人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析(精)

人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析
[ 10-09-11 16:53:00 ] 编辑：studa20
作者：刘岩张德宝杨华
孙大辉
【摘要】目的建立阿霉素(DXR)诱导的人成骨肉瘤MG63多药耐药细胞株亚系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100并观察其生物学特性。

方法以DXR 为诱导剂，采用逐步增加剂量的方法诱导MG63细胞，建立多药耐药细胞株亚系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100;MTT法检测药物敏感性;光镜、透射电镜观察细胞形态及超微结构变化，绘制细胞生长曲线;流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数。

结果 (1)经DXR 6个月的诱导建立了MG63/DXR细胞株亚系。

(2)MG63/DXR对DXR的耐药指数为 76.87，对长春新碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺亦产生不同程度的交叉耐药。

(3)光镜观察可见：MG63细胞排列规则，形态呈梭形，大小一致;MG63/DXR细胞株亚系排列不规则，大小不均，形态呈三角形、多角形及多核现象。

透射电镜显示：MG63细胞膜平滑，粗面内质网较丰富;MG63/DXR细胞株亚系细胞表面突起增加，粗面内质网丰富，胞质内可见髓样小体、溶酶体及大量糖原池。

(4)MG63细胞与其多药耐药细胞株亚系
MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞生长曲线相近。

(5)细胞周期分析显示MG63、MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞G0/G1期分别为
86.34%、83.67%、78.11%、68.81%;G2/M期分别为5.92%、7.45%、7.78%、10.90% ;S期分别为 7.74%、8.87%、14.11%、20.30%;而MG63/DXR与MG63细胞的凋亡指数无显著差异。

结论 (1)小剂量DXR为诱导剂建立了人骨肉瘤多药耐药细胞株亚系(MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100)，MG63/DXR、
MG63/DXR细胞对于甲氨蝶呤、长春新碱、环磷酰胺产生不同程度交叉耐药。

(2)MG63/DXR细胞株亚系细胞形态、超微结构、细胞周期分布与母系细胞MG63有显著差异，凋亡指数无显著差异。

(3)MG63/DXR耐药细胞的存在及其分裂、增殖可能是导致骨肉瘤化疗失败和肿瘤局部复发的原因之一。

【关键词】骨肉瘤;阿霉素;多药耐药;细胞周期
骨肉瘤是一种好发于长骨干骺端的恶性肿瘤。

Rosen〔1〕提出新辅助化疗(neoadjuvant chemoherpy)的广泛应用，使骨肉瘤的5年生存率已达60%以上，但恶性肿瘤化疗后多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象仍是影响肿瘤患者化疗疗效和预后的主要因素之一。

本研究以人成骨肉瘤细胞株MG63为诱导对象，分析其生物学特性。

1 材料与方法
1.1 材料人骨肉瘤细胞株MG63购自上海中国科学院细胞库。

阿霉素(DXR，汕头明治医药有限公司)、DMEM(Gibco)、小牛血清(Calf
Serum)(Gibco)、胰蛋白酶(Promega)、EDTA(Promega)、二甲基亚砜
(DMSO)(Sigma)。

CO2孵箱(SANYO MCO17AIC，日本)、超净工作台(YZ875)苏净集团安泰公司，倒置显微镜(OLYMPUS，日本)。

1.2 方法
1.2.1 主要溶液的配制 DMEM溶液：用950 ml去离子水溶解DMEM粉末
13.4 g，加入NaHCO3 3.7 g，HEPES 2.38 g，调pH至7.4，加入青霉素和链霉素，使最终使用浓度分别为100 U/ml和100 μg/ml，使用时加入胎牛血清至
终浓度为10%。

0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA：称取0.2 g EDTA，用去离子水溶解后，加入2.5 g胰蛋白酶，定容至1 000 ml。

1.2.2 MG63培养与传代 MG63骨肉瘤细胞在含有10%小牛血清的高糖DMEM 培养液(含青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml)中培养。

隔日换液1次。

约3 d长满后传代。

按1∶3～5传代，继续培养。

1.2.3 MG63多药耐药细胞株亚系的建立 DXR加药浓度的确定：取96孔板，每孔接种5×103个细胞，培养24 h后分别加入终浓度为0.1、0.4、
1.0、4.0、10.0、40.0、100.0 ng/ml的DXR。

继续培养48 h，观察细胞存活
情况，确定起始加药DXR终浓度为1.0 ng/ml。

传代后将细胞分成实验组和对
照组，实验组加入DXR终浓度1.0 ng/ml，24 h后换液，约3 d细胞长满传代。

对照组不加DXR，继续培养，约3 d传代。

实验组细胞稳定生长后，逐渐
加大DXR浓度，依次为4.0、10.0、40.0、100.0 ng/ml，每个浓度梯度持续1个月，细胞传代后稳定生长。

整个诱导过程6个月，传代48次。

将终浓度为10.0、40.0、100.0 ng/ml的细胞分别命名为MG63/DXR10、MG63/DXR40和
MG63/DXR100。

1.2.4 形态学观察采用荧光倒置相差显微镜观察并照相。

透射电镜观察对数生长期的MG63和MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞。

1.2.5 细胞生长测定将对数生长期的MG63和MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞以1×104/ml细胞浓度接种于96孔培养板各3板，培养24 h 后分别加入含长春新碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺的培养液 (药物初始浓度分别长春新碱0.003 μg/ml;氨甲蝶呤0.012 5 μg/ml;环磷酰胺0.15 μg/ml)，每
种浓度设3个复孔，定为药物组;设以培养液换液的剩余3孔为对照组，继续培养48 h，加入5 mg/ml的MTT 20 μl,用酶标仪(λ=570 nm)测定每孔A值(A
值与活细胞数成正比)，取其平均值，计算不同浓度的药物对肿瘤细胞的抑制率=(1-药物组A值/对照组A值)×100%。

采用对数计量直线回归法计算出各种药物对细胞达50%抑制率时的药物浓度(IC50，单位μg/ml)，并计算耐药指数(RI)=IC50耐药细胞/IC50亲代细胞。

将对数生长期的MG63和MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞以浓度1×104/ml分别接种于96孔培养板，每组设3个复孔，24 h后每天以MTT法测定每组OD值，连续7 d，绘制生长曲线。

1.2.6 细胞周期及凋亡指数测定分别收集耐药诱导期间同步传代的MG63
和MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞(1×107/ml),70%乙醇固定，采
用10 mg/L溴化乙锭(EB)一步法插入DNA定量染色，流式细胞仪检测细胞周期，用Muticycle AV分析软件分析直方图分别得到G0/G1、G2/M、S期百分比及凋亡百分比。

以增殖指数(PI)=(S+G2/M)÷(G0/G1+S+G2/M)×100%表示细胞增殖能力，以凋亡指数(AI)表示凋亡百分率。

1.3 统计学分析计数资料组间比较采用χ2检验，用SPSS10.0 统计软件计算。