苦参素对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用

苦参素对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用
王琴;汪菁;张凯
【摘要】目的研究苦参素对四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用及
机制.方法将45只C57小鼠按双盲法随机分为对照组、模型组和苦参素低、中、高剂量组(40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg),每组9只.采用腹腔注射CCl4诱
导小鼠急性肝损伤模型.全自动生化分析仪测定血清中谷草转氨酶(AST) 、谷丙转
氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)和碱性磷酸酶(ALP)表达水平;过碘酸希夫反应(PAS)染
色检测肝组织病理学改变;黄嘌呤氧化酶法检测肝脏过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)活性;硫代巴比妥酸法检测肝脏丙二醛(MDA)含量;酶联免疫吸附(ELISA)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测血清和肝
脏肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6 (IL-6)和白介素1β (IL-1β)表达量.结果与对照组比较,模型组AST、ALT、TBIL、ALP、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平
及肝组织病理损伤明显增加,而CAT、GPx和SOD活性明显降低,差异均有统计学
意义(P<0.05);与模型组比较,苦参素可呈浓度依赖性降低AST、ALT、TBIL、ALP、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平以及肝组织病理损伤,但也可呈浓度依赖性增加CAT、GPx和SOD活性,差异均有统计学意义(P<0.05);苦参素各剂量组与对
照组比较,在AST、ALT、TBIL、ALP、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β表达水
平,CAT、GPx和SOD活性以及肝脏病理损伤方面,差异均无统计学意义(P>0.05).
结论苦参素对CCl4诱导的急性肝损伤有保护作用,其作用机制与增强肝脏抗氧化
酶活性,减少脂质过氧化和抗炎相关.%Objective To study the protective effects of matrine on carbon tetrachloride (CCl4)-induced acute liver injury in mice and its mechanisms. Methods A total of 45 C57 mice were randomly divided into the control group, model group, matrine low, medium and
high dose group (40 mg/kg, 80 mg/kg, 160 mg/kg) according to double blind method (n=9). The model of acute liver injury was induced by intraperitoneal injection of CCl4. The serum levels of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), total bilirubin (TBIL) and alkaline phosphatase (ALP) were determined by automatic biochemical analyzer. The pathological injury of liver tissues was detected by PAS staining. The activities of liver catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) were de-tected by xanthine oxidase assay. The content of malondialdehyde (MDA) was determined by thiobarbituric acid assay. The serum levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β were detected by ELISA and their gene expression levels in liver were de-termined by RT-PCR. Results Compared with the control group, the model group had higher expression of AST, ALT, TBIL, ALP, MDA, TNF-α, IL-6 and IL-1β, more serious hepatic path ological injury, and lower activity of CAT, GPx and SOD (P<0.05). Compared with the model group, matrine could decrease hepatic pathological injury and the expression lev-els of AST, ALT, TBIL, ALP, MDA, TNF-α, IL-6 and IL-1β and increase the activity of CAT, GPx and SOD in a dose-de-pendent manner (P<0.05). There was no statistical significance between the control group and each dose group of matrine on the expression levels of AST, ALT, TBIL, ALP, MDA, TNF-α, IL-6 and IL-1β, the activity of CAT, GPx and S OD, and pathological injury of liver (P>0.05). Conclusion Matrine can protect mice against acute liver injury induced by CCl4, and its mechanism is related to
enhancing the activity of liver antioxidant enzymes, reducing lipid peroxidation, and anti-in-flammation.
【期刊名称】《海南医学》
【年(卷),期】2018(029)012
【总页数】4页(P1629-1632)
【关键词】苦参素;急性肝损伤;四氯化碳;保护作用;机制
【作者】王琴;汪菁;张凯
【作者单位】三峡大学附属仁和医院消化科,湖北宜昌 443000;三峡大学附属仁和医院消化科,湖北宜昌 443000;三峡大学附属仁和医院消化科,湖北宜昌 443000【正文语种】中文
【中图分类】R-332
苦参素是从天然植物苦参中提取的主要有效成分，包含98%的氧化的苦参碱及氧化的槐果碱。

