2参数设置：
a.确保RL Illumination处于On的状态；
b.调节卤素灯亮度；
c.点击Reflector选中BF
d.在Objective中选择5x物镜聚焦（如何聚焦参照P5，2.3放入样品并在明场模式下找到焦平面），然后逐步切换到高倍物镜。

！注意：切换物镜过程中确保当前物镜聚焦清楚在切换到下一高倍物镜。

4 .2 暗场模式
4 .2.1除在4.1.2-c步骤Reflector中选DF（Dark Field）外，其他步骤与设置明场观察方式相同。

注意：因为暗场光源是斜照在样品表面，为取得最佳的观察效果，建议调高卤素灯亮度，即电压值!
4 .3 偏光模式
4 .3.1除在4.1.2-c步骤Reflector中选POL（Polarization）外，其他步骤与设置明场观察方式相同。

！！注意：将起偏器推入到光路中（如下图），旋动起偏镜旋钮到90°观察。

！！注意：不用偏光观察模式时，将起偏器拉出（如下图）！！
5 附：使用相机（CCD）拍摄明场、暗场和偏光图
5 .1拍摄明场图
5 .1.1 如“4.1明场观察”操作，在TFT屏中设置相关参数并调焦；
5 .1.2 切换光路，如下图
5 .1.3 打开AxioVision软件，
注意！AxioVision软件和ZEN软件不能同时运行，在开AxioVision软件之前确保ZEN关闭！
5 .1.4 打开软件后，如下图操作，
a.点击预览打开预览窗（Live）；
b.点击曝光时间（Exposure），进行自动曝光；
c.点击白平衡（White Balance），进行自动白平衡；
d.点击拍摄（Snap），获取图片然后保存
蔡司共聚焦显微镜操作入门指南
5 .2 拍摄暗场图
5 .2.1 如“4.2暗场观察”操作，在TFT屏中设置相关参数并调焦；
5 .2.2 剩余步骤如5.1.2-5.1.4；
5 .3 拍摄偏光图
5 .3.1 如“4.3偏光观察”操作，在TFT屏中设置相关参数并调焦；
5 .3.2 剩余步骤如5.1.2-5.1.4；
仅供内部使用19。