T-SPOT_TB操作说明电子版
T-SPOT介绍
Erkens J ERJ 2010
结核病常规诊断技术
• •
接触史
• • •
X射线
•
特异性差 主观 肺外结核难
不能区分NTM PTB近半阴性 肺外结核难
涂片 镜检
结核 诊断
抗体检测
试剂灵敏度低； 不能区分既往感 染和发病病人 操作复杂 技术要求高 涂阴PTB检出低 肺外结核难
• • •
耗时长 涂阴PTB检出低 肺外结核难
– 陈旧性结核体内会存在记忆T细胞，但记忆T细胞在全血中的数量 非常少，而且抗原再次激活孵育时间远远超过24h，不会因为记忆 细胞的存在而产生斑点 – 文献显示，大概只有38%左右的活动性结核患者经过治疗，TSPOT结果会转阴
Chee et al. , AJRCCM (2006)（I结核感染的区别 LTBI危险因素 结核中有20%左右的肺外结核，诊断困难 传统结核诊断方法不能满足临床需要
内容
结核病基础概念 T-SPOT.TB 产品知识
T-SPOT.TB 临床应用
病例分享
T-SPOT®.TB原理
T-SPOT®.TB原理：结核感染者体内存在特异的效 应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原 （ESAT-6，CFP 10）刺激时会分泌多种细胞因子 （ IFN-γ ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结 核病或结核潜伏感染者的诊断
活动性与潜伏性结核感染患者中 ，T-SPOT.TB斑点数比较
活动性与潜伏性患者中T-SPOT.TB斑点 数的比较(TST+和 TST-)
斑点数的意义—现症感染
• 之前得过结核治愈了，T-SPOT结果如何？
T-SPOT检测的是现症感染。如果彻底治愈，体内无结核 分枝杆菌，则结果阴性；如果结果是阳性，则说明患 者体内还存在结核分枝杆菌，还在结核感染中
T-SPOT.TB
优势
• 该检测方法采用的结核杆菌特异性抗原为ESAT-6和CFP-10，其编 码基因RD1在BCG（卡介苗）和绝大多数非结核杆菌中是缺失的， 因此较好的避免了交叉抗原反应，提高了特异性。
原理
1.从全血中分离出外周血单个核细胞PBMCs 2.将样本加入反应孔，每个样本需要4个检 测孔：
①空白对照为了判断非特异细胞的活化反应 ②结核特异抗原A，Panel A(ESAT-6) ③结核特异抗原B，Panel B(CFP 10) ④植物血凝素PHA对照，用于判断PBMC活性
结果
前提：通常正常结果，空白对照孔没有或 有很少的斑点而植物血凝素PHA对照孔斑 点数超过20个。 1.阳性结果：
①空白对照孔斑点数为0～5个且（抗原A或抗原B斑点 数)-（空白对照孔斑点数）≥6 ②空白对照孔斑点数6-10个时且（抗原A或抗原B斑点 数）≥2倍空白对照孔斑点数
2.阴性结果：
不符合上述标准且对照孔正常
• 3.虽然ESAT-6和CFP10在所有的BCG菌株， 以及绝大多数环境分枝杆菌中缺失，但TSPOT.TB的阳性结果有可能是堪萨斯、苏氏、 戈登或海分枝杆菌的感染引起的。
临床应用
传染科/感染科： 1.2-3周以上的不明原因发热病人的结核感 染排筛 2.免疫力低下患者肺外结核的辅助诊断 卡介苗接种人群的结核感染筛查 3.HIV感染者并发结核的筛查 T-SPOT.TB不受CD4细胞计数水平的影响， 避免了HIV感染后细胞免疫功能受损而导致 的假阴性结果。
T-SPOT.TB
关于原理与临床应用的ຫໍສະໝຸດ 述• T: T细胞 • SPOT：ELISPOT (enzyme-linked immunospot assay；酶联免疫斑点 技术)是一种从单细胞水平检测分泌抗体或细胞因子细胞的免疫学 新技术。原理是用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子，并以酶联 斑点显色的方式将其表现出来。 • TB：结核杆菌
r干扰素释放试验检测方法培训PPT精选文档
AID
20
T-SPOT.TB 结果判读
A B C D
< 10 斑点相减
> 20
通常正常结果，空白对照孔没有或很少斑点（<10个），阳性质控对照孔斑点数 >20个。
21
T-SPOT.TB 结果判读
N孔斑点数 >10 ≤5
6≤N≤10
P孔斑点数 任何值 ≥20 ≤19 ≥20 ≤19
T孔-N孔斑点数 任何值
(刺激所有T细胞都能释放r-干扰素)
6
IGRA中特异结核抗原
结核杆菌RD区特异抗原：
• ESAT-6: Rv3875编码 结核分枝杆菌早期分泌抗原
• CFP-10: Rv3874 编码 结核分枝杆菌培养滤过蛋白10
Rv3874 (CFP-10) Rv3875 (ESAT-6)
Rv3871～Rv3879
8
其他试剂
无菌Ficoll淋巴细胞分离液（建议分装使用）
1 × PBS洗液（pH7.2-7.4）： 可配置10×PBS母液，稀释使用，0.22um滤膜过滤灭菌
双蒸水或去离子水（高压灭菌或0.22um滤膜过滤灭菌）
细胞培养液：建议分装使用 RPMI1640培养液
台盼蓝染液（0.4%）或其他细胞染色液
• 所需细胞悬液：
A（ul）=（2.5×0.5/ 细胞计数）×1000µl 补加体积（ul）= 500-A
• 注：手工计数细胞数不得低于50个； 机器计数不得低于2.5×106/mL。
16
第五步：铺板
可拆卸板（按样本数取出相应条数） 避免交叉污染、混匀细胞悬液
25万个细胞/孔 （100ul）
细胞培养箱（37度） 16-20h（过夜）
45度角 缓慢加入淋巴细胞分离液
结核感染T细胞检测
T-SPOT.TB高灵敏度
种类
活动性结核/ 灵敏度
内容摘要
将T-SPOT.TB的检测结果与最后通过涂片和培养确诊的结 果进行比较。包括牛型结核杆菌和非洲型结核杆菌感染的 患者。T-SPOT.TB的灵敏度为97.2%。（CI 90.3-99.7%）
在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度 为94%。
87
Lee et al.