药理学研究显示苦参素具有较强的抗炎和抗氧化活性，可强力清除炎症因子和氧自由基(ROS)，对衣霉素诱导的急性肝损伤具有保护作用[2]。

因此本研究通过四氯化碳(CCl4)构建小鼠急性肝损伤模型，探讨苦参素对急性肝损伤的保护作用并对其保肝机制进行初步探讨，为苦参素的开发和应用提供理论支持。

1 材料与方法
1.1 药物与试剂苦参素购买于正大天晴制药公司，四氯化碳购买于正大天晴制药公司，过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)均购买于南京建成生物科技公司，肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-
6(IL-6)和白介素1β (IL-1β)ELISA试剂盒均购买于美国Ebioscience公司。

1.2 仪器倒置显微镜购买于日本Olympus公司，全自动生化分析仪购买于德国Sigma公司，酶标仪美国赛默飞公司。

1.3 动物雄性C57级小鼠，SPF级，体质量22～25 g，购买于武汉大学实验动物中心，许可证号SYXK(鄂)2011-0027，设施使用证明号00124732，自由进食和
进水。

1.4 动物分组及给药 45只小鼠双盲随机分成5组，每组9只。

分别为正常对照组(control，C)、模型组(carbon tetrachloride，CCl4)和苦参素(matrine，M)低、中、高剂量组(40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)[2]。

给药方案：苦参素组分
别给予(40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)苦参素灌胃，1次/d，持续12 d，
各组大鼠在末次灌胃后4 h，除正常对照组外，其余各组大鼠按照(6 mL/kg)腹腔
注射植物油配制的四氯化碳溶液[3]。

1.5 检测指标建模后24 h，戊巴比妥钠麻醉后行腹主静脉采血，离心取血清，全
自动生化分析仪检测血清AST、ALT、TBIL和ALP含量；ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达量。

采血完毕后处死小鼠，取肝脏，称其总重，计
算肝脏指数。

取左肝脏匀浆，离心取上清利用黄嘌呤氧化酶法检测肝脏过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)活性；硫代巴比妥酸法检测肝脏丙二醛(MDA)含量；RT-PCR检测TNF-α 、IL-6和IL-1β的信使
RNA(mRNA)水平，PCR反应条件为95Ⅱ15 s、60Ⅱ 30 s、72Ⅱ 30 s共40个
循环，取PCR产物4 μL进行琼脂糖凝胶电泳。

采用凝胶成像系统和图像分析系统进行成像及灰度分析，以β-actin为参照，引物序列参见表1。

取右肝，置于多聚甲醛，固定，石蜡包埋，PAS染色检测肝脏病理形态，具体损伤评分参考文献[3]。

1.6 统计学方法应用SPSS1
2.0统计学软件分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间计量数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间比较采用
最小显著差法(least significant difference，LSD)，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果
2.1 苦参素对急性肝损伤小鼠血清中AST、ALT、ALP和TBIL表达水平的影响与正常对照组相比，模型组小鼠血清中AST、ALT、ALP和TBIL的表达水平均明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

与模型组相比，不同浓度的苦参素预处理均能减少血清中AST、ALT、ALP和TBIL表达水平，并且呈现浓度依赖性关系，组间差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表1 引物序列TNF-α IL-1β IL-6 β-actin小鼠小鼠小鼠小鼠CTGAACTTCGGGGTGATCGG AGCTTCCTTGTGCAAGTGTCT CTGCAAGAGACTTCCATCCAG AGAGGGAAATCGTGCGTGAC GGCTTGTCACTCGAATTTTGAGA GACAGCCCAGGTCAAAGGTT AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG CAATAGTGATGACCTGGCCGT
表2 不同浓度苦参素对急性肝损伤小鼠血清中AST、ALT、ALP和TBIL表达水平的影响(±s)注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与苦参素(40 mg/kg)比较，CP＜0.05；与苦参素(80 mg/kg)比较，dP＜0.05。

