实验技能大赛-氨基酸纸层析法

氨基酸纸层析法
一、实验目的
1．学习并了解分配层析的原理；
2．掌握纸层析法分离氨基酸的原理和步骤；
3．掌握纸层析法分离氨基酸以鉴定氨基酸的方法。

二、实验原理
（一）纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。

纸层析法是用滤纸为支持物进行层析的方法，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成。

层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。

滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。

层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。

溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。

将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层。

随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数K不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。

溶质在滤纸上的移动速率以Rf值表示：
Rf 原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。

只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断。

（二）样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。

为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法。

（三）氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用。

三、药品器材
（一）实验器材
滤纸、烧杯10ml(×1)、剪刀、层析缸（×2）、微量注射器10(×1)或毛细血管、电吹风（×1）、铅笔、棉线
（二）实验药品
1．氨基酸
混合氨基酸溶液（蛋清或血清水解后的氨基酸干粉）、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、组
氨酸、半胱氨酸溶液6mg/ml
2．溶剂系统
碱相溶剂：V[正丁醇（A.R.）]:V(12％氨水):V(95％乙醇)=13:3:3。

酸性溶剂：V[正丁醇（A.R.）]:V(80％甲酸):V(水)=15:3:2。

3．显色贮备液:V(0.4mol/茚三酮-异丙醇):V(甲酸):V(水)=20:1:5。

4．V(0.1％硫酸铜:V(75％乙醇)=2:38溶液，现配现用。

四、实验方法
1．滤纸准备：滤纸，裁成28cm×28cm的正方形，在距纸一端2cm处用铅笔轻轻划一基线，在线上每隔3cm，画一小点样的原点。

如图1。

2．点样：用毛细管或微量注射器吸取少量氨基酸样品点于原点(分批点完)，用吹风机稍加吹干后再点下一次，重复3次，点子直径不能超过0.5cm。

3．展层：将点好样的滤纸，用白线缝好，制成圆筒，原点在下端，浸立在培养皿内，不需平衡，立即展层。

展层剂为酸性溶剂系统[V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15:3:2]，把展层剂混匀，倒入培养皿内，同时加入显色贮备液(每10ml展层剂加0.1-0.5ml的显色贮备液)进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿1-2cm时，如图2。

4．显色：展层毕，取出滤纸，用热风吹干，蓝紫色斑点即显现。

5．结果：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的Rf 值，与标准氨基酸的Rf 值对照，确定混合物中含有哪些氨基酸。

图1 点样及层析谱图2 纸层析装置
（1原点，2层析点，3溶剂前沿）（1层析纸，2平衡溶液，3培养皿）
五、实验结果
六、注意事项
1．在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。

取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；如条件许可，也可戴上一次性手套拿滤纸。

要将滤纸平放在洁净的滤纸上，不可放在实验台上，
以防止污染。

2．在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。

3．在滤纸的一端用点样器点上样品，点样点(原点)要高于培养皿中扩展剂液面约1cm。

由于各氨基酸在流动相(有机溶剂)和固定相(滤纸吸附的水)的分配系数不同，当扩展剂从滤纸一端向另一端展开时，对样品中各组分进行了连续的抽提，从而使混合物中的各组分分离。

4．点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。

5．作为展层剂的正丁醇要重新蒸馏，甲酸须用分析纯的。

且展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。

6．展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。

7．展层剂接触滤纸时一定要均匀、保持前沿线与滤纸平行。

8．吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。

9．展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。

10．如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的R f值十分接近时，单向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系统展层。

滤纸取出干燥后，再将滤纸转90度角，用另一溶剂系统展层。

所得图谱分别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定。

七、思考题
1.纸层析法的原理是什么？
答：纸层析法又称纸色谱法。

以纸为载体的色谱法。

固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。

将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。

当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。

将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。

根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。

用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。

在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析。

2.何谓Rf值？影响Rf值的主要因素和注意事项？
答：Rf 原点到层析斑点中心的距离
原点到溶剂前沿的距离。

Rf值是指溶质在滤纸上的移动速率。

影响Rf值的主要因素是溶质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素。

只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，溶质的Rf值是常数。