ERJ 2006; 28:24–30
30
Clark et al. Clin. Exp.
Imm.
2007; 150(2):238-44
140
Kang et al Chest.
2007 Sep;132(3):959-65
抗原刺激后分泌γ 干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放γ 干扰素的T淋巴
细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个分泌细胞，计算出抗 原特异性细胞的频率。
空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点数 大于20时视为试验有效
Immunol 2008; 15;168-
71
T-SPOT.TB高特异性 检测所用的ESAT-6＆CFP 10抗原均来自结核
分枝杆菌基因组RD1区域，RD1区基因仅存在于结 核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）。 卡介苗和大多数环境分枝杆菌缺失RD1区基因 因此 T-SPOT.TB不会受卡介苗或者非结核分枝杆 菌影响。
32
Kim et al. Arch Intern
Med.
T-SPOT.TB产品简介
结核感染T细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB）一、T-SPOT.TB产品介绍我国是世界上仅低于印度的第二大结核病国家。
受限于检测手段，中国的结核感染率较难准确统计，2009年流行病调查结果为总人口的44.5% （因采用PPD检测，假阳性较多）。
而年新发活动性结核患者超过107万人次，年死亡人数达13万。
结核病的早期快速诊断已经成为制约结核病控制的关键因素。
目前，常规结核感染实验室检测方法诊断检出率不到50％。
2011年7月20日，世界卫生组织（WHO）发出正式声明，要求禁止将血清学检测方法用于肺结核和肺外结核的诊断。
因此，开发特异、敏感、快速、简便的结核病感染的诊断方法已经成为全球共识。
结核感染T细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB））是由英国Oxford Immunotec 公司研发生产的体外诊断产品，用于结核感染的筛查，结核病辅助诊断及疗效评价等。
它改变了以往的结核检测方法特异性低，敏感度差，耗时长的缺点。
作为当前全球最先进的结核感染诊断产品，该产品已经成为发达国家结核感染检测的首选方法，获得欧盟CE 认证、美国FDA认证。
美国CDC、美国胸科学会、英国及欧洲的结核病防治指导原则中，均已将本试剂盒方法列为结核感染诊断的推荐实验室诊断标准，并已经在欧洲（英国、德国、法国、意大利、瑞士、西班牙、爱尔兰、荷兰、丹麦、挪威、瑞典）、北美洲(加拿大、美国)、非洲（南非）、澳大利亚、亚洲（韩国、新加坡、日本、中国）等国家均已上市销售，并写入部分国家的诊疗指南中。
T-SPOT.TB用于结核感染的诊断与鉴别诊断具有独特优势：高灵敏度和特异性:特异性达到97.1％（美国FDA临床研究数据），敏感度达到95.6％（美国FDA临床研究数据），不受环境分枝杆菌感染和卡介苗（BCG）接种影响基本不受机体免疫抑制影响，适用于HIV感染和免疫抑制剂治疗人群简单的实验室血液检查，24小时快速报告结果结核感染T细胞检测试剂盒（T-SPOT.TB）应用的方法学为酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。
结核感染T细胞检测方案
32
Kim et al. Arch Intern
Med.
