高效液相色谱法 PPT课件

①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
丙酮
0 二恶烷
化学键合相色谱法
其他色谱类型 亲合色谱法（affinity chromatography；AC） 手性色谱法（chiral chromatography；CC） 胶束色谱法（micellar chromatography；MC） 电色谱法（electrochromatography；EC）
根据化学键合相与流动相极性的相对强弱区分
（一）正相键合相色谱法
①固定相：极性键合相 如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基键合硅
胶。 ②流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂
如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂） ③适用范围：
溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物 如一些在硅胶柱上分离的物质
（二）反相键合相色谱法
①适用范围：有机酸、碱、盐、离子型和非离子型 化合物的混合物。
②离子对试剂的选择：
分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁 基铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵 （CTAB）等
分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或 硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺 酸钠（PICB6）
第二节 高效液相色谱法的固定相 和流动相及其选择
F=2.3QKI0εCl Q为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸 光系数，l为光径长度。
F=KC
2. 特点： 选择性好，专属型检测器 灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10 g/ml）
3. 激发波长(ex)和发射波长(em)的选择
（四）、安培检测器
1.原理： 在电极间施加一恒定电位，当电活性组分经过
⑦
37.5%乙腈溶液 B ②
⑨ 0/0.5/0.5 ⑩ ⑤
③ C 26.7%四氢呋喃溶液
5.在ΔABC上选择7或10个流动相进行实验，对实验 结果进行分析，以色谱优化指标寻找确定最佳流
动相。
三、分离条件的选择
HPLC中的速率理论
1.涡流扩散 A=2λdp
球形、小粒度、均匀（RSD＜5%）固定 相，匀浆高压填充，以降低A。
s1 SH2O H2O SCH3OH CH3OH 0 3.0 0.4 1.2
3.计算确定具有等洗脱强度的另外两个二元溶剂B和 C的组成。
如：
CH3CN (1.2 0) / 3.2 0.375
THF (1.2 0) / 4.5 0.267
用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用 于定量,判断峰纯度。
（三）荧光检测器（fluorescence detector；FD)
1.检测原理： 化合物受紫外光激发后，发射出比激发光 波长更长的光，称为荧光；
荧光强度 (F) 与激发光强度 (I0) 及荧光物 质浓度 (C) 之间的关系为：
固定相应符合下列要求： ① 颗粒细且均匀； ② 传质快； ③ 机械强度高，能耐高压； ④ 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。
一、化学键合相色谱法的固定相
（一）键合相的种类 1.非极性键合相 ：
非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在 硅胶表面；
用于反相色谱
2.弱极性键合相： 醚基和二羟基等键合相
2.纵向扩散 B=2γDm 可以忽略。
因为Dm很小，室温操作，且U大于U最佳， 则B项可以忽略。
3.传质阻抗
① 固定相传质阻抗CS可以忽略 ，因df极小 ② 流动相传质阻抗Cm
要求：

Cm
dp小，Dm大
mdP Dm
2
③静态流动相传质阻抗： 由于部分流动相在固定相微孔内的滞留。
Csm ∝dp2， Csm ∝1/Dm，而Dm∝T/η
一、输液系统 （一）、高压输液泵
恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。 常用柱塞式往复泵
恒压泵
输液泵应具备的性能： ① 流量精度高且稳定 ② 流量范围宽 ③ 能在高压下连续工作 ④ 液缸容积小 ⑤ 密封性能好，耐腐蚀
输液泵操作注意事项： ① 防止固体微粒进入泵体 ② 流动相不应含有腐蚀性物质 ③ 防止溶剂瓶内的流动相被用完 ④ 不超过规定的最高压力 ⑤ 流动相一般应该先脱气
组
流
固
分
动
定
相
相
组分分子被“挤出” “疏溶剂腔”
保留
2.保留行为的主要影响因素
a. 溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大；
引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。
b. 固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质 的k也增大。
硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越 大。
3.局限： 只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截 止波长应小于检测波长。
专属型、浓度型检测器 4.分类： ① 固定波长检测器 ：254nm ② 可变波长检测器：
③光电二极管阵列检测器 (photodiode array detector； PDAD)：
工作原理：复合光通过流通池，再进入单色器， 分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波 长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三 维光谱－色谱图。
离子对
(B+ A )m
( BH+ RSO3 )s
(B+ A )s
2.影响容量因子的因素
① 离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k 增大； 在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大。
② 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时 （离子对的形成），组分的k值最大.
