酶标仪干试剂法测定钾离子的探讨

酶标仪干试剂法测定钾离子的探讨
目前临床上对血清钾测定的主要方法是离子选择电极法和酶法。

酶标仪ＩＳＥ法测定钾离子的影响因素很多，或多或少影响钾离子的测定结果。

近年报道的酶法测定钾离子，评价甚好。

手工比色测定操作繁琐，效率较低。

为此，现对蛋白水解酶法进行试剂配方的改良，采用酶标板比浊法测定钾离子，并对该方法进行初步评价，报道如下。

资料与方法
１．仪器与器材
ＭＲ－全自动酶标仪，吸
光度测定范围为０．０００～２．５００。

全自动生化分析仪ＶＩＴＲＯ２５０及其钾试剂干片（美国强生公司）。

２．试剂
测定试剂盒进行配制。

试剂Ｒ１与试剂Ｒ２为公司提供，测定比例为１０．０ｍＬＲ１中加入２．０ｍＬＲ２。

同时在Ｒ１、Ｒ２试剂组合中加入赋形剂（如甘露醇、聚乙二醇、木糖醇等）组成改良试剂，测定试剂为１０．０ｍＬＲ１、２．０ｍＬＲ２、赋形剂。

３．方法
１）酶标板的预处理：将首次使用的酶标板用浓盐酸浸泡过夜，去离子水冲洗后再用超声清洗，最后用去离子水反复漂洗，干燥备用。

２）干试剂酶标板的制备：酶标板每孔加入３００μＬ测定试剂，置于低温冰箱过夜，将预冻好的试剂放入冻干机中抽干。

将干燥好试剂的酶标板用塑胶密封。

３）标准品制备：通过全自动生化分析仪ＶＩＴＲＯ２５０进行检测，自行配置的钾离子标准液浓度分别为２．４、３．２、４．４、５．１、６．２、８．４ｍｍｏｌ／Ｌ，并绘制标准曲线。

４）检测方法：用可调定量加液器加入２．０ｍＬ去离子水于试管内。

血清按常规电解质采集离心后得到，用微量定量加样器吸取被测血清１００μＬ加入上述试管中，混匀静置３ｍｉｎ。

取干燥好试剂的酶标板一块，从上述溶液中吸取试剂３００μＬ到板孔内。

设置空白孔和标准孔，空白孔加入３００μＬ空白试剂，标准孔加入３００μＬ不同浓度的标准品。

振荡混匀，将酶标板放入全自动酶标仪中，用６３０ｎｍ检测，打印检测报告。

５）重复试验：分别对２．６、３．２、３．７、４．６、４．７、５．９ｍｍｏｌ／Ｌ６种浓度的钾离子标本进行批内检测（每批测定６次）。

６）方法学比较：收集６例临床标本，采集后取血清用低温保存，然后分别用酶标仪干试剂法、全自动生化分析仪ＶＩＴＲＯ２５０检测这些样品。

结果
１．赋形剂选择
本试验考虑到试剂Ｒ１、Ｒ２混合冻干后冻干试剂的外观和溶解性，这时考虑加入盐类赋形剂，如甘
露醇、聚乙二醇、木糖醇等。

按照一定的比例再次冻干后，Ｒ１、Ｒ２与甘露醇的组合冻干后易潮解，灵敏度不高，Ｒ１、Ｒ２与聚乙二醇组合试剂不能溶解，浊度很大，不适合冻干，而木糖醇外观呈白色结晶状粉末，对酸、热稳定，储存性能良好，易溶于水，不易受潮，常作为试剂的辅料，最后经测定决定采用Ｒ１＋Ｒ２＋木糖醇的组合。

２．赋形剂用量的选择
配制木糖醇含量分别为０．１、０．２、０．３、０．４ｇ的酶试剂（试剂中其他成分不变），分别用于测定不同浓度的钾离子标本，结果表明当木糖醇含量为０．２ｇ时，钾离子的标本在５ｍｉｎ内吸光度变化与浓度变化呈线性关系且有较高的吸光度。

所以改良试剂比例为１０ｍＬＲ１＋２ｍＬＲ２＋０．２ｇ木糖醇。

３．线性范围
将钾离子的标准品分别用本法、全自动生化分析仪ＶＩＴＲＯ２５０测定，得到回归方程Ｙ＝０．１５１Ｘ－０．２５２２，相关系数ｒ２＝0.9878，见图１。

４．重复试验结果
酶标仪干试剂法测定钾离子浓度，重复实验中，标准差（Ｓ）在０．０１～０．０３之间，变异系数（ＣＶ）在２．６６％～４．６２％之间。

5．方法对比试验
选６例不同钾离子含量的标本（范围在２．７～５．４ｍｍｏｌ／Ｌ），用本法（Ｘ）和全自动生化分析仪ＶＩＴＲＯ２５０（Ｙ）测定，按ＮＣＣＬＳ评价方案的《ＥＰ９－Ａ》文件作方法比较，结果：Ｙ＝１．０３２３Ｘ，ｒ＝０．９４５６。

讨论
酶标仪的基本工作原理、主要结构和一般的分光光度计几乎完全相同，因此，用酶标仪进行钾离子测定是可行的，尤其是对大批单项钾离子的测定。

本研究在酶标仪工作原理的基础上，充分利用酶标板板条，将蛋白水解酶法的改良试剂干燥在板孔内，封存备用。

最后采用的改良试剂为１０ｍＬＲ１＋２ｍＬＲ２＋０．２ｇ木糖醇，采用这种试剂和试剂比例既保证了试剂的溶解性，又保证了冻干后试剂外观，且不容易潮解，从图１中也可以看出有较好的性。

同时将改良试剂组的试剂预先干燥好，测定时即拆即用，省去了携带及临时添加液体试剂的麻烦，使步骤变得更为简单。

本研究结果显示，在２．４～８．４ｍｍｏｌ／Ｌ浓度范围内测定有良好的线性关系，完全可以满足普通临床标本检测的要求。

而对于两种检测方法的一致性，酶标仪干试剂法与全自动生化分析仪ＶＩＴＲＯ２５０比较，有较好相关性（ｒ＝０．９４５６）。

用酶标仪干试剂进行测定，这种方法既简便又比较准确，非常适用于单项钾离子的批量快速检测。

酶标仪干试剂法测定钾离子浓度无须添加试剂，加样后反应快而且稳定，当然，该方法用于临床标本的测定尚存在干扰因素，进一步探讨应用过程出现的问题及对策将有助于该方法广泛应用。