2007; 167;20:2255-2259
186
Kim et al. Am J Med
2009；122, 189-195
58
Janssens et al ERJ
2007；30(4):722-8
32
Dominguez et al Clin
Vacc
结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异
抗原刺激后分泌γ 干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放γ 干扰素的T淋巴细
胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个分泌细胞，计算出抗原 特异性细胞的频率。
空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点 数大于20时视为试验有效
Diseases
2009,9:60
6.结论
T-SPOT.TB在诊断结核感染方面具有良好的敏感 性和特异性，在现有结核诊断方法存在缺陷的今 天， T-SPOT.TB 可以给临床诊断提供参考。
基于结核抗原特异性T细胞向病变部位集中的特点 ， T-SPOT.TB的检测物已不局限于静脉血，支气 管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等也可用 于对肺内及肺外结核的诊断。
受试者数 量
72
文献发表
Meier et al Eur J Microbiol Infect Dis (2005)；24: 529-536
在经培养确诊的活动性结核受试者中，T-SPOT.TB的灵敏 度为96.6%。其中29例免疫力低下患者，T-SPOT.TB的灵 敏度为100%
在确诊病例（涂片或培养阳性）和临床诊断病例（有临床 症状和抗痨治疗有效）中，T-SPOT.TB的灵敏度为90.3% ，并且不受CD4细胞数量影响。
T-SPOT.TB操作指南[1]
![T-SPOT.TB操作指南[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/2ccb7718c281e53a5802ffa5.png)
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PP-TB-UK-V8 020306
培养板设置及孵育
• 将培养板从铝封袋中取出，标记并按 顺序加入：
– 50µl AIM V 至阴性对照孔 – 50µl 抗原 A 至抗原A孔 – 50µl 抗原 B 至抗原B孔 – 50µl 阳性对照 至阳性对照孔
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样品采集与制备
BD Vacutainer CPT管法 Ficoll 淋巴细胞分离液法
血浆 单个核细胞层 密度梯度分离液
分离胶 淋巴细胞分离液 红细胞
• 如果未达到如图所示离心效果，通常由于错误的离心速度所至， 请确认转速与离心力的换算并准确计算离心速度，重新离心。
死细胞 (蓝色)
活细胞 (白色 )
细胞凝块
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细胞计数与稀释
• 计算每ml细胞数量. 手工使用血细胞计数板或快 读一次性计数片，计数4 x 4大格含 0.1µl 样品。
– 每ml细胞数量 = 细胞计数 x 稀释倍数 x 104
• 计算细胞稀释需要的体积并加入相应的AIM-V 无 血清培养液（不能使用RPMI 1640）制备细胞稀 释液 。
样品采集与制备
• Ficoll淋巴细胞分离液方法 – 采集肝素锂抗凝外周血，按 体积1:1 以室温预热的 RPMI1640不完全培养液混 匀，按2-3:1 比例小心将血 样加在Ficoll淋巴细胞分离 液上层，注意不能将血样与 分离液混合。 – 18°C 1000xg 离心22分钟
抗凝外周血
Ficoll淋巴细胞分 离液
– 示例: – 每个患者需要 4 孔. 每孔需加入50μl 酶标抗体工作
T-SPOT_TB操作说明电子版(中文版)
散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。这使得 ELISPOT 检测更加的灵敏，超过传统的 ELISA 实验。T-SPOT.TB
被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应 T 细胞。T-SPOT.TB 记数每个活化的结核特异效应 T 细胞。
【检验原理】
外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。记数 PBMCs，保证有标准的细胞数量
步骤 1.从包装袋中取出培养板条，嵌入培养板架内恢复 至室温。
2.每个样本需要用到4个检测孔： （1）加入50ul细胞培养液至每个空白对照孔内； （2）加入50ul抗原A溶液至每个必要的检测孔内； （3）加入50ul抗原B溶液至每个必要的检测孔内； （4）加入50ul阳性质控至每个细胞功能控制孔内。 3.每个患者样本使用4个检测孔，每个检测孔加入 100ul细胞终溶液（含有25万个活细胞）
育1小时
确。
6．弃去标记抗体工作液，按上述的步骤2和3洗涤。
7.每个反应孔加入50ul底物显色溶液室温孵育7分 7. 不按照推荐的孵育时间会导致检测结果的不正
钟。
确。
8.用蒸馏水或去离子水彻底洗涤培养板终止反应。
9.在通风处或37℃温箱干燥培养板
9.斑点会因为干燥而变的清晰。可以37℃温箱干燥4
小时或室温过夜。
(4) 阳性质控
2 瓶 0.8ml/瓶 主要成分为植物血凝素 PHA，牛血清白蛋白和抑菌剂
(5) 浓缩标记抗体
1 管 50ul/管 含有碱性磷酸酶标记的小鼠的抗人 γ-干扰素单抗
(6) 显色底物溶液
1 瓶 25ml/瓶 含 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）和氯化硝基四氮唑蓝（NBT）
