高效液相色谱法测定牛膝颗粒中5-羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的含量

高效液相色谱法测定牛膝颗粒中5-羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的
含量
赵变;郭红云;常珍珍;孙祥德
【摘要】提出了高效液相色谱法同时测定牛膝配方颗粒中5-羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的含量的方法。

采用SHIMADZU shim-packVP—ODS（4．6mm×250mm，4．6μm）柱；用两种不同配比的乙腈和水混合溶液作为流动相，梯度洗脱；检测波长为279nm（5-羟甲基糠醛）和245nm（蜕皮甾酮）。

5-羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的质量浓度分别在0．390-100mg·L-1和3．125～100mg·L-1范围内与峰面积呈线性关系，方法的检出限（3S／N）分别为1．95，2．01ng。

5-羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的平均回收率分别为99．7％，99．1％；相对标准偏差（n=5）分别为0．80％，0．67％。

%HPLC was applied to the simultaneous determination of 5-hydroxymethylfurfural and ecdysterone in granules of radix achyranthis bientatae for making up prescriptions. SHIMADZU shira pack VP-ODS column （4. 6 nm×250 mm,4.6μm） was used for separation. Mixtures containing acetonitrile and water mixed in different ratio were used as the mobile phase in gradient elution. UV-detection at the wavelengths of 279 nm （for 5-hydroxymethylfurfural） and 245 nm （for ecdysterone） was adopted in the determination. Linear relationships between values of peak area and mass concentration of 5-hydroxymethylfurfural and ecdysterone were obtained in the ranges of 0. 390--100 mg·L-1 and 3. 125-100 mg·L-1 , with detection limits （3S/N） of 1.95 ng and 2.01 ng respectively. Results of recovery and precision found were： values of average recovery of 99. 7% for 5-hydroxymethylfurfural
and 99.1% for ecdysteronen with values of RSD＇s （n = 5） 0.80% and 0.67% respectively.
【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2012(048)005
【总页数】4页(P580-582,586)
【关键词】高效液相色谱法;牛膝配方颗粒;5-羟甲基糠醛;蜕皮甾酮
【作者】赵变;郭红云;常珍珍;孙祥德
【作者单位】河南新乡医学院药学院,新乡453003;新乡医学院三附院,新乡453003;河南新乡医学院药学院,新乡453003;河南新乡医学院药学院,新乡453003
【正文语种】中文
【中图分类】O652.63
Abstract：HPLC was applied to the simultaneous determination of 5－hydroxymethylfurfural and ecdysterone in granules of radix achyranthis bientatae for making up prescriptions．SHIMADZU shim－pack VP－ODS column（4．6mm×250mm，4．6μm）was used for separation．Mixtures containing acetonitrile and water mixed in different ratio were used as the mobile phase in gradient elution．UV－detection at the wavelengths of 279nm （for 5－hydroxymethylfurfural）and 245nm （for ecdysterone）was adopted in the determination．Linear relationships between values of peak area and mass concentration of 5－hydroxymethylfurfural and
ecdysterone were obtained in the ranges of 0．390－100mg·L－1 and 3．125－100mg·L－1，with detection limits（3S／N）of 1．95ng and 2．01ng respectively．Results of recovery and precision found were：values of average recovery of 99．7%for 5－hydroxymethylfurfural and 99．1%for ecdysteronen with val ues of RSD′s （n ＝5）0．80%and 0．67%respectively．
Keywords：HPLC；Radix achyranthis bientatae granule；5－Hydroxymethylfurfural；Ecdysterone
牛膝为苋科植物牛膝的干燥根。

用于腰膝酸痛、筋骨无力、眩晕等症［1］的治疗。

牛膝配方颗粒由牛膝中药饮片经现代制药工艺提取、浓缩、干燥、制粒而成。

蜕皮甾酮为牛膝中主要的活性成分，具有促进蛋白质的合成，抑制由于药物引起的血糖升高等功效［2］。

5－羟甲基糠醛也是怀牛膝中的化学成分，据报道，5－羟甲基糠醛的含量与牛膝
的泛糖程度有关［3－4］。

目前，关于牛膝中蜕皮甾酮和5－羟甲基糠醛的单组
分含量测定已有报道［5－6］。

但牛膝配方颗粒中蜕皮甾酮、5－羟甲基糠醛含量测定还未见报道，更没有同时测定的报道。

本工作采用高效液相色谱法测定牛膝配方颗粒中的5－羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的含量，以期能应用于牛膝配方颗粒的质量控制。

SHIMADZU LC－6AD 型高效液相色谱仪，SPD－20A型紫外－可见光检测器。

对照品混合溶液：称取蜕皮甾酮对照品10．0mg，用甲醇溶解并稀释定容至
10mL，配成1．000g·L－1蜕皮甾酮对照品储备溶液。

称取5－羟甲基糠醛对照
品11．0mg，用甲醇溶解并稀释定容至11mL，配成1．000g·L－1 5－羟甲基糠醛对照品储备溶液。

再分别移取两种储备液适量配成不同浓度对照品的混合溶液。

所用试剂均为色谱纯，试验用水为自制三蒸水。

SHIMADZU shim－pack VP－ODS 色谱柱（4．6mm×250mm，4．6μm）；5－羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的检测波长分别为279，245nm；柱温为30℃，进样
量20μL；流动相A为乙腈，B为水；梯度洗脱程序：开始时 A 为9%；10min时，A 为20%；25min时，A为25%。