3.适用范围和离子对试剂的选择
要求: 固定相dp、 流动相η都小
总结： H=A+Cmu+Csmu
原因：化学键合相，液体流动相 结果：HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀
的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜 过快；③柱温适当。
第三节 高效液相色谱仪
组成 输液系统 进样系统 色谱柱系统 检测系统 数据记录处理系统
高效液相色谱法
一. 定义： 经典液相色谱法为基础， 引入气相色谱法的理论和实验技术， 高压输送流动相， 高效固定相及高灵敏度检测器， 现代液相色谱分析方法。
二.与经典液相色谱法相比
颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定 相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；
高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快； 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。
二、化学键合相色谱法
1.定义： 键合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC)：
以化学键合相为固定相的色谱法。 化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键
合在载体表面所形成的固定相
2.分类： 正相（normal phase，NP）键合相色谱法： 反相（reversed phase，RP）键合相色谱法：
4.以溶剂a、b、c为溶剂选择三角形上的三个项点A、 B、C。在ΔABC各点的洗脱强度均相等。在三角 形三条边上的任何一点，都可组成三元混合溶剂流 动相。在三角形内任何一点，都可组成四元溶剂流 动相。
A 40%甲醇溶液
①
0.67/0.16/0.16
0.5/0.5/0 ④ ⑧
⑥ 0.5/0/0.5
0.33/0.33/0.33
（二）梯度洗脱装置
高压梯度洗脱 低压梯度洗脱
二、分离和进样系统
1.进样器 进样阀（六通阀）、自动进样装置
2.色谱柱（column） 由柱管和固定相组成 分析柱、制备柱 性能评价 • H、n、fs、k和α的重复性，或R。
三、检测系统
（一）检测器(detector)的主要性能 要求： ① 灵敏度（sensitivity）高（检测限低） ② 噪音（noise）低 ③ 线性范围（linear range）宽 ④ 重复性（repeatability）好 ⑤ 适用范围广（通用型、专属型）
c. 流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
I. 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 II. 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 III. 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 IV. pH：影响弱酸、弱碱的离解（离子抑制色谱法）
反相离子对色谱法
(paired ion chromatography；PIC or ion pair chromatography；IPC)
3.0 乙醇
3.2 异丙醇
3.4 四氢呋喃
3.5
3.6
4.2
4.5
反相色谱法中混合溶剂的强度因子：
n
s混＝ Sii i＝1
（三）流动相最优化方法简介： 1.根据snyder的溶剂选择性分组，选择具有显著选择
性差异的溶剂。 2.以其中一种溶剂与底剂组成的二元基础溶剂A系统进
行实验，调整溶剂配比，使组分的k在适宜的范围内。 例：40%甲醇的水溶液：
把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子 在流动相中与离子对试剂的反离子（counter ion） 生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用， 使k增加，改善分离效果。
1. 离子对模型 流动相
固定相
B + H+ RSO3 Na
BH +
+ RSO3 + Na+
通式
B+ + A
( BH+ RSO3 )m
测 器
散射光强度(I)与气溶胶中组分的质量：
3.极性键合相： 常用氨基﹑氰基键合相键合硅胶 一般用于正相色谱
（二）键合相的性质和特点
1. 键合反应
硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅
胶进行硅烷化反应
R1
R1
Si OH + Cl Si C18H37
H Cl
Si O Si C18H 37
R2
R2
如：YWG－C18H37，无定形硅胶YWG上键合了十八硅烷基； Spherisorb ODS，球形硅胶Spherisorb 上键合了ODS。
2.键合相的性质 ① 含碳量：含碳的百分数 ② 覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅
醇基总数的比例 ③ 封尾（end-capping）：在键合反应后，用三
甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3.键合相的特点 使用过程中不流失； 化学稳定性好； 适于梯度洗脱； 载样量大 4.注意： 流动相的pH一般应在2-8，否则会引起硅
电极表面时，发生氧化还原反应，产生电量的大小 (Q)符合法拉第定律：Q=nFN.
I nF dN dt
2.应用范围： 凡具有氧化还原活性的化合物，或经过衍生
化具有氧化还原活性的化合物均能进行检测。
（五）蒸发光散射检测器
1.原理：
气
体
色谱柱流出液
雾化器
光
电
小液滴
二
极
加热的漂移管
管
检
强光或激光
气溶胶
胶溶解；(也有适用宽pH范围的键合相)。
二、化学键合相色谱法的流动相 对流动相的要求： 与固定相不发生化学反应。 对试样有适宜的溶解度。 与检测器相适应。 纯度高，粘度小。
（一）流动相对分离的影响
R n α -1 k2 4 α 1 k2
n由色谱柱（固定相）性能决定， α主要受溶剂种类的影响， k受溶剂配比的影响。