(7) CD 光盘
QB—SPOT结核实验
QB—SPOT结核实验
结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）是一种运用IGRA技术，检测被结核分枝杆菌特异的早期分泌靶抗原6（ESAT-6）和培养滤液蛋白10（CFP 10）分别刺激后释放γ-干扰素的效应T淋巴细胞，以辅助诊断结核感染的实验室检测技术。
TBspot试验通常指T-SPOT试验，即结核杆菌感染T细胞斑点试验，又称为结核菌感染干扰素释放试验，是利用结核特异性抗原，通过酶联免疫斑点技术，检测受试者体内是否存在结核效应的T淋巴细胞，从而判断被检查者是否感染结核杆菌。
该检查的原理是结核杆菌感染之后，T淋巴细胞会形成免疫记忆。
通常在体外分离到T淋巴细胞之后，培养增殖T细胞的同时，用相应的特异性抗原，进行刺激，激活T细胞记忆，有记忆的细胞则会分泌大量的干扰素。
结核T-SPOT检查即为结核菌T细胞斑点检测，是临床用于诊断结核病的新型检查方法。
通过检测干扰素的量，判断该细胞是否存在结核感染形成的记忆，进而通过进一步的反应判断是否存在结核菌感染。
但它的结果不能作为单独或决定性诊断活动性结核的证据，阳性结果仅提示患者体内存在结核杆菌特异性的效应T细胞。
但是否为活动性结核，则需要结合患者的临床症状及其他检测指标，进行综合判断。
现在已经有多项研究的结果显示，T-SPOT试验只能判断是否感染过结核，但无法鉴别活动性结核与潜伏性结核，因此对于活动性结核的诊断价值有限。
T-SPOT.TB-PPT精选课件
1
• 科室需求与结核检测现状 • T-Spot·TB 简介 • T-Spot·TB的临床应用
4
临床对结核检测的需求如何
• 结核病发病比例近些年不降反升，多种疾病合并发病— —多科室需求
• 菌阴肺结核比例高——灵敏 • 阴影待查情况较多——特异 • 呼吸系统（肺癌、肺间质病等）、神经系统、消化系统
27
基本要素
• 原理：干扰素释放试验 • 方法：酶联免疫斑点法 • 抗原： ESAT-6与CFP 10
28
γ-干扰素释放实验（IGRA）
γ干扰素 检测阴性
γ干扰素 检测阳性
TB抗原多肽
T细胞
活化T细胞
γ 干扰素
29
酶联免疫斑点技术（ELISPOT）
30
结核杆菌特异抗原
Tuberculosis Complex
M. tuberculosis M. africanum M. bovis BCG substrain
gothenburg moreau tice tokyo danish glaxo montreal pasteur
Antigens
ESAT-6 CFP 10
+
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+
+
+
-
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非结核分枝杆菌病是指感染了NTM，并引起相应器 官或组织病变。 迄今为止，共发现NTM菌种154种，NTM可以侵犯人 体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组 织器官并可引起全身播散性疾病。人可从环境中感 染NTM而患病，水和土壤是重要的传播途径。 NTM病发病率明显增长，其发病约占结核病的十分 之一。已成为人们关注的重要课题。
TB-SPOT
• 敏感性与特异性评价 • 活动性结核与潜伏性的鉴别 • 结核发病风险的预测
敏感性
• Pai等对近3年的13项研究进行Meta分析， 共纳入726例受试者，大多为结核培养阳性、 HIV阴性的成年人，分析表明T.SPOT.BT的 综合敏感性为90％。 • Chapman等研究显示39例HIV阳性的结核 患者中T.SPOT.TB的敏感性为90％，而 PPD皮试的阳性率仅为72％。 -细胞免疫低下不影响其敏感性
特异性
Pai等的Meta分析中纳人了6项研究290名受 试者，其中5项中的受试者都常规地接受 BCG免疫。93％为无结核接触史的健康成 年人，其综合特异性为93％。
活动性与潜伏性
• 每一个斑点代表一个与相应抗原反应的单 个细胞
活动性与潜伏性
• hee等对230例培养阳性活动性结核患者和 183例结核接触者进行了T.SPOT.TB检测 • 在ESAT一6肽段库中，活动性结核患者与 结核接触者的SFCs数分别为108vs40 SFCs／106PBMCs(P<0．001) • 在CFP.10肽段库中，分别为148vs52 SFCs ／106PBMCs(P<0．001) • 两2例怀疑肺外结核患者的前赡性 研究显示，对于活动性肺外结核，T.SPOTBT和PPD的敏感性分别为94％和47％，二 者比较差异具有显著性(P<0．001)。47％ 的随诊对象合并有导致免疫低下的情况,包 括HIV感染、肿瘤、移植、糖尿病以及自身 免疫病等，可能是导致PPD皮试的阳性率 显著降低的原因。 -肺外结核诊断的敏感性高
敏感性
Liebeschuetz等报道了对293例怀疑结核的 非洲儿童的随访结果，这些儿童的平均年 龄为3岁，约46％HIV阳性，多数合并营养 不良，对于确诊结核或高度怀疑结核的病 例，T-SPOT· TB的阳性率为83％，PPD皮 试的阳性率为63％. -年龄、HIV感染状态和营养不良的严重程 度对T.SPOT-TB结果无影响，但均能导致 PPD皮试结果的显著差异
结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)
1520文档结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)
一.临床意义：
结核病临床表现复杂多样，可累及全身各个系统，给临床诊断带来很大困难。
本项目检测通过将分离标本中的单个核细胞加入结核分枝杆菌特异性抗原A、B分别进行细胞培养后，分别检测分泌γ干扰素的特异性淋巴细胞的数量诊断结核感染。