对照组模型组苦参素(40 mg/kg)苦参素(80 mg/kg)苦参素(160 mg/kg)F值P值9999930±5170±25a 110±16b 90±14bc 65±11bcd
135.0000.00036±7211±33a 165±22b 132±19bc 114±15bcd
198.0000.00042±9184±25a 136±19b 116±15bc 88±11bcd
211.0000.0002±0.311±1.5a 8±0.9b 6±0.7bc 4.5±0.5bcd 186.0000.000
2.2 苦参素对急性肝损伤小鼠肝脏病理结构的影响对照组肝小叶形态结构完整，肝索结构清晰可见，未见肝细胞肿胀、坏死和炎症细胞浸润；模型组肝小叶中央区明显坏死，坏死区可见大量肝细胞肿胀、坏死和炎细胞浸润，有明显的灶状坏死，
见图1。

与模型组相比，不同浓度的苦参素预处理均能减少肝细胞肿胀、坏死、炎性细胞浸润，并且呈现浓度依赖性关系，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

图1 PAS检测苦参素对肝组织病理结构的影响(100×)
表3 不同浓度苦参素对急性肝损伤小鼠肝组织的影响(±s)注：与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与苦参素(40 mg/kg)比较，CP＜0.05；与苦参素(80 mg/kg)比较，dP＜0.05。

对照组模型组苦参素(40 mg/kg)苦参素(80 mg/kg)苦参素(160 mg/kg)F值P值0.0±0.04.5±0.5a 2.5±0.5b 1.5±0.5bc
1±0.5bcd 58.65＜0.0599999
表4 不同浓度苦参素对急性肝损伤小鼠肝组织MDA含量及CAT、GPx和SOD 活性的影响±s)注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与苦参素(40 mg/kg)比较，CP＜0.05；与苦参素(80 mg/kg)比较，dP＜0.05。

对照组模型组苦参素(40 mg/kg)苦参素(80 mg/kg)苦参素(160 mg/kg)F值P值99999 L)10±446±11a 31±8b 25±7bc 18±5bcd 2.96250±35123±16a 154±21b 178±25bc 198±34bcd 3.78＜0.05109±1846±7a 65±9b 86±11bc 96±13bcd 7.15＜0.0555±911±3a 18±5b 26±7bc 34±8bcd 3.09＜0.05
2.3 苦参素对急性肝损伤小鼠氧化应激酶的影响与对照组比较，模型组MDA含量明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，而CAT、GPx和SOD活性明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

与模型组比较，不同浓度的苦参素预处理均能减少MDA含量，增加CAT、GPx和SOD活性，并且呈现浓度依赖性关系，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

2.4 苦参素对急性肝损伤小鼠炎症反应的影响 ELISA和RT-PCR检测结果显示，与对照组比较，模型组TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平明显增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

与模型组比较，不同浓度的苦参素预处理均能减少TNF-α、IL-6
和IL-1β表达水平，并且呈现浓度依赖性关系，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表5和表6。

表5 不同浓度苦参素对急性肝损伤小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β 表达水平
的影响(±s)注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与苦参素(40 mg/kg)比较，CP＜0.05；与苦参素(80 mg/kg)比较，dP＜0.05。

对照组模
型组苦参素(40 mg/kg)苦参素(80 mg/kg)苦参素(160 mg/kg)F值P值99999 mL)110±151300±120a 850±75b 700±60bc 550±50bcd
52.17100±10750±100a 500±75b 350±50bc 200±40bcd 36.77＜0.05
mL)105±10350±60a 265±45b 186±35bc 145±25bcd 28.16
表6 不同浓度苦参素对急性肝损伤小鼠肝脏TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平的影响±s)注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与苦参素(40 mg/kg)比较，CP＜0.05；与苦参素(80 mg/kg)比较，dP＜0.05。