样品溶液：分别取不同厂家牛膝配方颗粒，研细，称取粉末1．000g，置具塞锥
形瓶中，加入甲醇（1＋1）溶液20mL，超声提取40min，冷却后补足质量。

摇匀，过0．22μm微孔滤膜，移取续滤液作为样品溶液。

移取样品溶液和混合对照品溶液20μL，在仪器工作条件下进行测定。

在色谱条件下，5－羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的保留时间分别为7．760min和22．155min。

以5－羟甲基糠醛峰计算，理论塔板数不低于2 000，两组分的分
离度均大于1．5。

对照品溶液和样品溶液的色谱图见图1。

试验比较了回流提取法、索氏提取法以及超声提取法3种不同提取方法，3种提取法提取效果接近，试验选用超声提取法。

考察了30，40，60min不同提取时间，甲醇（1＋1）、甲醇（80＋20）、甲醇、乙醇（95＋5）、乙醇（1＋1）、正丁
醇不同提取剂的提取效果，试验选用甲醇（1＋1）溶液超声40min作为供试品溶液的提取方法。

经紫外扫描，5－羟甲基糠醛和蜕皮甾酮最大吸收波长分别为279，245nm，因此，试验选择5－羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的检测波长分别279nm和245nm。

试验考察了甲醇－水、甲醇－0．1%（体积分数，下同）乙酸、乙腈－水、乙腈
－0．1%乙酸等不同的流动相。

结果发现：加入0．1%乙酸时，5－羟甲基糠醛与相邻的峰分离不好，峰形差；当以甲醇－水为流动相时，由于甲醇的洗脱能力较乙腈弱，所以需要大比例甲醇，但会造成梯度洗脱时基线漂移，引起峰面积积分不准；而采用乙腈－水为流动相时，基线平稳，峰形及分离度都较好。

试验选择以乙腈和水为流动相梯度洗脱，优化的梯度洗脱程序见1．2节。

按试验方法对对照品混合溶液系列进行测定，5－羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的质量浓度分别在0．390～100，3．125～100mg·L－1范围内与其峰面积呈线性关系。

5－羟甲基糠醛和蜕皮甾酮线性回归方程分别为 y＝6．829×10－6 A－0．587，
y＝3．675×10－5 A－1．450，相关系数均为0．999 9。

在色谱条件下，以3
倍信噪比计算5－羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的检出限分别是1．95ng和2．01ng。

移取25mg·L－1对照品混合溶液，连续进样5次，测定峰面积，计算日内相对标准偏差（RSD）；在相同条件下，连续5d进样，测定峰面积，计算日间RSD。

结果，5－羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的RSD日内（n＝5）分别为1．70%和1．59%，RSD日间（n＝5）分别为1．26%和3．36%。

取1份A厂批号为1001251S牛膝颗粒，按试验方法制备溶液后，在色谱条件下，分别在0，2，4，6，12，24h 进样测定。

RSD 分别为 1．59% 和1．98%。

表
明供试品溶液至少在24h内稳定。

取5份已知含量的B厂（批号为1004085）配方颗粒粉末，按试验方法制备溶液后分别加入对照品溶液，在色谱条件下进样测定，5－羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的平均回收率分别为99．7%和99．1%，RSD分别为0．80%和0．67%，测定结果见表1。

按试验方法，对两个不同厂的不同批次的6个批号的样品进行分析，结果见表2。

结果表明：不同厂家牛膝配方颗粒中的5－羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的含量差异较大，配方颗粒的质量不稳定。

国家药监局曾出台过《中药配方颗粒质量标准研究的技术要求》，但现有的质量标准都是企业自行制定的，各生产厂家由于原料来源不同，制备方法和工艺各异，检验标准也不同，质量可能参差不齐。

因此，有必要建立全国统一的中药配方颗粒的检测标准。

另外，5－羟甲基糠醛大量存在会对人的横纹肌造成一定的伤害，《中国药典》对部分中药中的5－羟甲基糠醛有含量限度规定，所以在对牛膝配方颗粒进行质量标准的完善时应该增加对5－羟甲基糠醛含量的限
量标准，以确保药材的质量。

【相关文献】
［1］国家药典委员会．中国药典：一部［M］．北京：中国医药科技出版社，2010：35，67．［2］ MICHAEL D，COURREUR T，LENAERTS V，et al．Effects of ecdysterone on the differentiation of normal human keratinocytesin vitro［J］．Eur J Dermatol，1994，4（7）：558－560．
［3］刘振丽，宋志前，王淳，等．泛糖程度不同的牛膝中5－羟甲基糠醛含量测定［J］．中国中药杂志，2009，34（3）：298－300．
［4］梁生旺，王静，王淑美，等．牛膝“泛糖”机制研究［J］．中草药，2003，34（11）：993－996．
［5］孟大利，侯柏玲，汪毅，等．中药牛膝中的植物甾酮类成分［J］．沈阳药科大学学报，2006，23（9）：562－564．
［6］林大专，王广树，杨晓红，等．牛膝中新蜕皮甾酮类成分的研究［J］．中国药学杂志，2006，41（17）：1295－1297．。