本检测诊断结核感染的敏感性为90%-95%，特异性为93%-100%。
对临床诊断或排除结核病具有重要的参考价值。
二.标本类型、采集及运送要求：
1.采集要求：标本采集后4小时内必须送到实验室，标本采集后如果超过4小时未送检将严重影响检测结果。
2.静脉血：肝素钠（绿头管）抗凝管采集静脉血4ml，立即颠倒数次，充分混匀，以免血液凝固。
采血后向试管中注入血液时请缓慢进行，避免用力过猛造成细胞破坏影响检测结果。
三．标本采集时间、结果发放时间及检测频率
1.标本采集时间：每周一上午12点之前采血；并于4小时之内送到临床微生物实验室。
（必要时可与临床微生物实验室联系）
2.结果发放时间：周二下午4点半检验报告发出。
3.检测频率：暂定每周检测一次。
. 1。
T-SPOT.TB实验室配置
上海复星长征医学科学有限公司
结核感染T细胞检测实验室配置
关键设备：
1、II级生物安全柜
2、离心机（水平转子；温控18-25℃；离心力＞2000g）
3、细胞记数设备：仪器记数（三分类或五分类血细胞记数仪）
手工肉眼记数（普通显微镜加血细胞记数板）
4、培养箱（37℃、5%CO2）
5、移液器：10ul、200ul、1ml移液器
关键耗材
1、15ml尖底无菌离心管
2、抗凝采血管（肝素/肝素锂/肝素钠）
3、移液器的无菌配套吸头（10ul、200ul、1ml）
4、1.5ml微量离心管
关键试剂（试剂盒不包括，但对实验必需的试剂）：
1、Ficoll淋巴细胞分离液
2、淋巴细胞培养液AIM V
3、淋巴细胞培养液RPMI 1640
4、PBS缓冲液（PH=7；不含表面活性剂如吐温80等）
5、台盼蓝（Trypan blue）染液
可选设备：
1、37℃水浴箱
2、定时器
3、ELISPOT读数仪或放大镜、显微镜
4、其它实验用手套、衣服、灭菌设备等
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T-SPOT-TB说明书翻译
T-SPOT®.TB用于结核感染的诊断8孔反应板条规格（TB.300）说明书用于体外诊断T-SPOT.TB 88孔反应板规格（TB.300）内容目录页码预期用途 3 前言 3 原理 3 局限性 4 安全警告及防范 4 原料 5 储藏条件 5 稳定性 5 仪器和配套试剂 5 试剂准备 6 步骤 6 样本采集和准备 6 细胞的洗涤和记数7 板条组装和孵育7 斑点记数8质量控制9结果解释和判断标准9性能指标10参考文献10术语和标识11预期用途T-SPOT.TB是一种体外诊断试剂，通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染。
T-SPOT.TB是一种记数单个结核特异的效应T细胞的ELISPOT检测方法。
酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)是一种从单细胞水平检测分泌抗体或细胞因子细胞的免疫学新技术前言结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4（Cluster of Differentiation 4）和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数1,2。
从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（Bacillus Calmette - Guerin）（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。
两个单独的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。
T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。
ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。
这使得ELISPOT检测更加的灵敏超过传统的ELISA实验5。
T-SPOT.TB被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞3、4、6-9。
T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。
结核感染T细胞斑点试验
T-SPOT-TB—应用
在活动性结核病中的诊断意义 1.敏感性86-94%，特异性89-99% 2.在肝移植术后、艾滋病、血液肿瘤等免疫抑制患
者中， T-SPOT-TB阳性率略低于免疫正常组，但仍具有 较高的敏感性，且优于结核菌素试验。
3.在肺外结核患者诊断中的，敏感性优于结核菌素 试验。
4.对小于4岁儿童，与结核菌素实验比较敏感性无优 势，美国CDC更推荐结核菌素实验。
结核感染T细胞斑点试验 （T-SPOT-IGRAs）
在2001年前，美国仅批准结核菌素 皮肤试验（TST）用于结核分支杆 菌的检测。在认识到IFN-γ在调节 对结核分支杆菌的细胞介导的免疫 反应中起重要作用，从而使得 （interferon gamma release assays） IGRAs用于检测结核感染。IGRAs通 过检测代表结核分支杆菌的抗原刺 激T淋巴细胞反应后释放IFN-γ的量 来判断是否存在结核杆菌感染。
T-SPOT-TB—示意
T-SPOT-TB—解释
非黄金标准 定性检测而不是定量检测 敏感性95.3%-98.8% 特异性94.1%-100% 萨斯分枝杆菌( My cobacter ium kans asii ) 、海
分枝杆菌(My cobacter ium mar inum ) 、斯氏分枝 杆菌( My cobacter ium sz ul gai ) 等少数分枝杆 菌中也存在完整RD1区，编码ESAT������ 6 和CFP������ 10, 可造成检测结果成假阳性。
T-SPOT-TB—应用
