牛奶中抗生素残留的检测方法

doi:10.19369/j. cnki. 2095 — 9737.2021.04.043
牛奶中抗生素残留的检测方法
范松阳
(黑龙江省地质矿产实验测试研究中心，黑龙江哈尔滨150000)
摘要：牛奶等乳制品中如果残留抗生素既会导致品质变差，严重时还会对发酵乳制品的生产造成影响，使其产量降低，并导致后期产品风味变差，损害生产者的经济效益，同时人们摄入后会 严重危害健康，如导致人体发生过敏反应（过敏性休克、皮疹等），使肠道中有益菌的生长被抑制，而致病菌、念珠菌等大量增殖，引起局部或者全身感染，还会使人体对抗生素形成抗药性，明显加大临床治疗难度。

现概述奶牛中抗生素残留的检测方法，供参考。

关键词：牛奶；抗生素残留；检测方法
中图分类号：T S252. 7 文献标识码：B文章编号2095—9737(2021)04 —0074 —02
1理化检测法
1.1检测原理
该法主要是根据抗生素分子的性质，使用相 关实验仪器对其进行分离检测。

分离时常用的实 验技术为电泳检测或者色谱检测等，检测时常用 的实验技术为紫外检测、化学发光检测、荧光检测 或者质谱检测等。

1.2优缺点
该法具有精确可靠、重复性好、检测灵敏、分 离效率高、结果稳定的特点，属于检测抗生素残留 的一种精确方法。

2微生物检测法
该法是检测牛奶抗生素残留时应用比较广泛 的经典方法，主要有氯化三苯基四氮唑法（T TC 法）、纸片法、管蝶法以及试剂盒法等。

2.1检测原理
主要是根据抗生素对微生物的机能、生理代 谢产生的抑制作用来对样品中残留抗微生物药物 进行定性。

2.2优缺点
这种检测方法具有费用低、操作简单、结果可 靠、不需使用高级实验设备的优点，可应用于普通 养殖场及实验室。

但由于需要进行微生物培养，因此有相对较长的检测时间，无法实现定量检测，不可检测出某些抗生素的最低限。

2.3常用方法
2.3. 1T TC 法
将9m L灭菌脱脂乳中接种提前制备好的嗜热链球菌菌种，放人3 6±1C恒温培养箱中经过15 h活化，然后对脱脂乳按1 〇 1比例进行稀释制 成测试菌液。

取9m L牛奶样品液装人试管（15 mm X 150 mm)中，放人80°C水浴中经过5m in加热处 理，待其温度降低至37C以下后，添加1制备 的测试菌液后，旋转试管使其混合均勻，再次放人 36±1°C恒温水浴锅进行2 h水浴，接着添加0.3 m L T T C指示剂，振动试管使其混合均勻，然 后再置于36 ±1C水浴中进行30 m in的避光培 养。

要求每份牛奶样品液必须做两个平行样，同时还要做1份阳性对照和1份阴性对照。

将牛奶样品液取出后对其颜色变化进行观察，如果牛奶样品液颜色没有变化，即判定呈阳性;如果由原乳白色变成红色，即判定呈阴性；如 果变成微红色，可充分放人36±1C恒温水浴锅中 进行30 m in的避光培养，然后作出最终判定。

2.3. 2 嗜热链球菌纸片分析法（P D法）
先制备成嗜热链球菌测试培养基，即用无菌 吸管取0. 5m L嗜热链球菌测试菌悬液在乳酸菌培养基中涂布接种即可。

取浸染抗生素标准液的纸碟放在含有嗜热链 球菌测试培养基中接种，注意均勻分布，且每个平 板中要放置2个纸碟，置于36±1°C下进行48 h培
收稿日期2021—02 —01
作者简介：范松阳（989 —）男，吉林梅河口人，本科，助理工程师，主要从事食品、乳品、水类等检验检测工作。

养，选择出现抑菌圈的平板作为阳性对照平板。

同时，取浸染灭菌生鲜乳在抑菌平板中均勻放置，要求每个平板中也放有2个纸碟，置于36±1°C下进行38h培养，选择没有出现抑菌圈的平板作为 阴性对照平板。

用镊子取出已经浸染待测牛奶样品的纸碟，尽量浸染均勻，接着在每个嗜热链球菌测试培养 基中放置3个纸片，尽可能纸片均勻放置，放人 36±1°C恒温培养箱中进行48h培养，对抑菌情况 进行观察。

注意每个牛奶样品液需要做两个平行样。

取出含牛奶样品液的测试培养基分别与阴 性、阳性对照平板进行比较。

如果牛奶样品液纸 碟四周出现抑菌圈，则判定为阳性，即残留有抗生 素；如果没有出现抑菌圈，则判定为隐性，即没有 残留抗生素。

3酶联免疫吸附法（ELISA)
3.1检测原理
E L IS A法是通过固定的抗原或者抗体的特异 性捕捉使待测目标物在固相支持物表面上结合，接着用其与酶标记的抗原或者抗体进行反应，在液相反应中利用酶催化底物显色来实现对待测目 标物的含量进行测定。

碱性磷酸酶和辣根过氧化 物酶是最常用的标记酶。

3,优缺点
目前，尽管E L IS A法是研究较多的筛选检测 抗生素的方法，具有无需复杂的样品前处理、检测 量大、灵敏度高等优点，但也存在一些缺点，如由 于其载体的材质和包被技术存在一定局限性，需要在包被载体孔内（通常是96孔酶标板）添加大 剂量的抗体或者抗原，这样才可确保包被效果良 好；同时，对显色时间要求较高，只可对结果进行 一次性判读等。

3.3操作步骤
在无菌条件下，取3000 g牛奶待检样品，在10C下进行10m in离心，以将上层脂肪除去；取1mL处理后的牛奶样品加人聚苯乙烯离心管 (15mL)中，按一定比例添加复溶工作液进行稀 释。

在1份空白样品中先添加对应浓度的标准溶 液，再在每孔中添加100 %L酶标二抗，轻轻震荡 使其混合均勻，用盖板膜包好后放在37C条件下 进行30 m in的避光反应，然后取出进行重复 洗板。

根据E L IS A试剂盒都需要在37C条件下进 行反应，因此操作前必须使其温度达到所需要的 温度。

将所需数量的试剂盒取出后，先在室温环 境中放置30min，接着对样品与标准品对应的微 量孔按顺序进行编号，要求每个样品和标准品都 设有2孔平行样，还要详细记录样品孔和标准孔 所在的位置。

在试剂盒中间位置，每孔添加50 %L标准品，其他孔添加经过处理的牛奶样品，注意每添加一 个标准品或者样品都要求更换一个新的吸头；然后在每孔中添加50 %L抗体，注意吸头要悬空加 人，禁止靠于板孔壁上，避免出现交叉污染。

另外，吸取样品时，要确保准确性，不允许漏加、少加 结。

添加标准品、样品以及抗体后，放上盖板置于 37C避光环境中进行一段时间的反应。

取出后每 孔添加50 %L底物液，再在每孔中添加50 %L底物液B液，通过轻轻震荡使其混合均勻，用盖板膜 包好后放在37C条件下进行15m in的避光反应。

最后在每孔添加50 %L终止液，轻轻震荡使其混 合均勻，设定酶标仪于350 n m处，对每孔0D值 进行测定，据此计算抗生素残留量。