对照组模
型组苦参素(40 mg/kg)苦参素(80 mg/kg)苦参素(160 mg/kg)F值P值
99999(Fold)1.0±0.513.0±2.0a 10±1.7b 8±1.5bc 5.5±1.2bcd
1.0±0.27.5±1.5a 5.5±1.2b 4.3±0.9bc 3.6±0.5bcd 3.54＜
0.05(Fold)0.9±0.14.5±0.7a 3.3±0.5b 2.7±0.4bc 1.5±0.3bcd
3 讨论
CCl4诱导急性肝损伤是经典的构建动物化学性肝损伤的模型[4-5]。

该模型诱发的动物临床症状与病毒性肝炎引发的临床症状极其类似，因此目前被广泛应用于保肝药物的筛查。

当四氯化碳进入小鼠等动物体内后，可经p450等酶作用，生成三氯甲基等自由基。

而生成的自由基可破坏肝细胞膜上的脂肪酸等，引发脂质过氧化反应和胞膜通透性的急剧改变，进而导致ALT、AST和ALP等释放入血，因此血清
中ALT、AST和ALP表达高低可直接反映肝脏受损的程度[4-5]。

而肝脏发生中毒、坏死、炎症等损害时可引起血清中TBIL的升高以及肝脏病理损伤的加重，因此血
清中TBIL表达的高低以及肝脏病理损伤的程度可间接反映肝脏受损的程度。

本研
究结果显示CCl4建模后24 h，模型组小鼠血清中ALT、AST、ALP和TBIL的表
达水平均明显增高，并伴有肝脏病理损伤的明显加重，提示小鼠药物性急性肝损伤模型构建成功[4-5]。

而苦参素预处理可呈浓度依赖性降低小鼠血清中ALT、AST、ALP和TBIL的表达水平以及肝脏病理损伤程度，表明苦参素对CCl4诱导的急性
肝损伤具有保护作用，且呈浓度依赖性。

肝细胞受损是CCl4致急性肝损伤的病理基础[5-6]。

肝细胞受损后可引发脂质过氧化反应，致使促氧化应激酶MDA的大量产生，而大量产生的MDA可攻击肝细胞膜，导致细胞膜通透性的改变，继而引起肝细胞大量肿胀变性、坏死等[5]。

因此MDA的含量可直接反映肝脏脂质过氧化的程度，并可间接反映肝细胞受损的程度。

CAT、GPx和SOD是体内重要的内源性的抗氧化应激酶，可转化自由基为过氧化氢，因而可减少自由基攻击胞膜上的不饱和脂肪酸，减少脂质过氧化反应的发生，从而可保护肝细胞膜，进而可减轻肝细胞肿胀、坏死等。

因此CAT、GPx和SOD 活性的高低可反映机体清除自由基的能力以及抗氧化应激活性的高低[5-6]。

研究
结果显示苦参素可呈浓度依赖性增高肝脏CAT、GPx和SOD活性，降低MDA的含量。

提示苦参素可通过增强肝脏抗氧化应激酶的活性以及增强清除自由基的能力，进而可抑制脂质过氧化反应和减少脂质过氧化反应主产物MDA的生成，从而可减轻CCl4所致的氧化应激损伤，达到保护肝脏的目的。

在CCl4所致急性肝损伤中，Kuffer细胞和免疫细胞可被大量激活，导致TNF-α、IL-6和IL-1β等多种促炎症细胞因子大量释放，进而引起炎症级联反应，致使肝
脏受损[7-8]。

TNF-α能刺激肝脏产生自由基一氧化氮(NO)，而NO能诱导脂质过氧化产物MDA的大量生成，从而损害肝脏。

而IL-6和IL-1β是主要的促炎细胞
因子，是炎症级联反应激活的一个重要标志，可导致炎症效应不断放大，加重肝脏损伤[9]。

本研究结果显示模型组TNF-α、IL-6和IL-1β表达明显增高，苦参素能
呈浓度依赖性降低TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平。

提示苦参素可通过抑制炎症
反应减轻肝脏损伤。

综上所述，苦参素对四氯化碳所致急性肝损伤有保护作用，其作用机制主要与增强抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化和抗炎作用有关，但具体作用机制尚需进一步研究。

参考文献
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