在结核性脑膜炎、结核性胸膜炎中的诊断意义 1.敏感性优于ADA、TB-DNA，约在62-75%，特异性无
统计学差异。 • 在结核病治疗中的评价意义
结核感染T细胞检测
140 32
在免疫力正常和免疫力低下的受试人群中，T-SPOT.TB的 灵敏度分别为94%和95%。所有受试者中，42%为肺外结 核患者。
经培养确诊、抗痨治疗不超过2周的结核患者用TSPOT.TB检测，阳性率98%（57/58）。 在经培养确诊的活动性结核患者中，T-SPOT.TB的灵敏度 为94%。
1新检验项目结核感染特异性结核感染特异性tt细胞细胞tspottb检测技术检测技术1结核病的疫情结核病的疫情结核病是一种慢性传染病可在身体各个器官发病其中以肺结核最为常见因此肺结核病是一种严重危害人类健康的传染病得了肺结核病如果不能彻底治疗就会完全丧失劳动能力而且还会传染他人对个人家庭和社会都是极大的危害
受试者数 量 72
文献发表
Meier et al Eur J Microbiol Infect Dis (2005)；24: 529-536 Lee et al. ERJ 2006; 28:24–30
87
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Clark et al. Clin. Exp. Imm. 2007; 150(2):238-44 Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65 Kim et al. Arch Intern Med. 2007; 167;20:2255-2259
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58 32
Janssens et al ERJ 2007；30(4):722-8 Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008; 15;16871
T-SPOT.TB高特异性 检测所用的ESAT-6＆CFP 10抗原均来自结核
218
t淋巴细胞斑点试验操作流程
t淋巴细胞斑点试验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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TSPOT简易实验操作
T-SPOT.TB实验标准操作程序目的：规范T—SPOT.TB实验操作程序，保证实验正常进行。
实验步骤：⒈制备外周血单个核细胞（PBMCs）⑴采集肝素抗凝血按1:1与室温预热的1640培养液混匀，稀释血样与淋巴分离液按2-3:1的比例（通过离心把管壁的Ficoll离心到管底）把稀释血样轻轻加到Ficoll淋巴细胞分离液，注意不能将血样于分离液混合⑵→离心<2300转>1000g 22分钟18℃⑶--→将外周血单个核细胞从Ficoll分离管中转移到新的无菌的15ml尖底离心管<离心管加RPMI1640培养液5ml>。
⒉洗涤细胞1)离心管加RPMI1640培养液至10ml，混匀后离心<1800转>600g 7分钟18℃2)→小心弃去上清用1ml RPMI1640轻缓重旋细胞，然后加RPMI1640至10ml，混匀后离心<1500转>350g 7分钟18℃3)→小心弃去上清用500ulAIM-V（细胞数量少时，可以适当减少加入AIM-V量）轻缓重旋细胞(不能用RPMI1640重旋细胞)⒊细胞计数10ul制备样品细胞悬液+40ul 0.4％的台酚蓝，制备1:5的细胞稀释液，充分混匀，→取10ul加入细胞计数板并进行活细胞计数→根据附表配成500ul细胞稀释工作液（或者用细胞计数仪计数细胞）⒋加样孵育洗板1)每个样本按阴性对照，A抗原，B抗原，阳性对照的顺序，加入相应的50 ul试剂→按样本编号，每孔加入100 ul细胞稀释工作液后孵育，37℃，5％CO2，16-20小时，保湿→。
2)第二天用无菌的PBS按1:200制备新鲜的酶标抗体工作液（即用即配）3)→取出培养板，弃去液体以200 ul新鲜配制的无菌PBS洗涤4遍（要求每次洗涤后，拍干）4)→每孔加入50 ul新鲜的酶标抗体工作液，将酶标板在2-8℃孵育1小时，5)→无菌PBS洗涤4遍除去未结合的酶标抗体（要求每次洗涤后，拍干），6)每孔加50 ul底物工作液，室温，避光7分钟，7)→以蒸馏水冲洗终止反应→37℃2-3小时或室温过夜干燥培养板→分析结果。
T-SPOT.TB实验技术2015
结核病
• 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。 结核菌能侵入全身各个器官，但80%发生在肺 部，常称肺结核。
•常见肺外结核： 淋巴结核（最常见）、结核性脑膜炎（最严
重）、结核性腹膜炎、肠结核、肾结核、附睾结 核、女性生殖结核（引起不孕不育）、骨关节结 核等。
3
结核病
• 分枝杆菌细菌学分类 1. 结核分枝杆菌复合群（MTC） 2. 非结核分枝杆菌（NTM） 3. 麻风分枝杆菌（M.leprae）
γ-干扰素释放试验原理（IGRAs)
γ-干扰素 检测阴性
γ-干扰素 检测阳性
TB抗原多肽
T细胞
活化T细胞
γ-干扰素
可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。
T-SPOT ®.TB 实验方法学为酶联免疫斑点技术
（ELISPOT）
• ELISPOT方法结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA 技术），是公认的最灵敏的抗原特异性T细胞的体外检测技术。
含使用说明书，技术手册，MSDS文件，操 作指南等
T-SPOT.TB 辅助试剂及耗材
与试剂盒配套的辅助试剂（公司会选择性的与试剂盒配套赠送）
种类名称
规格
淋巴细胞分离液 200ml/瓶
1640培养液
500ml/瓶
AIM-V培养液 100ml/瓶
10×或1×的PBS 400ml/瓶
与试剂盒配比量（2盒试剂所配辅助试剂的量） 1瓶（天津灏洋或天津美德太平洋） 2瓶（天津美德太平洋或天津灝洋） 待定（天津美德太平洋） ——
离心后实际效果图
血浆 PBMCs层 淋巴细胞分离液
红细胞
分步操作——第二步 细胞洗涤
• 离心结束后，将分离出来的单 个核细胞层（PBMCs）取出至 新的15ml尖底离心管中； 注意：不要吸到底层的红细胞。
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结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）说明书【产品名称】通用名称：结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）英文名称：T-SPOT.TB【包装规格】24人份/盒。
【预期用途】该产品用于检测人外周抗凝全血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞，仅适用于临床疑似结核病的辅助诊断。
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数。
从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。
两个单独的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。
T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。
ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。
这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。
T-SPOT.TB 被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。
T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。
【检验原理】外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。
记数PBMCs，保证有标准的细胞数量用于检测。
这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应孔检测。
与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能。
抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。
分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其它不必要的物质通过洗涤被去除。
标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获细胞因子。
通过洗涤去除任何未标记的抗体。
可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。
每一个斑点代表一个分泌细胞因子的T细胞，记数斑点数量可以获得外周血中结核致敏的T细胞数量。
【主要组成成份】1. 试剂盒组份(1) 微孔培养板1块96孔由12×8孔的板条组成，包被有小鼠抗人的γ干扰素单抗(2) 结核杆菌特异混合多肽A 2瓶0.8ml/瓶主要成分为ESAT-6抗原，牛血清白蛋白和抑菌剂(3) 结核杆菌特异混合多肽B 2瓶0.8ml/瓶主要成分为CFP 10抗原，牛血清白蛋白和抑菌剂(4) 阳性质控2瓶0.8ml/瓶主要成分为植物血凝素PHA，牛血清白蛋白和抑菌剂(5) 浓缩标记抗体1管50ul/管含有碱性磷酸酶标记的小鼠的抗人γ-干扰素单抗(6) 显色底物溶液1瓶25ml/瓶含5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）和氯化硝基四氮唑蓝（NBT）(7) CD光盘1张含使用说明书，技术手册，MSDS文件，操作指南和报告软件2. 不同批号试剂盒中各组分不得混用或互换。
3. 产品不包含，但对试验必须的试剂组分· 8孔反应板条架· II级生物安全柜·水平离心机（温控（18-25℃），离心力不低于1800g）· PBMCs记数设备和试剂：使用台盼蓝肉眼显微镜手工记数或自动血细胞记数仪记数· 37℃(±1),5% CO2培养箱（保持湿润）·移液器及消毒的加样枪头· ELISPOT读板仪或显微镜，放大镜【储存条件及有效期】储存条件及有效期：2～8℃、避光、密封保存。
试剂盒自检定合格之日起有效期为12个月。
【样本要求】⒈样本采集：无菌注射器抽取足量的外周静脉血，加至含有肝素或柠檬酸钠抗凝剂的采血管中；或使用肝素或柠檬酸钠抗凝的真空采血管直接进行采集；或使用BD公司的CPT真空采集管，采集外周静脉血；不推荐EDTA抗凝管。
样本采集后应尽快进行外周血单个核细胞（PBMCs）的分离，室温保存时间不应超过4小时，不得冷藏或冷冻。
免疫力正常的患者，根据以下标准从静脉血样本中获得足够数量的PBMCs用于实验：·成年人或10岁以上儿童：8ml静脉血·2-9岁儿童：4ml静脉血·2岁以下儿童：2ml静脉血⒉外周血单个核细胞（PBMCs）的分离：注意：细胞培养液使用前需预温至37℃步骤注意点1.依照说明书的要求采集全血样本。
室温保存（18-25℃），不能冷冻或冷藏1.血样本可用不同的采血管采集。
推荐使用BD的CPT 管或肝素锂抗凝管。
不推荐EDTA抗凝管。
2.对于使用CPT采血管的，根据厂家说明书要求来分离PBMCs。
对于其它方法采集血样的，利用Ficoll-PaqueTM Plus 按照操作说明分离PBMCs 2.8ml CPT管分离条件：1600g，28分钟；4ml CPT管分离条件：1800g,30分钟，均为室温条件（18-25℃）。
其它方法采集血样的，用RPMI 1640培养液等体积混匀。
按体积比2-3：1小心的加在Ficoll淋巴细胞分离液上层，室温（18-25℃），1000g，离心22分钟。
3.用吸液管吸取白色、云雾状PBMCs层并转移至15ml 尖底离心管中。
加入细胞培养液至10ml。
3.本步骤可以选择不同的细胞培养液洗涤。
培养液AIM-V和RPMI 1640均被推荐使用。
4.600g离心7分钟。
弃去上清液用1ml培养液重悬沉淀。
4.要求见第3点。
5.加培养液至10ml，350g离心7分钟。
5.要求见第3点。
6.弃去上清液加0.7ml培养液重悬沉淀。
6.本步骤选择培养液重悬沉淀并孵育过夜，强烈推荐培养液AIM-V。
⒊外周血单个核细胞（PBMCs）的收集与计数：T-SPOT.TB实验要求每个检测孔含有25万个细胞。
每个样本检测需要4个孔。
每个检测孔都必须加入足够的细胞。
错误的做法会导致结果的不正确。
步骤注意点1.活细胞记数。
1.可采用不同的方法，包括台盼蓝染色手工记数或使用合适的设备自动记数。
2.对于采用记数板手工记数，取10ul细胞终溶液加到40ul 0.4%(w/v)台盼蓝染液中混匀。
调整记数板至合适的位置记数栅格里细胞数。
其它类型的记数板或自动细胞记数仪，依照厂家说明书操作。
2.注意确保细胞终溶液在稀释记数前被充分的混匀。
细胞沉淀在离心管底部会导致记数结果与实际细胞数量发生偏差。
3.计算细胞终溶液的浓度。
3.确保正确计算细胞浓度，过多或过少都会导致结果的不准确。
4.配制每100ul含有25万个细胞的标准溶液500ul 。
4.稀释前确保细胞悬液充分混允【检验方法】1. 检验步骤：·试剂准备(1) 微孔培养板。
取出够数的8孔反应板条恢复至室温待用，其余板条与干燥剂一起放回铝箔袋中。
(2) 取出结核特异抗原ESAT-6（抗原A）待用(3) 取出结核特异抗原CFP 10（抗原B）待用(4) 取出阳性质控待用(5) 准备1:200稀释的标记抗体工作液，计算足够用的浓缩标记抗体工作液在使用之前配制(6) 取出底物显色溶液恢复至室温待用·按每个测定样本需微孔培养板4孔（空白对照、测试孔A和测试孔B、阳性质控对照）从铝箔包装中取出测试所需的微孔板条，推荐按以下方式排列：Ο空白对照Ο抗原AΟ抗原BΟ植物血凝素PHA对照步骤注意点1.从包装袋中取出培养板条，嵌入培养板架内恢复至室温。
1.只取出够用的培养板条，其余的放回储存。
培养板条嵌入空的培养板内盖上垫板和盖子。
架子，垫板和盖子可以保留重复使用。
2.每个样本需要用到4个检测孔：（1）加入50ul细胞培养液至每个空白对照孔内；（2）加入50ul抗原A溶液至每个必要的检测孔内；（3）加入50ul抗原B溶液至每个必要的检测孔内；（4）加入50ul阳性质控至每个细胞功能控制孔内。
2.不允许移液管枪头触碰反应孔底部的膜。
枪头造成的压痕会导致孔内出现假象斑点。
轻叩培养板使得试剂覆盖反应孔底部是必要的。
避免过度用力导致反应孔间出现交叉污染。
3.每个患者样本使用4个检测孔，每个检测孔加入100ul细胞终溶液（含有25万个活细胞）3.每吸取100ul细胞终溶液前都必须保证彻底混匀。
推荐每孔加样后都更换新的枪头以避免4个反应孔出现交叉污染。
4.在37℃，保持湿润的含有5%的CO2培养箱中孵育16-20小时。
4. 为避免干扰，培养板应立即放入孵育箱。
不要把培养板堆叠，会导致温度的不均匀和空气的不流通。
不按照推荐的时间孵育会导致不正确的检测结果。
2.斑点记数在培养板的洗涤和斑点形成阶段，不要让移液枪枪头或洗板仪枪头触碰反应孔底部的膜。
移液枪枪头或洗板仪枪头产生的凹痕会导致斑点假象，影响斑点记数。
步骤注意点1．从培养箱中取出培养板弃去细胞培养液。
1．此时从试剂盒取出底物显色溶液恢复至室温。
2．每个反应孔加入200ul PBS缓冲液3．弃去PBS缓冲液。
用新鲜的PBS缓冲液重复洗涤至少3遍3．最后一遍洗涤结束后，弃去PBS缓冲液并在下一步骤前在吸水纸上拍干反应孔。
4．用PBS缓冲液200倍稀释浓缩标记抗体试剂。
4．不能用含有Tween或其它去污成分的PBS缓冲液，这会导致高的本底结果。
确保标记抗体工作液有少量剩余（考虑到耗损）。
因而，对于8孔板条（每孔需要50ul），配制500ul标记抗体工作液，取2.5ul的浓缩标记抗体试剂加497.5ul的PBS缓冲液5．每个反应孔加入50ul标记抗体工作液，2-8℃孵育1小时5．不按照推荐的孵育时间会导致检测结果的不正确。
6．弃去标记抗体工作液，按上述的步骤2和3洗涤。
7.每个反应孔加入50ul底物显色溶液室温孵育7分钟。
7. 不按照推荐的孵育时间会导致检测结果的不正确。
8.用蒸馏水或去离子水彻底洗涤培养板终止反应。
9.在通风处或37℃温箱干燥培养板9.斑点会因为干燥而变的清晰。
可以37℃温箱干燥4小时或室温过夜。
10.记数每个反应孔内深蓝色清晰的斑点。
根据结果解释和判断标准（见下页）确定患者样本对结核抗原为“有反应性”或“无反应性”。
10.可以采用以下方法记数斑点数量，包括肉眼放大镜记数，合适的显微镜记数，专门的ELISPOT读板仪记数。
⒋结果判断根据抗原A或/和抗原B孔的反应判断结果:检测结果为“有反应性”，参照以下标准：l空白对照孔斑点数为0-5个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6l空白对照孔斑点数为6-10个时且（抗原A或抗原B孔的斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数）如果上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时检测结果为“无反应性”【参考值（参考范围）】“有反应性”结果表明样本中存在针对结核杆菌特异的效应T细胞“无反应性”结果表明样本中可能不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞【检验结果的解释】(1) 通常正常结果，空白对照孔没有或有很少的斑点而阳性质控对照孔斑点数超过20个。